不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤活性的研究

目的:探讨不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤的活性。方法:采用CD3AK法,CD3/CD28共刺激法,CIK法,并作细胞扩增能力检测。测定刺激细胞对肿瘤的杀伤活性,及用流式细胞仪检测共刺激后的T细胞表型变化。结果:抗CD3单克隆抗体可通过CD3成分启动T细胞,使淋巴细胞表型发生变化,联系细胞因子诱导的T淋巴细胞能有效提高T细胞对鼻咽癌细胞的杀伤活性,CIK方法诱导的T淋巴细胞在体外能保持良好的扩增活性。结论:不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤活性不同,CD28联合CD3诱导的T细胞抗肿瘤活性较高,CIK法效果最好。     

不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤活性的研究

目的：探讨不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤的活性。方法：采用CD3AK法，CD3／CD28共刺激法，CIK法，并作细胞扩增能力检测。测定刺激细胞对肿瘤的杀伤活性，及用流式细胞仪检测共刺激后的T细胞表型变化。结果：抗CD3单克隆抗体可通过CD3成分启动T细胞，使淋巴细胞表型发生变化，联系细胞因子诱导的T淋巴细胞能有效提高T细胞对鼻咽癌细胞的杀伤活性，CIK方法诱导的T淋巴细胞在体外能保持良好的扩增活性。结论：不同细胞因子协同活化的T细胞抗肿瘤活性不同，CD28联合CD3诱导的T细胞抗肿瘤活性较高，CIK法效果最好。     

前药5-FC联合胃泌素拮抗剂CI-988对转CD基因大肠癌SW480细胞的杀伤作用

目的：探讨联合应用前药5-氟胞嘧啶（5-iluorocytosine，5-FC）和胃泌素拮抗剂CI-988对转组织特异性胞嘧啶脱氨基酶（cytosinedeaminase，CD）基因的大肠癌SW480细胞生长的影响。方法：将转CD基因大肠癌SW480细胞接种至4块24孔细胞培养板中，依次分为实验组1、2、3及对照组，分别以含有前药5-FC、胃泌素拮抗剂CI-988、5-FC联合CI-988及正常培养液进行培养。每天胰酶消化法计数各组4孔，共6d，绘制细胞生长曲线并计算生长抑制率。按上述分组方法另接种培养4组细胞，于培养72h行M1Tr法检测490nm处吸光度A值，计算细胞杀伤率。结果：应用5-FC联合CI-988处理的转CD基因大肠癌SW480细胞在6d后生长抑制率达97％；于培养72h时，实验组1、3细胞杀伤率较对照组有显著性差异（P〈0．01）；实验组2与对照组无显著性差异（P〉0．05）；实验组3较实验组1、2有显著性差异（P〈0．01）。结论：CD／5-FC系统和胃泌素拮抗剂CI-988对转基因大肠癌SW480细胞具有杀伤或抑制作用，联合应用胃泌素拮抗剂可以提高CD／5-FC自杀基因系统对大肠癌细胞的杀伤效应。     

前药 5-FC 联合胃泌素拮抗剂 CI-988 对转 CD 基因大肠癌 SW480细胞的杀伤作用

目的：探讨联合应用前药5-氟胞嘧啶（5-iluorocytosine，5-FC）和胃泌素拮抗剂CI-988对转组织特异性胞嘧啶脱氨基酶（cytosinedeaminase，CD）基因的大肠癌SW480细胞生长的影响。方法：将转CD基因大肠癌SW480细胞接种至4块24孔细胞培养板中，依次分为实验组1、2、3及对照组，分别以含有前药5-FC、胃泌素拮抗剂CI-988、5-FC联合CI-988及正常培养液进行培养。每天胰酶消化法计数各组4孔，共6d，绘制细胞生长曲线并计算生长抑制率。按上述分组方法另接种培养4组细胞，于培养72h行M1Tr法检测490nm处吸光度A值，计算细胞杀伤率。结果：应用5-FC联合CI-988处理的转CD基因大肠癌SW480细胞在6d后生长抑制率达97％；于培养72h时，实验组1、3细胞杀伤率较对照组有显著性差异（P〈0．01）；实验组2与对照组无显著性差异（P〉0．05）；实验组3较实验组1、2有显著性差异（P〈0．01）。结论：CD／5-FC系统和胃泌素拮抗剂CI-988对转基因大肠癌SW480细胞具有杀伤或抑制作用，联合应用胃泌素拮抗剂可以提高CD／5-FC自杀基因系统对大肠癌细胞的杀伤效应。     

