雌激素、促性腺激素与大鼠成骨细胞雌激素受体β的表达

目的:观察不同剂量雌激素,卵泡雌激素及黄体生成素对大鼠成骨细胞雌激素受体β表达的影响。方法:实验于2004-02/08在哈尔滨医科大学第二临床医学院科研中心完成。①取三四个月龄雌性Wistar大鼠28只用于大鼠成骨细胞体外培养。采用二次酶消化、反复贴壁法分离纯化培养大鼠成骨细胞。观察其形态、改良钙钴法碱性磷酸酶染色,培养上清碱性磷酸酶、骨钙素测定来鉴定成骨细胞。②取2代培养的成骨细胞用无血清培养基培养24h,分为10组:对照组,1×10-10,1×10-8,1×10-6mol/L17β-雌二醇组,10,100,1000U/L黄体生成素组,1×10-7,1×10-6,1×10-5g/L卵泡刺激素组。每组3个孔。对照组加入基础培养基,其他各组分别加入相应终浓度药物,培养24～48h。大鼠成骨细胞雌激素受体表达阳性细胞数检测应用免疫组织化学法测定,以细胞浆有棕黄色颗粒沉积为阳性。成骨细胞雌激素受体β表达检测应用半定量免疫印渍酶促底物染色法以及化学发光法,以A值越高,说明雌激素受体β表达越多。结果:①成骨细胞形态及特征性鉴定:成骨细胞随培养时间的延长,细胞呈指数增长,分泌碱性磷酸酶和骨钙素,碱性磷酸酶染色阳性率为90%,表现出旺盛的分泌功能。②成骨细胞雌激素受体表达阳性细胞数检测结果:不同剂量卵泡刺激素组和黄体生成素组对雌激素受体表达无明显影响;雌激素1×10-8mol/L组和1×10-6mol/L组显著高于对照组[(90.95±5.89),(95.12±6.17),(81.44±5.37)个数/100个细胞,t=2.95,P<0.05;t=3.50,P<0.01]。③成骨细胞雌激素受体β表达结果:不同剂量卵泡刺激素及黄体生成素对雌激素受体β的表达无明显影响;随雌激素浓度的增加成骨细胞雌激素受体β表达呈上升趋势。结论:雌激素能促进成骨细胞雌激素受体β的表达,且表现出剂量依赖性。而黄体生成素、卵泡刺激素对雌激素受体β表达无直接影响。     

去势与非去势不同月龄雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体β的表达特点

目的：观察去势与非去势雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体β的表达水平，并比较其变化特点。方法：实验于2003—02／06在哈尔滨医科大学第二临床医学院科研中心完成。分别取新生，2，4，6，8，10，12个月龄的雌性Wistar大鼠各14只，按月龄分为6组，2，4，6，8，10，12个月龄组，各月龄组再随机分对照组，正常饲养不造模；去势组行卵巢切除造模，每组各7只。两个月后处死。①成骨细胞的生物学特征检测：取新生雌性Wistar大鼠14只用于大鼠成骨细胞体外培养。采用二次酶消化法、反复贴壁法分离纯化培养大鼠成骨细胞。采用倒置显微镜观察成骨细胞形态及超微结构。大鼠成骨细胞检验学特征碱性磷酸酶检测采用改良钙钴法，阳性反应为胞质中出现灰黑至深黑颗粒状或片状沉淀。成骨细胞培养上清液碱性磷酸酶及骨钙素检测，采用磷酸对硝基苯酯二钠盐比色法进行碱性磷酸酶检测，测得A值，换算成国际单位。采用放射免疫试剂盒进行骨钙素检测，计数器测定沉淀物cpm值，根据标准曲线得到样品中骨钙素含量。②成骨细胞内雌激素受体检测：应用半定量蛋白印迹酶促底物染色法以及发光法。测得A值，以A值越高，说明雌激素受体β表达越多。结果：纳入84只大鼠分为6组，均进入结果分析。①成骨细胞形态学观察：随着培养时间的延长，细胞伸出较多突起，细胞融合成片，培养12-18d呈多层生长。②大鼠成骨细胞碱性磷酸酶染色结果：镜下见90％的细胞呈碱性磷酸酶染色阳性。③成骨细胞培养上清液碱性磷酸酶及骨钙素含量：成骨细胞碱性磷酸酶和骨钙素明显高于成纤维细胞（P〈0．01）。④去势与非去势大鼠成骨细胞内雌激素受体β的表达结果：应用酶促低物染色法测定，非去势组雌激素受体β表达在2个月龄组呈低度表达（90．81．2．20），4，6个月组雌激素受体β开始呈现上升趋势（121．10&;#177;5．78，143．20&;#177;4．41）至8，10个月组雌激素受体β达到高峰（186．10&;#177;6．60，190．90&;#177;6．10），10月组以后表达呈现下降趋势；去势组2，4，6，8，10，12个月组雌激素受体β都呈低度表达（87．80&;#177;2．51，89．50&;#177;2．72，89．81&;#177;2．43，90．59&;#177;2．34,92．52&;#177;2．62，90．39&;#177;2．53），除2个月龄组以外，其他各月龄组非去势组均显著高于去势组（P〈0．05,0．01）。结论：①本实验采用酶消化法培养的细胞符合成骨细胞的生物学特征，具备成骨细胞功能。②去势大鼠在观察的不同时限点均出现成骨细胞雌激素受体β表达较同月龄非去势大鼠显著减少，说明去势影响成骨细胞内雌激素受体β的表达。     

