人工合成苯丙氨酸脱氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达

目的 将人工合成具有乳酸菌偏好密码子的苯丙氨酸脱氨酶基因（PAL^art），在乳酸乳球菌中克隆并进行食品级表达，以期进一步用于治疗苯丙酮尿症的研究。方法 以欧芹苯丙氨酸脱氨酶氨基酸序列为准，人工合成以乳酸菌偏爱密码子编码相同氨基酸序列的基因PAL^art，将该基因克隆到食品级乳酸乳球菌高效表达系统pNZ8149／NZ3900中而获得基因工程菌，用HPLC法测定诱导表达出的苯丙氨酸脱氨酶活性。结果 获得了能表达苯丙氨酸脱氨酶活性的阳性克隆pNZS149-PAL^art／NZ3900。该酶的表达量与诱导物乳链菌肽的浓度有关。反应液pH值能明显影响工程菌转化苯丙氨酸为肉桂酸的转化率；以10mmol／L的苯丙氨酸作为底物，在pH8．0的磷酸盐缓冲液中，于37℃反应18h，其转化率可达64％。结论 获得具有活性PAL^art食品级表达的乳酸乳球菌株，为进一步将其制成口服制剂用于治疗经典型苯丙酮尿症模型动物的实验研究打下基础。     

表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌诱导小鼠产生体液免疫应答

目的分析表达HIV-1 gag蛋白的重组乳酸乳球菌通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠诱导的体液免疫反应。方法将50只BALB/c小鼠随机分成5组,每组10只。表达gag的重组乳酸乳球菌分别通过口服、滴鼻、皮下注射以及上述3种方式联合免疫小鼠,对照组口服含PMG36e空载体的乳酸乳球菌,接种菌量均为109菌落形成单位(CFU),连续免疫3次,每次间隔2周,其中口服和滴鼻每次连续免疫3 d。采集免疫前和每次免疫后2周小鼠的血清,ELISA检测gag特异性的IgG水平。结果表达gag的重组乳酸乳球菌经口服、滴鼻、皮下注射以及3种方式联合免疫均诱导小鼠产生了gag特异性IgG,且联合免疫组gag IgG水平显著高于其他各实验组(P0.01)。初次免疫后6周,口服和皮下注射免疫组gag IgG水平显著高于滴鼻免疫组(P0.01)。免疫3次后各组血清中gag抗体的阳性率:口服免疫组分别为40%、40%、90%;滴鼻免疫组分别为10%、20%、20%;皮下免疫组分别为10%、60%、90%;联合免疫组的阳性率在初次免疫后2周已达到100%。结论表达HIV-1 gag的重组乳酸乳球菌载体疫苗经口服、滴鼻、皮下注射及3种方式联合免疫均能诱导小鼠产生特异性的体液免疫反应,多种途径联合免疫可增强乳酸乳球菌载体疫苗的免疫效果。     

表达HIV-1 gag蛋白重组乳酸乳球菌株的建立及其在小鼠体内定植的研究

目的 构建表达HIV-1 gag的重组乳酸乳球菌,并分析重组菌在小鼠体内的定植情况.方法 将HIV-1 gag克隆至原核表达质粒pMG36e,重组质粒pMG36e-gag电转乳酸乳球菌,SDS-PAGE和Western blot法检测其在乳酸乳球菌中的表达.以109个重组菌给小鼠口服,对照组口服PBS.口服后第1、3、5、7、9、11天分别取小鼠的胃、小肠和大肠,采用稀释滴种法测定小鼠胃、肠道内重组菌的数量.结果 酶切和DNA测序表明gag已克隆入pMG36e.SDS-PAGE在预期位置检测到蛋白条带,Western blot分析证实其为gag蛋白.重组菌定植实验表明,第1、3天在胃肠均有一定量重组菌,且大肠中重组菌数量多于胃和小肠,随后胃肠中重组菌均迅速减少,仅在大肠中仍有一定量的重组菌,第11天时胃肠仅分离到极少量的重组菌.结论 本研究获得胞内表达HIV-1 gag前体蛋白Pr55的重组乳酸乳球菌,其可在胃肠中短期存活,可作为预防HIV-1感染的候选疫苗.     

抗菌及中和内毒素蛋白葛佬素的克隆、表达

观察人工设计葛佬素的cDNA序列表达产物是否具有抗菌及中和内毒素作用。方法：采用统计学方法,统计同种族蛋白质的cDNA序列氨基酸的偏爱密码子,并以此为基础设计葛佬素的cDNA序列,将合成的葛佬素cDNA插入真核细胞表达载体pCDSI中后转染COS-7细胞,对转染的COS-7细胞上清进行杀菌及中和内毒素活性的检测。     

043 乳酸乳球菌分泌的IL-10治疗鼠结肠炎

炎症性肠疾病 (ＩＢＤ)是影响公众健康的一种重要疾病 ,其主要特征为大肠或 /和小肠的慢性炎症 ,目前其病因不明。ＩＬ 10在下调炎症反应中起关键作用 ,有望用于ＩＢＤ的治疗。该文研究了基因工程细菌 (乳酸乳球菌Ｌ .ｌａｃｔｉｓ)产生的ＩＬ 10对两种小鼠疾病模型的作用 ;一是治疗由 5 %葡聚糖硫酸钠 (ＤＳＳ)诱生的慢性结肠炎 ,一是阻止ＩＬ 10 / 小鼠结肠炎的自然发展。首先 ,构建重组乳酸乳球菌。构建的ＬＬ ｍＩＬ 10株 (Ｌ .ｌａｃｔｉｓ) ,分泌具有生物活性的小鼠ＩＬ 10 (ｍＩＬ 10 )。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ确定其蛋白质表达 ,…     

乳酸乳球菌同时发送外源性蛋白质/DNA到哺乳动物细胞

目的:建立乳酸乳球菌同时发送外源蛋白/DNA到哺乳动物细胞的系统.方法:分别将红色荧光蛋白基因、绿色荧光蛋白真核表达框整合于乳酸菌穿梭载体pMG36e中相关部位.重组质粒电转乳酸乳球菌后,经甘氨酸消弱乳酸乳球菌细胞膜后与哺乳动物细胞293T细胞共培养.结果:红色和绿色荧光蛋白均能在293T细胞表达.结论:借助乳酸乳球菌成功实现同时发送蛋白质/DNA到哺乳动物细胞.     

BPIm23重组抗菌蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的：采用巴斯德毕赤酵母表达系统表达分泌型功能性rBPIm23抗菌蛋白。方法：利用构建的pUC18-synBPI414质粒和PBV220-BPIm120质粒，按分子克隆方法构建pPICZa-synBPIm600重组表达载体；用线性化pVICZa-synBPIm600质粒电转化Pichia pastoris GS115，筛选抗性转化子，进行PCR和Mut表型鉴定；用甲醇诱导目的蛋白rBPIm23的表达；用离子交换层析纯化rBPIm23，并进行SDS-PAGE分析、Western blot鉴定和用BCA法定量。结果：①成功构建了pPICZa-synBPIm600重组表达载体；②获得稳定整合目的基因的GS115菌株；③表达产物相对分子量约为23kD，可与抗BPI抗体特异性结合；④培养上清液中目的蛋白表达量约为2.9mg／L。结论：BPIm23重组抗菌蛋白在毕赤酵母GS115中得到分泌表达。     

细胞因子介导的抗菌蛋白表达调控机制

抗菌蛋白是机体先天性防御系统的构成成分,在防御病原人侵方面起十分重要作用。虽然一些抗菌蛋白成分的表达是组成性的,但最新研究表明,许多抗菌蛋白的表达受到相关细胞因子的调控。尤其是T细胞系来源的细胞因子所发挥的作用最为显著。了解细胞因子介导的抗菌蛋白表达调控机制及IL-17和IL-22如何通过调节局部的相关抗菌蛋白表达来保持皮肤和粘膜免疫稳态性的很重要。     