葛根素体外影响小鼠胚胎长骨雌激素受体β表达的作用

目的：以体外培养小鼠胚胎长骨为靶器官，观察葛根素对骺板雌激素受体亚型雌激素受体β分布及含量的影响，并与内源雌激素比较，分析葛根素对骨可能的作用机制。方法：实验于2003-05／2004-05在中国人民武装警察部队医学院药物化学教研室药物活性筛选室进行。以小鼠胚胎长骨为靶器官，以雌二醇1&;#215;10^-6mol／L处理为阳性对照组，同时设空白对照组、葛根素干预组分为1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-4mol／L 3个浓度组。①小鼠怀孕16d时取出胚胎，剔除雌性胎鼠前肢肌肉和软组织，剥离出尺骨，做为实验靶器官置于BGJb培养基中，葛根素和雌二醇作用48h后，测量长骨总长和骨干长。每组培养长骨8根，重复3次。②长骨固定、脱钙后作石蜡切片，进行免疫组织化学染色，光镜下观察阳性细胞定位，图像分析系统下测定免疫反应阳性细胞数和阳性细胞面积。结果：雌性胎鼠长骨全部进入结果分析，无脱失。①长骨经葛根素和经雌二醇处理48h后，葛根素1&;#215;10^-4，1&;#215;10^-5mol／L组及阳性对照组骨总长及骨干长与空白对照组相比，差异有非常显著性意义[（3．97&;#177;0．12），（1．51&;#177;0．07）；（3．79&;#177;0．06），（1．40&;#177;0．03）；（4．05&;#177;0．1），（1．62&;#177;0．05）；（3．43&;#177;0．05，1．2&;#177;0．04）mm；P〈0．01]，葛根素10^-6mol／L组仅骨总长与空白对照组相比差异有显著性意义[（3．56&;#177;0．06）mm，P〈0．05]；葛根素1&;#215;10^-6mol／L的作用与阳性对照组差异无统计学意义（P〉0．05），1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-6moL／L组作用弱于阳性对照组（P〈0．01）。②空白对照组骺板静止区和肥大区雌激素受体β蛋白几乎不表达，仅增殖区有较弱表达。经葛根素和1&;#215;10^-6mol／L雌二醇作用后，增殖区表达明显增强，肥大区和静止区软骨细胞也都出现雌激素受体β蛋白的阳性表达。葛根素1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-4mol／L组阳性细胞数和阳性细胞面积均小于阳性对照组[29．8&;#177;2．9，43．5&;#177;5．1，63．3&;#177;5．8．833&;#177;6．9，（819．78&;#177;164．53）．（1175．76&;#177;188．73），（1585．15&;#177;198．93），（2036．12&;#177;384．23）μm^2，P〈0．01～0．05]，作用明显弱于雌二醇，并表现出剂量依赖的趋势。结论：葛根素在体外可促进软骨内成骨。同雌激素一样，葛根素也能够上调骺板雌激素受体β的表达。提示葛根素对软骨内成骨的促进作用可能与其上调雌激素受体β在骺板的表达有关。     

染料木黄酮不是通过雌激素受体促进成骨细胞增殖

目的：探讨染料木黄酮对成骨细胞活性的影响及其可能机制。为染料木黄酮防治骨质疏松提供理论依据。 方法：实验于2001—05／2003-01在卫生学环境医学研究所完成。无菌条件下用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分步消化乳鼠颅盖骨获得成骨细胞。传代后细胞用于实验。染料木黄酮组分别加入10^5 ～10^-7 mol／L染料木黄酮，对照组以吐温20为对照。分别用噻唑蓝比色法和^3H-胸腺嘧啶掺入法测定成骨细胞增殖和DNA合成。用反转录-聚合酶链式反应和Western blot测定雌激素受体mRNA和蛋白表达。 结果：①成骨细胞培养基中加入（10^-5～10^-6mol／L）染料木黄酮，培养48h和72h后噻唑蓝的吸光度值与对照组相比均明显升高[培养48h，（039&;#177;0．03），（0．45&;#177;0．03）,（0．46&;#177;0．02），（0．19&;#177;0．05）；培养72h：（0．29&;#177;0．04），（032&;#177;0．02），（0．37&;#177;0．02），（0.15&;#177;0．04）]。②染料木黄酮组^3H-胸腺嘧啶掺入量均显著增加[染料木黄酮组为（101．20&;#177;10．06），（844．60&;#177;366．90），（512．20&;#177;197．6）；对照组为（68．67&;#177;10．39）]未发现成骨细胞雌激素受体基因和蛋白表达。 结论：染料木黄酮不是通过促进雌激素受体基因和蛋白的表达来促进成骨细胞增殖。     

蛇床子素对成骨样细胞UMR106增殖和分化的影响

目的：以在某种程度上可反映成骨细胞增殖的成骨样细胞UMR106为靶细胞，考察蛇床子素对其细胞形态、增殖率和分化程度的影响。方法：实验于2003-03／2004—03，在中国人民武装警察部队医学院药物化学教研室药物活性筛选室进行。以大鼠成骨肉瘤细胞系UMR106为靶细胞，以雌二醇1&;#215;10^-8mol／L为阳性对照，同时设空白对照组，蛇床子素干预组分为1&;#215;10^-8mol／L，1&;#215;10^-7mol／L，1&;#215;10^-6mol／L3个浓度组。①调整细胞浓度为4&;#215;10^-7L^-1，接种于12孔培养板上。48h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。②调整细胞浓度为2&;#215;10^7L^-1，接种于96孔培养板，采用四唑盐法测定各孔的吸光度，计算平均增殖率。③调整细胞浓度为2&;#215;10^7L^-1，接种于24孔培养板，磷酸对硝基苯基质动力学法测定细胞内外碱性磷酸酶括性。上述实验每组均设8个复孔。结果：①培养基中加入蛇床子素培养48h后，与对照组相比UMR106细胞数量明显增多，核分裂期多见，1&;#215;10^-6mol／L，1&;#215;10^-7mol／L组可见细胞重叠生长，分泌基质堆积明显。②UMRl06细胞经蛇床子素处理48h后，相对于对照组，1&;#215;10^-6mol／L组增殖率为52％，1&;#215;10^-7mol／L组为37％，1&;#215;10^-8mol／L组为16％。3个给药组与对照组相比差异均有显著性（t=37．36，14．94，6．81，P〈0．01）。③UMR106细胞经蛇床子素1&;#215;10^-6mol／L和经雌二醇1&;#215;10^-8mol／L处理24h和48h后。细胞内碱性磷酸酶活性均显著高于对照组[（825．17&;#177;1234），（775．16&;#177;8．67），（715．14&;#177;14．17）μkat／g；（2415．48&;#177;15．84），（2355．47&;#177;5．67），（2285．49&;#177;7．67）μkat／g；t=16．56，10．22；20．89，34．90，P〈0．01]。④UMR106细胞在浓度为1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-7mol／L的蛇床子素及雌二醇10^-8mol／L培养24h后，细胞外碱性磷酸酶活性显著高于对照组[（781．66&;#177;50），（733．15&;#177;15．34），（728．81&;#177;9．84），（652．80&;#177;11．34）μkat／g；t=22．56，11．9，14.32,P〈0．01]。结论：蛇床子素可剂量依赖地促进UMR106细胞的增殖，刺激UMR106细胞的碱性磷酸酶活性，提示其可能具有直接促进成骨细胞增殖、分化的作用。     

去势与非去势不同月龄雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体β的表达特点

目的:观察去势与非去势雌性大鼠成骨细胞内雌激素受体β的表达水平,并比较其变化特点。方法:实验于2003-02/06在哈尔滨医科大学第二临床医学院科研中心完成。分别取新生,2,4,6,8,10,12个月龄的雌性Wistar大鼠各14只,按月龄分为6组,2,4,6,8,10,12个月龄组,各月龄组再随机分对照组,正常饲养不造模;去势组行卵巢切除造模,每组各7只。两个月后处死。①成骨细胞的生物学特征检测:取新生雌性Wistar大鼠14只用于大鼠成骨细胞体外培养。采用二次酶消化法、反复贴壁法分离纯化培养大鼠成骨细胞。采用倒置显微镜观察成骨细胞形态及超微结构。大鼠成骨细胞检验学特征碱性磷酸酶检测采用改良钙钴法,阳性反应为胞质中出现灰黑至深黑颗粒状或片状沉淀。成骨细胞培养上清液碱性磷酸酶及骨钙素检测,采用磷酸对硝基苯酯二钠盐比色法进行碱性磷酸酶检测,测得A值,换算成国际单位。采用放射免疫试剂盒进行骨钙素检测,计数器测定沉淀物cpm值,根据标准曲线得到样品中骨钙素含量。②成骨细胞内雌激素受体检测:应用半定量蛋白印迹酶促底物染色法以及发光法。测得A值,以A值越高,说明雌激素受体β表达越多。结果:纳入84只大鼠分为6组,均进入结果分析。①成骨细胞形态学观察:随着培养时间的延长,细胞伸出较多突起,细胞融合成片,培养12～18d呈多层生长。②大鼠成骨细胞碱性磷酸酶染色结果:镜下见90%的细胞呈碱性磷酸酶染色阳性。③成骨细胞培养上清液碱性磷酸酶及骨钙素含量:成骨细胞碱性磷酸酶和骨钙素明显高于成纤维细胞(P<0.01)。④去势与非去势大鼠成骨细胞内雌激素受体β的表达结果:应用酶促低物染色法测定,非去势组雌激素受体β表达在2个月龄组呈低度表达(90.81±2.20),4,6个月组雌激素受体β开始呈现上升趋势(121.10±5.78,143.20±4.41)至8,10个月组雌激素受体β达到高峰(186.10±6.60,190.90±6.10),10月组以后表达呈现下降趋势;去势组2,4,6,8,10,12个月组雌激素受体β都呈低度表达(87.80±2.51,89.50±2.72,89.81±2.43,90.59±2.34,92.52±2.62,90.39±2.53),除2个月龄组以外,其他各月龄组非去势组均显著高于去势组(P<0.05,0.01)。结论:①本实验采用酶消化法培养的细胞符合成骨细胞的生物学特征,具备成骨细胞功能。②去势大鼠在观察的不同时限点均出现成骨细胞雌激素受体β表达较同月龄非去势大鼠显著减少,说明去势影响成骨细胞内雌激素受体β的表达。     

大鼠腹膜间皮细胞CD40表达与阿托伐他汀的干预效应

目的：探讨阿托伐他汀对大鼠腹膜间皮细胞CD40表达的影响。方法：实验于2004-06／2005-03在南京大学生命科学院实验室完成。分离、培养大鼠腹膜间皮细胞，于不含血清的F12培养基中分别加入不同浓度的阿托伐他汀，即2．5％腹透液加入1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-4，0mol／L阿托伐他汀，其中0mol／L阿托伐他汀为对照组，刺激腹膜间皮细胞，通过反转录-聚合酶链反应检测腹膜间皮细胞的CD40mRNA的表达。结果：①培养的大鼠腹膜间皮细胞呈多边形、菱形、椭圆形，大小不等。细胞融合后，呈典型的鹅卵石状上皮细胞形态。传代后用抗大鼠角蛋白和抗Ⅷ因子抗体检测相关抗原，结果抗角蛋白阳性，抗Ⅷ因子相关抗原阴性。②加入1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6，1&;#215;10^-5，1&;#215;10^-4mol／L阿托伐他汀后腹膜间皮细胞的CD40mRNA表达量明显低于对照组（分别为0．247&;#177;0．084，0．180&;#177;0．060，0．106&;#177;0．052，0．025&;#177;0．023，0．319&;#177;0．101，P〈0．05）。结论：阿托伐他汀对腹膜间皮细胞细胞CD40的表达有显著的抑制作用。     

大鼠延髓内雌激素β受体表达变化对延髓神经元结构和功能的影响

目的：研究三羟基异黄酮与17-β雌二醇对大鼠延髓雌激素β受体表达的影响，探讨雌激素作用神经系统的机制。方法：30只去卵巢SD大鼠，随机分为去卵巢组(A组)、雌二醇组(B组)和三羟基异黄酮组(C组)，手术后10d起分别皮下注射生理盐水0．1mL／d,17-β雌二醇20μg／(kg&;#183;d)、三羟基异黄酮200μg／(kg&;#183;d)；10只假手术组(D组)大鼠，只切开腹膜不切除卵巢，手术后10d起每只动物皮下注射生理盐水0．1mL／d。各组动物连续用药6周后观察结果。结果：①血清雌二醇的浓度：A组(9.44&;#177;6．04)ng／L和C组(7．03&;#177;5．65)ng／L显著低于D组(19．4&;#177;8．37)ng／L，差异有非常显著性意义(t=2.97。3.77，P&;lt;0.01)，B组(15．52&;#177;8.54)ng／L与A组比较显著升高(t=2．74，P&;lt;0.01)，而与D组比较差异无显著性意义。②A组与D组比较大鼠延髓ER-β免疫阳性细胞数量下降、阳性细胞总面积和平均吸光度降低(P&;lt;0．01)。切除卵巢后补充17-β雌二醇和三羟基异黄酮的大鼠延髓雌激素β受体表达明显增加，与A组比较延髓雌激素β受体免疫阳性细胞数量增加、阳性细胞总面积和平均吸光度升高(P&;lt;0．01)，而与D组比较无统计学意义。结论：三羟基异黄酮和17-β雌二醇对延髓ER-β的表达有明显的调节作用，可能通过这一途径影响着延髓神经元的结构和功能。     