红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究

目的研究红色荧光蛋白编码基因Dsred在酿酒酵母菌中的快速克隆与表达。方法根据已发表基因序列设计引物,采用连续重叠PCR方法快速克隆获得全长Dsred基因,将其与pMD-18T载体连接后进行测序鉴定。通过In-fusion方法将鉴定正确的pMD-Dsred重组载体与酿酒酵母表达载体pYeDP60进行连接,测序后利用LiAc方法将鉴定正确的pYeDP60-Dsred重组表达载体转化至酿酒酵母菌W303-1B中,PCR扩增筛选阳性克隆,获得的W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌经诱导培养后进行SDS-PAGE电泳分析和绿光激发荧光成像检测。将工程菌分别接种至YPD、YPG、SCG和SCD培养基,培养48、72、96、120和144h后分别测定吸光度(A600)值。取诱导表达后的工程菌(菌液组)进行离心(菌体组)、离心后加甘油(高渗组)处理,分别置于–70、–20、4、28和37℃条件培养,荧光显微镜观察其表达特性。结果连续重叠PCR扩增和测序鉴定结果表明,扩增获得的Dsred基因长为678bp,其序列与已发表的基因序列完全一致;Dsred基因已成功插入pYeDP60-Dsred重组表达载体,且受酵母诱导型启动子GAL10-CYC1调控表达。PCR扩增筛选和SDS-PAGE分析显示,pYeDP60-Dsred重组表达载体已成功导入酿酒酵母菌中,诱导表达产物相对分子质量与预期相符,且诱导后工程菌可在绿光激发下发出红色荧光。4种培养基内工程菌的菌体生长情况无明显差别,重组Dsred红色荧光蛋白表达不会抑制酿酒酵母菌体生长。荧光显微镜观察显示,工程菌经不同处理后,高渗组红色荧光蛋白成熟时间最短,菌液组时间最长;红色荧光蛋白在37℃条件下培养时成熟最早,但降解速度较快。结论成功构建了pYeDP60-Dsred重组酿酒酵母表达载体,实现了Dsred基因在酿酒酵母菌体内的异源表达。红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响,且离心保留菌体和加入甘油等缺水高渗处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。     

膀胱抗菌机制—粘膜抗菌蛋白初步研究

本文报道以１％乙酸冲洗雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠膀胱和雌性新西兰白兔膀胱，分别获得其膀胱酸溶性提取物。ＡＵ－ＰＡＧＥ分析表明，两种膀胱粘膜酸溶性提取物都有十余条主蛋白带，而不含常见的杀菌物质溶菌酶和防御素样分子。琼脂糖弥散法杀菌试验显示，两种膀胱粘膜酸溶性提取物对致病性大肠杆菌ＭＬ－３５ｐ耐药株都有杀菌活性。进一步采用电泳凝胶琼脂糖弥散法杀菌试验分析，结果表明大鼠膀胱粘膜酸溶性提取物中有两条蛋白带具明显的杀菌活性，我们称这两条蛋白带为ＲａｔＢＰ－１和ＲａｔＢＰ－２。而兔膀胱粘膜酸溶性提取物的杀菌活性亦与两条被称为ＲａｂＢＰ－１和ＲａｂＢＰ－２的蛋白带相关。本文首次提示，在膀胱粘膜内存在抗菌蛋白，可能是膀胱粘膜杀菌作用的分子基础。     

利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的：构建含目的基因葛佬素(Gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(Rapid Translation System)对其进行表达。方法：采用PCR方法扩增gloverin cDNA,将其与表达载体pIVEX2．3连接；采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500，使其蛋白能在大肠杆菌(E．coli)裂解产物中进行表达。     

大鼠子宫内膜抗菌蛋白研究

大鼠子宫内膜抗菌蛋白研究华西医科大学病理生理教研室成都６１００４４徐罗玲，吴琦，王伯瑶以１％乙酸冲洗雌性ＳＤ大鼠子宫内膜，获得子宫内膜酸溶性提取物。酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，该提取物有十余条主蛋白带，但电泳图谱上不显示已知的抗菌物质溶菌酶和...     

nm23蛋白在转移性胃癌中的表达

ｎｍ２３蛋白在转移性胃癌中的表达刘宝瑞张学庸丁杰ｎｍ２３蛋白在转移性胃癌中的表达@刘宝瑞@张学庸@丁杰...     

nm23蛋白在人鼻咽癌中的表达

ｎｍ２３蛋白在人鼻咽癌中的表达郑天荣谢佐福林贤东张竟时陆莉莉最新研究资料表明，ｎｍ２３基因的高表达仅与部分肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌等癌症的转移能力下降有关［１］，而与另一些肿瘤如结肠癌、甲状腺癌的转移无关［２］。鼻咽癌在我国南方发病率高，其淋巴结转移...     

生长相关蛋白在损伤坐骨神经中的表达

目的：研究大鼠周围神经损伤与再生过程中生长相关蛋白的表达。方法：取正常SD大鼠坐骨神经和离断损伤后不同时间近侧端和远侧端神经组织，采用Anti-GAP－43抗体以Western blot方法检测GAP－43的表达变化。结果：NC膜上43kDa位置出现阳性反应条带，在正常坐骨神经中反应微弱，损伤后明显加强，随损伤时间延长，神经近侧端的反应无明显改变，神经元侧端的反应逐渐加强，以第3周为最强，之后逐渐减弱，结论：GAP－43在正常坐骨神经中低表达，损伤后近侧端与远侧端表达均增加，远侧端的表达增加以第3周为高峰。     

HLA-B蛋白在喉癌中的表达及意义

目的研究人白细胞抗原HLA-B蛋白在喉癌组织中的表达及意义。方法应用免疫组化方法检测HLA-B蛋白在50例喉癌组织及癌旁组织的表达,应用Western Blot方法检测HLA-B蛋白在6对喉癌及癌旁组织中的表达。结果 HLA-B蛋白在癌旁正常组织中100%表达,而在喉癌组织中表达水平明显下调,有淋巴结转移组下调明显低于无淋巴结转移组。结论 HLA-B蛋白在喉癌组织中表达下调,可能与颈淋巴结转移相关。     

EZH2蛋白在食管癌组织中的表达

目的观察EZH2蛋白在食管鳞癌和腺癌组织中的表达,探讨EZH2蛋白与侵袭、转移程度不同的食管鳞癌及不同病理分级、组织类型食管癌之间的关系。方法采用免疫组织化学染色法、免疫印迹法,分析检测食管癌标本中EZH2蛋白的表达。结果食管癌组织标本均高表达EZH2蛋白,阳性染色定位于细胞核;部分正常组织、癌旁组织也有弱阳性着色。免疫印迹分析表明,食管鳞癌组织EZH2蛋白的表达明显高于癌旁及正常黏膜组织（P〈0．01）。癌旁组织高于正常黏膜组织（P〈0．05）。浸润、转移性食管鳞癌EZH2蛋白表达明显上调,与未发生浸润、转移的相比,差异有显著性（P〈0．05）。高分化鳞癌EZH2蛋白表达低于中、低分化者;但食管腺癌则相反,高分化腺癌的表达高于中、低分化者。结论EZH2蛋白在食管癌高表达,并与其组织类型、侵袭和转移特性密切相关。     

绿色荧光蛋白在大鼠骨骼肌中的表达

研究绿色荧光蛋白在哺乳动物细胞保的表达。方法制备了含绿色荧光蛋白基因的重组ＤＮＡ,经脂质体法转染培养的大鼠骨骼肌细胞,用共聚焦显微镜观察ＧＦＰ的表达。结果大约２０％－３０％的骨骼３同细胞呈现不同强度色荧光。结论ＧＦＰ是研究活细胞生命现象的一种新途径。     

bcl-10蛋白在MALT淋巴瘤中的表达

目的 观察bcl-10蛋白在黏膜相关淋巴组织样结外边缘区B细胞淋巴瘤（MALT淋巴瘤）中的表达及其意义。方 法对62例MALT淋巴瘤进行回顾性研究,采用免疫组织化学SP法检测bcl-10及Ki-67的表达。结果 62例MALT淋巴瘤中,60例（96．8％）表达bcl-10,其中胞核和胞质同时表达33例（53．2％）,仅有胞质表达27例（43．6％）。10例桥本甲状腺炎bcl-10均表达于胞质。bcl-10核阳性组发病平均年龄（51．4岁）比bcl-10核阴性组（56．6岁）小5．2岁,bcl-10核阳性组以男性占优势,bcl-10核阴性组以女性发病较多。不同解剖部位核阳性表达率差异有统计学意义（P〈0．05）,肺和胃肠道检出率较高,而甲状腺较少;不同临床分期之间核阳性表达率差异P〉0．05;bcl-10核表达与不表达两组在肿瘤细胞形态上差异P〉0．05;在胃肠道40例病例中,不同浸润组别的核阳性率表达差异P〈0．05,浸出浆膜外的病例核阳性率高于局限在浆膜以内的病例;bcl-10核阳性组与核阴性组Ki-67增殖指数的差异无统计学意义。随访52例（83．9％）,bcl-10核阳性组（29例,96．3％）与核阴性组（23例,66．4％）的5年生存率差异无统计学意义。结论 bcl-10在MALT淋巴瘤中主要有胞质和胞核两种表达模式;胞核的表达在不同解剖部位之间检出率不同,并与肿瘤的浸润深度相关。bcl-10在MALT淋巴瘤的诊断、治疗和预后方面有一定的提示作用。