雌激素对去卵巢大鼠成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1基因表达的影响

目的：通过观察雌激素对去卵巢骨质疏松模型大鼠成骨细胞膜型基质金属蛋白酶(membrane-type matrix metaUoproteinase-1，MT1-MMP)基因的表达，探讨雌激素防治骨质疏松症的机制。方法：选用7个月龄雌性SD大鼠36只，对去卵巢大鼠、对照假手术大鼠与17β-雌二醇(E2)治疗组大鼠进行骨密度检测。股骨远端行原位杂交检测骨组织MT1-MMP mRNA表达，免疫组化检测骨组织MT1-MMP蛋白质表达。结果：与对照组[(L3=0．156&;#177;0．010)g／cm^2]相比，去卵巢大鼠骨密度[(L3=0．139&;#177;0．009)g／cm^2]减少，予E2治疗后骨密度[(L3=0．168&;#177;0．010)g／cm^2]增加(t=0．03～0．04，P&;lt;0．05)。与对照组相比，去卵巢大鼠成骨细胞MT1-MMP mRNA与蛋白质表达下调，而予E2治疗后成骨细胞MT1-MMP mRNA与蛋白质表达增加。结论：雌激素可促进成骨细胞MT1-MMP基因表达，此可能为雌激素防治骨质疏松症的重要机制之一。     

植物雌激素染料木素对狗体外冠状血管的舒张作用及其机制

目的：以血管张力变化为指标，对染料木素和17β-雌二醇的心血管保护作用及相关机制进行探讨和比较。方法：①实验于2005—04／10在湖南学院机能实验室完成。选用雄性杂交家狗心脏，把狗心放在冰冷的K—H液中从屠宰场取回进行实验。染料木索（存在于大豆的植物雌激素），17β-雌二醇，吲哚美辛，Nω-L-硝基精氨酸。放线菌酮，前列腺索F2α和缓激肽，正矾酸钠，均购自Sigma公司；甲烯蓝由上海润捷化学试剂有限公司提供。用蒸馏水溶解，它莫西酚、染料术紊、17β-雌二醇用二甲亚砜溶解配制，吲哚美辛用体积分数0.2乙醇溶解。②制备狗冠状动脉血管环，固定于恒温肌槽内，观察染料木紊与17β-雌二醇对KCl预收缩离体冠状血管环的舒张作用：血管环稳定后，向浴槽中加入50mmol／LKCl。待血管环收缩张力达坪值后。用K-H液冲洗。然后，20min换液1次，平衡30min后重复上述实验，待血管环张力达高峰并稳定后，分别加入染料木索与17β-雌二醇，累积浓度为1，4，8，40和80μmol／L，观察血管环张力变化。观察阻断剂及内皮细胞对染料木紊与17β-雌二醇舒血管作用的影响：重复前述实验内容后，用K-H液冲洗，每20min换液1次，温育1,5h，血管环稳定后，向浴槽中分别加入Nω-L-硝基精氨酸1&;#215;10^-4mol／L，它奠西酚10^-5mol／L，吲哚美辛1&;#215;10^-5mol／L，正矾酸钠1&;#215;10^-5mol／L或放线菌酮1&;#215;10^-5mol／L，甲烯蓝1&;#215;10^-5mol／L，温育15min或用棉签擦除内皮细胞后，重复前述实验内容。对比染料木紊与17β-雌二醇对KCl50mmol／L预收缩血管平滑肌的舒张作用的变化，并随时记录张力的变化值。③用线性回归法计算染料木素与17β-雌二醇的使激动剂效应降低50％时所采用的拮抗剂的浓度。两组间计量资料差异比较采用t检验，3组或3组以上资料差异比较采用单因素方差分析。结果：①染料木素与17β-雌二醇作用相似，均可使50mmol／L KCl预收缩冠状动脉血管环产生剂量依赖性舒张作用（r=0．96，P〈0．01），使激动剂效应降低50％时所采用的拮抗剂的浓度分别为（16．37&;#177;5．19）μmol／L和（22．64&;#177;8．26）μmol／L。②除内皮细胞或加入一氧化氮合酶抑制剂Nω-L-硝基精氨酸1&;#215;10^-4mol/L，甲烯蓝1&;#215;10^-4mol／L或正矾酸钠1&;#215;10^-5mol／L温育，染料木素对50mmol／LKCl预收缩动脉血管环产生的量效舒张作用无明显改变（P〉0．05）。但17β-雌二醇对50mmol／LKCl预收缩动脉血管环产生的量效舒张作用有明显改变（P〈0．01），1&;#215;10^-5mol／L吲哚美辛，它莫西酚与放线菌酮对两者量效舒张血管的作用均无明显影响（P〉0．05）。结论：①染料木索和17β-雌二醇对冠状动脉毗管的舒张作用与前列腺素类物质的合成和血管壁传统雌激素受体无关，与雌激素经典核内作用途径无关。②17β-雌二醇的作用部分与内皮细胞释放的一氧化氮有关。③酪氨酸蛋白激酶系统可能参与了冠状动脉血管张力的调节。     

预先艾灸对随后不同阶段更年期大鼠促性激素释放激素、卵泡刺激素和黄体生成素的干预作用

目的：观察逆灸关元穴对更年期大鼠促性激素释放激素、卵泡刺激素和黄体生成素等相关激素的影响，以及逆灸对更年期下丘脑-垂体-卵巢轴稳态维护的机制。方法：实验于2003—11／2004—06在北京中医药大学针灸学院针灸机理实验室完成。①选取鼠龄4个月的健康大鼠10只为年轻正常组，另将鼠龄10个月的大鼠70只数字表法随机分为2组，逆灸组（n=30），自然对照组（n=40），根据处死时的鼠龄，逆灸组又分12，14，16月龄3个时间点，自然对照组分10，12，14，16月龄4个时间点，每个时间点10只。②逆灸组于10月龄时采用艾炷直接灸大鼠关元穴，每次1壮，2次／周，灸后局部皮肤略潮红，共灸8周；其他2组不干预。③各组于相应时间点分批取材，采用放射免疫方法检测血浆卵泡刺激素、黄体生成素水平，下丘脑及血液促性激素释放激素水平。结果：大鼠80只全部进入结果分析。①血浆卵泡刺激素水平：自然对照组16月龄大鼠高于年轻正常组[（23．757&;#177;6．212），（10．565&;#177;0．817）U／L，P〈0．05]，逆灸组16月龄大鼠低于同月龄自然对照组[（17.952&;#177;2231）U/L，P〈0．051。②血浆黄体生成素水平各组比较差异不显著（P〉0．05）。③卵泡刺激素／黄体生成素比值：自然对照组16月龄大鼠大于年轻正常组（0．171&;#177;0．021，0．094&;#177;0．．006，P〈0．05），逆灸组16月龄大鼠小于同月龄自然对照组（0．125&;#177;0．007，P〈0．05）。④下丘脑促性激素释放激素水平：自然对照组14，16月龄大鼠低于年轻正常组[（3．566&;#177;2．387），（3．032&;#177;0．602），（12．041&;#177;4．815）mg／L，P〈0．05，0．01]，逆灸组12，14，16月龄大鼠均高于同月龄自然对照组（P〈0．05）。⑤血浆促性激素释放激素水平：自然对照组16月龄大鼠高于年轻正常组[（99．425&;#177;21．657），（23．816&;#177;6．058）ng／L，P〈0．05]，逆灸组12，16月龄大鼠显著高于同月龄自然对照组（P〈0．05）。结论：更年期大鼠随月龄的增加，下丘脑-垂体-卵巢轴促性激素释放激素、卵泡刺激素和黄体生成素等相关激素逐渐紊乱，逆灸关元穴可缓解更年期各激素的紊乱状况，对下丘脑-垂体-卵巢轴稳态维护具有保护作用。     

高血压心肌纤维化的发病机制：成纤维细胞在血管紧张素Ⅱ刺激下单核细胞趋化蛋白-1的表达状况

目的：研究成年大鼠心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)在血管紧张素Ⅱ刺激下单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotaxia protein-1，MCP-1)表达情况，探讨高血压合并心脏损害的可能机制，方法：成年大鼠CFs体外培养，在不同浓度血管紧张素Ⅱ不同作用时间刺激下，应用免疫蛋白印迹法和ELISA法分别测定细胞中和培养上清中MCP-1的含量。结果：①在细胞内和培养上清中均有MCP-1表达。②随着血管紧张素Ⅱ、刺激浓度的增加和刺激时间的延长，细胞内和上清中MCP-1的表达量也逐渐增加。在1&;#215;10^-11，1&;#215;10^-9，1&;#215;10^-8，1&;#215;10^-7，1&;#215;10^-6mol／L的血管紧张素Ⅱ作用下，上清中MCP-1的含量分别为(1．60&;#177;0．21)，(3．18&;#177;0．15)．(4．70&;#177;0．22)，(9．18&;#177;0．52)，(8．75&;#177;0．42)μg／L，与对照组(1．13&;#177;0．09)μg／L比较，除1&;#215;10^-11mol／L组外，差异均有显著性意义(t=26．21-39．67．P均&;lt;0．05)。③在1&;#215;10^-7mol／L的血管紧张素Ⅱ作用下，3，6，12和24h MCP-1的表达量分别为(2．13&;#177;0．31)，(3．25&;#177;0．20)．(5．28&;#177;0．50)和(9．18&;#177;0.52)μg／L，与空白对照组(1.13&;#177;0．09)μg／L比较差异均有显著性意义(t=6.93～34．11，P均&;lt;0．05)。结论：成年大鼠CFs的MCP-1的表达对血管紧张素Ⅱ的刺激有浓度和时间依赖性。CFs的MCP-1的表达可能参与高血压时心肌内的炎性反应和心肌纤维化。     

肾脏雌激素受体亚型表达分布及补肾中药防治肾损害的受体机制

目的：观察雌激素受体α和β在大鼠肾脏中的表达、分布情况，分析补肾中药防治肾损害的受体机制。方法：实验于2000-09／2002-07在河北医科大学生化实验室完成。选用健康雌性SD大鼠45只，按随机数字法分为3组，即正常对照组、肾脏损伤模型组及中药防治组，每组15只。肾脏损伤模型组和中药防治组大鼠每天腹腔注射1mL 9g／L的灭菌AlCl3溶液复制肾脏损伤模型，正常对照组注射1mL灭菌生理盐水，每连续注射3d，间隔1d，共计72d。中药防治组大鼠每天灌胃1mL生药含量为2．6g／mL的补肾中药复方煎剂（由淫羊藿、熟地、制首乌、黄芪、当归、郁金、石菖蒲、茯苓和川芎9味中药组成，由石家庄乐仁堂药业有限公司提供，每付生药含量为125g），正常对照组和肾脏损伤模型组灌胃等量自来水。每连续灌胃7d．间隔1d，共计72d。应用免疫组织化学方法检测雌激素受体α和β在各组大鼠肾组织中的表达水平和分布区域，应用放射免疫分析法测定各组大鼠血清雌二醇水平。结果：45只大鼠全部进入结果分析，无脱失。山雌激素受体亚型在各组大鼠肾组织中的表达和分布情况比较：正常对照组大鼠肾脏皮质和髓质的远曲小管和近曲小管上皮细胞胞浆中都有雌激素受体α和β阳性颗粒，两种受体亚型的髓质反应信号均比皮质强。肾脏损伤模型组大鼠肾脏皮质雌激素受体β反应信号减弱；髓质雌激素受体α反应信号增强。中药防治组大鼠肾水肿基本消失，皮质雌激素受体β反应信号增强至近正常水平，髓质雌激素受体α反应信号降低至近正常水平。②各组大鼠的血清雌二醇水平比较：肾脏损伤模型组大鼠血清雌二醇水平显著低于正常对照组[（19．0&;#177;0．6，40．0&;#177;0．1）pmol／L．P〈0．011，中药防治组大鼠血清雌二醇水平与肾脏损伤模型组相近[（18．0&;#177;0．6）pmol／L，P〉0．051。结论：AlCl3导致肾水肿时，肾脏皮质雌激素受体β表达减弱，髓质雌激素受体α表达增强，血清雌二醇水平降低。补肾中药具有雌二醇样作用，通过拮抗皮质雌激素受体β表达减弱和髓质雌激素受体α表达增强而发挥其肾脏保护作用。     

睾酮浓度与人脐静脉组织因子途径抑制物的表达

目的：观察生理及超生理浓度睾酮对人脐静脉内皮细胞合成、分泌组织因子途径抑制物的影响。方法：实验于2005-01／06在汕头大学医学院药理实验室完成。将人原代脐静脉内皮细胞复苏后于37℃，体积分数为0．05的CO2培养箱中静置培养，所用细胞为两三代。将消化好的细胞移人96孔板，接种密度为1&;#215;10^8每孔100μL。24h后分为不同浓度睾酮组（3&;#215;10^-9, 3&;#215;10^4, 3&;#215;10^-9, 3&;#215;10^-5 mol/L）及单纯培养液对照组，继续孵育48h，吸取上清，酶联免疫吸附法测定各组组织因子途径抑制物蛋白含量。反转录-聚合酶链反应法观察各组组织因子途径抑制物基因表达水平。结果：①人血管内皮细胞组织因子途径抑制物含量：对照组，3&;#215;10^-9, 3&;#215;10^-8, 3&;#215;10^-6. 3&;#215;10^-5 mol/L睾酮组组织因子途径抑制物含量分别为（6．43&;#177;0．61），（9．8&;#177;1．18），（9．8&;#177;1．05），（6．43&;#177;1．19），（5．43&;#177;0．66）μg／L生理浓度睾酮可明显增加内皮细胞上清液中组织因子途径抑制物含量。而3&;#215;10^-5mol／L组的组织因子途径抑制物含量明显低于对照组（P〈0,05）。②不同浓度睾酮组组织因子途径抑制物mRNA水平：3&;#215;10^-9，3&;#215;10^-8mol／L组组织因子途径抑制物mRNA水平明显高于对照组（P〈0．05）。而3&;#215;10^-5mol／L组组织因子途径抑制物mRNA水平又显著降低（P〈0．05）。结论：生理浓度睾酮通过雄激素受体促进组织因子途径抑制物合成、分泌，增强抗凝系统活性，有利于预防男性冠心病及心肌梗死等血栓性疾病的发生。     

雌激素对穹隆-海马伞切断与卵巢切除大鼠脑内烟碱型乙酰胆碱受体的干预作用

目的：观察雌激素对阿尔茨海默病大鼠脑内不同部位烟碱型乙酰胆碱受体表达的干预作用。方法：实验于2003-11在青岛大学医学院脑病研究所进行。取健康雌性Wistar大鼠10只，随机分为穹隆-海马伞切断＋卵巢切除组和雌激素组，每组5只大鼠．所有大鼠在脑立体定位仪上切断穹隆-海马伞，并切除双侧卵巢，建立模拟伴有体内雌激素水平下降的阿尔茨海默病动物模型。雌激素组大鼠术后第3天皮下注射雌二醇1mg／kg，以后每7d给药1次，30d后应用免疫组织化学技术观察两组阿尔茨海默病大鼠海马CA1区．皮质区．杏仁复合体区和基底前脑Meynert核等部位的烟碱型乙酰胆碱受体阳性细胞的表达．结果：经补充后10只大鼠进入结果分析．雌激组大鼠脑海马CA1区、脑皮质．杏仁复合体区、Meynert核区的烟碱型乙酰胆碱受体阳性细胞数均高于穹隆-海马伞切断＋双侧卵巢切除组[（30．20&;#177;8．65），（64．40&;#177;3．52）个／视野；（41．95&;#177;9．63），（96．81&;#177;9．13）个／视野；（38．18&;#177;9．19），（84．50&;#177;5．48）个／视野；（18．18&;#177;1．65），（89．33&;#177;10．24）个／视野；P〈0．01]。结论：补充外源性雌激素治疗后阿尔茨海默病大鼠各脑区内的烟碱型乙酰胆碱受体表达显著增加，从而提高了胆碱能神经元的功能。     

阿仑磷酸钠对人成骨细胞增殖和护骨素／核因子KB受体活化因子配体mRNA表达的影响

背景：阿仑磷酸钠是新一代的二磷酸盐,属第2代骨质疏松药,临床上广泛用于治疗骨吸收增加类疾病。目的：观察阿仑磷酸钠对人成骨细胞增殖和核因子KB受体活化因子配体（RANKL）及护骨素（OPG）mRNA表达的影响。设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-11／2008-03在重庆医科大学基础研究所完成。材料：成骨细胞来源于手术中取得的松质骨骨块;阿仑磷酸钠为杭州默沙东制药有限公司生产,批号：06130。方法：在含1&#215;10^-9,1&#215;10^-8,1&#215;10^-7,1&#215;10^-6,1&#215;10^-5,1&#215;10^-4mol／L不同浓度的阿仑磷酸钠培养液中培养成骨细胞,以不加阿仑磷酸钠培养为对照。主要观察指标：①成骨细胞观察。②以四甲基偶氮唑盐检测阿仑磷酸钠对成骨细胞的增殖的影响。③以半定量反转录一聚合酶链反应方法观察不同浓度阿仑磷酸钠对成骨细胞表达OPG,RANKLmRNA的影响。结果：1&#215;10^-5,1&#215;10^-4mol／L的阿仑磷酸钠抑制成骨细胞增殖,1&#215;10^-8～10^-6mol／L的阿仑磷酸钠促进成骨细胞增殖,其中1&#215;10^-8mol／L的阿仑磷酸钠对成骨细胞的增殖作用最强。阿仑磷酸钠呈浓度依赖性降低RANKLmRNA表达,干预72h,1&#215;10^-5mol／L抑制作用最大（P〈0．01）。阿仑磷酸钠呈浓度依赖性增加护骨素mRNA表达,干预72h,1&#215;10^-6mol／L增加作用最明显（P〈0．01）,而1&#215;10^-5mol／L时又减低。结论：阿仑磷酸钠能使成骨细胞增殖,1&#215;10^-8mol／L浓度增殖作用最强,其可能通过调节OPG／RANK LmRNA表达而影响骨代谢。     

大鼠脊髓缺血再灌注损伤后促红细胞生成素及其受体的表达变化

目的：观察脊髓缺血再灌注损伤后促红细胞生成素及其受体的表达变化，分析促红细胞生成素对中枢神经保护作用的可能途径。 方法：实验于2003-04／10在解放军第三军医大学外研所三室完成。选择健康雄性SD大鼠（鼠龄4～6个月）20只，随机分为正常对照组10只和脊髓损伤组10只。建立大鼠脊髓缺血再灌注损伤模型，采用反转录-聚合酶链反应方法来测定促红细胞生成素和促红细胞生成素受体mRNA的表达，采用免疫荧光细胞化学染色测定促红细胞生成素受体蛋白表达情况。 结果：纳入动物20只，均进入结果分析。①总RNA的提取：在10g／L琼脂糖凝胶电泳上，可见28s和18s两个清晰条带，28s与18s比值约为2：1，未见明显降解。②脊髓损伤前后促红细胞生成素及促红细胞生成素受体mRNA的表达：在正常脊髓组织中，促红细胞生成素及促红细胞生成素受体mRNA有少量表达，目的基因与内参的吸光度比值为0．107&;#177;0．017，0．289&;#177;0．023；缺血再灌注损伤48h后促红细胞生成素及促红细胞生成素受体mRNA分别为0．173&;#177;0．032，0．725&;#177;0．109，比正常对照组增加61．7％和150．9％，二者相比差异显著（P〈0．01）。③脊髓损伤前后促红细胞生成素受体蛋白水平的表达：阳性反应显色位于细胞膜及胞浆，促红细胞生成素受体反应在神经元和胶质细胞均存在，但主要集中于神经元。正常对照组脊髓神经元细胞有少量促红细胞生成素受体蛋白表达，阳性细胞数／高倍视野（&;#215;200）为13．10&;#177;2．68；而脊髓损伤组表达明显增加，荧光亮度增强，阳性细胞数／高倍视野（&;#215;200）为36．00&;#177;5．93，与正常对照组相比差异显著（P〈0．01）。 结论：脊髓组织中存在促红细胞生成素及促红细胞生成素受体，促红细胞生成素对中枢神经保护作用的机制可能与脊髓缺血再灌注损伤后促红细胞生成素受体表达明显增加有关。     

肾上腺髓质素对缺血再灌注大鼠心肌血管细胞黏附分子1表达的抑制作用

背景：降钙素基因相关肽可减轻心肌缺血再灌注损伤。肾上腺髓质素与降钙素基因相关肽有一定的同源性，因此，一些研究推测肾上腺髓质素也可能对心肌有保护作用。目的：探讨肾上腺髓质素对缺血再灌注大鼠心肌组织血管细胞黏附分子1表达的抑制及其对心肌缺血的保护作用。设计：实验对象为SD大鼠心脏缺血再灌注模型，完全随机分组。随机设计。材料：本实验于2003—12／2004—05在成宁学院医学院实验动物中心完成。实验选用健康雄性SD大鼠24只。方法g24只雄性SD大鼠心脏制成离体心脏缺血再灌注模型，随机分为对照组和肾上腺髓质素1．50(1&;#215;10^-9)，(1&;#215;10^-8)，(1&;#215;10^-7)mol／L组。心脏缺血60min，对照组用氧合KHB液再灌注60min，其他3组分别用氧合KHB液加肾上腺髓质素1．50(1&;#215;10^-9)，(1&;#215;10^-8)，(1&;#215;10^-7)mol／L再灌注15min，再用KHB液灌注45min。收集冠状动脉流出液，检测肌酸激酶同工酶含量。留取左室心尖部心肌进行总RNA提取，采用RT-PCR法测定血管细胞黏附分子1mRNA的表达。主要观察指标：对照组及不同浓度肾上腺髓质素1-50组心肌组织VCAM-1mRNA的表达。结果：电泳后，各组在194bp处均可见一明显的扩增条带，此为甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA扩增片段，各组间甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA的表达基本一致。对照组、肾上腺髓质素1-50(1&;#215;10^-9)mol／L组在334bp处可见亮度强、边界明显清楚的条带为血管细胞黏附分子1mRNA扩增片段。肾上腺髓质素1-50(1&;#215;10^-8)mol／L组血管细胞黏附分子1mRNA扩增条带亮度明显减弱。肾上腺髓质素1．50(1&;#215;10^-7)mol／L组仅为亮度微弱且模糊的扩增条带。肾上腺髓质素1．50(1&;#215;10^-8)。(1&;#215;10^-7)mol／L组扩增的血管细胞黏附分子1mRNA与甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA的灰度值比值(0．6&;#177;0．31，0．5&;#177;0．36)明显低于对照组(1．2&;#177;0．52)(P&;lt;0．05)。结论：心肌缺血再灌注时，肾上腺髓质素1—50可呈浓度依赖性地抑制心肌组织血管细胞黏附分子-1mRNA的表达。     

复智散对神经细胞胞体面积和轴突长度变化的影响

背景：自制中药复智散经已往的实验证实可延缓大鼠的自然老化过程，提示该药可能具有对抗衰老作用。目的：观察复智散培养神经细胞最佳有效浓度对神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞形态学改变的影响设计：重复测量设计。材料：实验于2002-06／2003-04在前都医科大学宣武医院北京脑老化重点实验室完成。自制中药复智散（菖蒲、远至等6味中药组成）由哈尔滨医科大学第一临床医学院神经科王德生教授和上海东方医院神经科徐晓云教授共同组方，淀粉样β蛋白25—35片段，SH-SY5Y神经母细胞瘤株。方法：用不同浓度的复智散孵育神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞，利用噻唑蓝比色法测定细胞存活率，制定量一效关系曲线，寻找最佳药物浓度；6孔板培养细胞分为正常对照组、淀粉样β蛋白25—3525μmol／L组、淀粉样β蛋白25～3525μmol／L ＋复智散45&;#215;10^-3g／L组和复智散45&;#215;10^-3g／L组，孵育24h，观察细胞形态学改变，测定神经细胞的胞体面积和轴突长度主要观察指标：①各组SH-SY5Y细胞噻唑蓝代谢率的变化。②各组神经细胞胞体面积及轴突长度。结果：①复智散可增进SH-SY5Y细胞的存活，最佳有效浓度为45&;#215;10^-3g／L。②SH-SY5Y细胞胞体面积和轴突长度：淀粉样β蛋白25-3525μmol／L组明显低于正常对照组[（505．5&;#177;122．36），（599．8&;#177;141．25）μm^2；（26．0&;#177;13．97），（363&;#177;15．58）μm，（t=3．903,3．447,P=0．000）]。复智散45&;#215;10^-3g／L组与淀粉样β蛋白25—3525μmol／L＋复智散45&;#215;10^-3 g／L组均明显高于淀粉样β蛋白25—3525μmol／L组[（918．3&;#177;178．34），（896．6&;#177;257．14），（505．5&;#177;122．36）μm^2；（968&;#177;43．31），（88．3&;#177;30．23），（26．0&;#177;13．97）μm．t=10．922，14．172，P=0．000）1。结论：在淀粉样β蛋白25—35损伤条件下复智散依旧有促进培养神经细胞存活的作用，表现在增进细胞胞体面积的增长和轴突的延伸方面。     

苦豆子对豚鼠内脏平滑肌收缩活动的干预

目的：观察苦豆子水煎剂对豚鼠离体内脏平滑肌作用的影响，分析其发挥作用途径。 方法：实验于2004—12在宁夏医学院基础学院生理实验室完成。①选用健康成年三色毛豚鼠24只，雌雄不拘。②苦豆子（由银川市中医院提供，由该院检定）被制备成1kg／L的水煎剂，实验的系列质量浓度为1&;#215;10^-4，3&;#215;10^-4，1&;#215;10^-3，3&;#215;10^-3，1&;#215;10^-2，2&;#215;10^-2kg／L。③实验方法：实验时分别取出豚鼠胆囊、胃、小肠及膀胱。每个胆囊制备3条平滑肌肌条，共72条；胃、小肠及膀胱各制备12条平滑肌肌条。累积于置胆囊、胃、小肠及膀胱平滑肌肌条各12条的肌槽中加入1&;#215;10^-4，3&;#215;10^-4，1&;#215;10^-3，3&;#215;10^-3，1&;#215;10^-2，2&;#215;10^-2kg／L苦豆子水煎剂，加药间隔2min。容量50μL。④按随机抽签法将其余60条胆囊肌条分为5组：阿托品＋苦豆子组、酚妥拉明＋苦豆子组、维拉帕米＋苦豆子组、苯海拉明＋苦豆予组、吲哚美辛＋苦豆子组，每组12条。上述5组分别加入拮抗剂阿托品（胆碱能M受体阻断剂）1&;#215;10^-6mol／L，酚妥拉明（肾上腺素能α受体阻断剂）1&;#215;10^6mol／L，维拉帕米（Ca^2＋拮抗剂）1&;#215;10^-7mol／L，苯海拉明（组织胺H1受体阻断剂）1&;#215;10^-6mol／L，吲哚美辛（前列腺隶受体阻断剂）1&;#215;10^6mol／L后2min再依次加入前述“累积加药”中各质量浓度苦豆子。⑤通过JH-2肌肉张力换能器将信号输出BL-410生物机能实验系统读出标本的张力、收缩波平均振幅及收缩频率的变化值。⑥数据间差异性比较采用均数t检验。 结果：①累积加入苦豆子水煎剂1&;#215;10^-4，3&;#215;10^-4，1&;#215;10^-3，3&;#215;10^-3，1&;#215;10^-2.2&;#215;10^-2kg／L后，胆囊肌条张力逐渐增高、收缩频率逐渐加快、收缩波平均振幅逐渐减小。（函当苦豆子水煎剂累积质量浓度为2&;#215;10^-2kg／L时，酚妥拉明＋苦豆子组离体胆囊肌条张力和收缩频率明显低于或慢于苦豆子组（t=2，3401，2．1404，P〈0．05），而收缩波平均振幅明显高于苦豆子组（t=2．8256，P〈0．05）。维拉帕米＋苦夏子组离体胆囊肌条张力明显低于苦豆子组（t=2．3464，P〈0．05）。③当苦豆子水煎剂累积质量浓度为1&;#215;10^-2kg／L时，酚妥拉明＋苦夏子组离体胆囊肌条张力明显低于苦豆子组（t=2．430，P〈0．05），而收缩波平均振幅明显高于苦豆子组（t=2．2279，P〈0．05）。维拉帕米＋苦豆子组离体胆囊肌条张力明显低于苦豆子组（t=2．6576，P〈0．05）。④累积加入不同质量浓度苦赢子水煎剂后对豚鼠胃、小肠及膀胱肌条的张力、收缩波平均振幅及收缩频率无明显影响（P〉0．05）。 结论：①苦豆子水煎刺可呈剂量依赖性增高胆囊平滑肌肌条的张力、加快收缩频率、减小收缩波平均振幅，其作用可被酚妥拉明及维拉帕米部分阻断，且该种作用可能与胆囊平滑肌细胞膜上的肾上腺素能Ⅱ受体和细胞膜上的Ca^2＋通道有关。②苦豆子水煎剂对豚鼠胃、小肠及膀胱平滑肌的收缩活动无明显影响。