小鼠Egr-1基因调控序列的克隆及其辐射诱导特性的鉴定

共刺激信号是激发有效的细胞免疫应答所必需的.B7分子家族及CD28/CTLA-4等刺激分子在共刺激信号的传递过程中起着重要的作用.T细胞表面CD28与APC细胞表面B7分子结合似乎提供了T细胞激活所需的主要共刺激信号.T细胞表面有多种膜表面分子,这是T细胞识别抗原,与其它免疫细胞相互作用,接受信号刺激等的物质基础,也是鉴别和分离T细胞和T细胞亚群的重要依据.由于共刺激信号的产生和传导,介导靶细胞凋亡可人为调节免疫应答使之增强或抑制.本研究将分析McAb诱导PBLs细胞膜分子表达及肝癌细胞凋亡的相关性.这可能为肿瘤免疫治疗提供新的线索.1 材料与方法1.1 淋巴细胞的分离培养正常人外周血(PBLs)100ml(广州血液中心),2     

熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞株凋亡的实验研究

目的探讨熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞株凋亡的作用机制.方法用不同浓度的熊果酸处理HT-29细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色检测熊果酸对HT-29细胞的增殖抑制效应,采用形态学、TUNEL法、流式细胞术检测细胞凋亡的发生,应用免疫组织化学SP法检测凋亡相关基因caspase-9, bax表达的变化.结果熊果酸在体外对HT-29细胞有中度增殖抑制效应,在熊果酸作用下,HT-29细胞出现显著的细胞凋亡征象,TUNEL显示细胞固缩,核染色质聚集或断裂,形成凋亡小体.流式细胞术检测在G1期之前出现sub-G1峰,凋亡率最高为11.63%,熊果酸的作用具有浓度和时间依赖性.在HT-29细胞凋亡过程中,凋亡相关基因caspase-9和bax的表达依次增强.结论熊果酸在体外对HT-29细胞有诱导凋亡的作用.其作用机制可能是通过促进caspase-9的活化和bax的表达上调来实现.     

表达嵌合T细胞受体的T淋巴细胞介导的肿瘤过继性免疫治疗作用研究

目的:构建嵌合T细胞受体(chimeric T cell receptor,chTCR),它包括识别肿瘤相关抗原erbB2的单链抗体、共刺激分子CD28和CD3的信号转导链ζ,将其依次克隆入载体pcDNA3中,电转染入人外周血T淋巴细胞,使嵌合T细胞受体在T细胞表面表达,并验证其在体外和体内的抗肿瘤作用,为肿瘤的过继性免疫治疗提供新思路。方法:抗erbB2的单链抗体(由本所保存),人CD28分子的部分胞外段、跨膜区和胞内段,CD3ζ链的胞内段(分别由RT-PCR的方法获得)依次克隆入载体pcDNA3中,经酶切鉴定正确后,电转染进入人外周血T淋巴细胞,利用流式细胞仪检测T细胞结合Her2蛋白的功能;细胞杀伤试剂金检测T细胞的抗原特异性杀伤功能;并在裸鼠体内验证其对人的乳腺癌细胞株BT-474移植瘤的杀伤效应。结果:成功构建了抗erbB2嵌合T细胞受体并表达在人的T淋巴细胞表面,体外证明能结合Her2肿瘤抗原,并有抗原特异性的杀伤功能,在BALB／c裸鼠体内对表达erbB2的肿瘤细胞BT～474有显著的抑制肿瘤生长的作用。结论:表达嵌合T细胞受体的T淋巴细胞在体外和体内有抗原特异性的杀伤肿瘤的作用,是一种新的肿瘤过继性的免疫治疗策略。     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的:探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应.方法:外周血单核细胞在GM-CSF + IL-4 的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化.MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞.结果:凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83 表达增加﹙P<0.01﹚,而CD1a表达量下调﹙P<0.05).负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖.结论:GM-CSF + IL-4 诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞.     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的：探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应。方法：外周血单核细胞在GM—CSF＋IL-4的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化。MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞。结果：凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83表达增加（P〈0．01）,而CD1a表达量下调（P〈0．05）。负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖。结论：GM—CSF＋IL-4诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞。     

抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK的实验研究Ⅳ抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱导的PBL增殖与凋亡共存现象

抗CD3单抗TCR/CD3复合物中的CD3分子相互作用,通过信号传导系统引起T细胞功能的不同变化,如诱导T细胞活化增殖,诱导无反应性(unresponsiveness)和细胞凋亡。但抗CD3单抗这几种性质不同,看似矛盾的作用之间有何内在联系及规律是值得深入探讨的。我们在研究抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱生扩增人CD3AK过程中,观察到抗CD3单抗和rIL-2共刺激诱导的细胞增殖与凋亡共存的现象。(1)抗CD3单抗和rIL-2共刺激法可诱导人外周血淋巴细胞活化增殖,如细胞数扩增,~3H-TdR掺入和介导细胞毒活性等;(2)形态学检查表明同一培养体系中不仅可检测到活化增殖的细胞、有丝分裂的细胞,也可检测到凋亡的细胞(这些细胞体积小,核缩小甚至断裂,染色质边集,细胞膜及细胞浆向表面突出及崩解形成凋亡小体等),它们都具有淋巴细胞的特征。(3)在抗CD3单抗和rIL-2共刺激后10小时检测不到凋亡的特征性DNA片段,第4     

抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体的生物学活性研究

背景与目的目前,常规疗法已难以提高卵巢癌患者的生存率,已有实验数据及临床前试验结果表明,双特异性抗体能有效介导效应细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本研究旨在通过检测抗人卵巢癌/抗人CD3单链双特异性抗体(BHL-I)的生物学活性,为其临床前试验及应用提供实验依据。方法观察BHL-I介导的外周血淋巴细胞(peripheralbloodlymphocyte,PBL)与靶细胞SKOV3结合、MTT法检测外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)增殖及PBL对靶细胞SKOV3杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中PBL分泌hIFN-γ、hTNF-α变化。结果BHL-I介导的花环形成率(15.7%)显著高于对照组(11.1%)(P<0.01);在抗原存在下,BHL-I显著促进PBMC增殖和PBL对靶细胞的杀伤(P<0.01),且杀伤率与花环形成率呈正相关(r=0.946);杀伤过程中上清液中hIFN-γ、hTNF-α显著增高(P<0.01)。结论BHL-I能介导PBL和SKOV3结合并活化PBL特异杀伤效应,杀伤可能与其hIFN-γ、hTNF-α表达增高有关。     

Anti-HER-2 anti-CD3 bi-specific antibodies inhibit growth of HCT-116 colorectal carcinoma cells in vitro and in vivo

Objective: This study is conducted to evaluate the effects of anti-HER-2×anti-CD3 bi-specific antibodies(BsAb)on HER-2/neuover-expressing human colorectal carcinoma cells. Methods: Growth was assessed by MTT assaysafter exposure of HCT-116 cells to Herceptin, anti-CD3 and BsAb antibodies. Immunocytochemistry was appliedto test the HER-2 level of HCT-116. In a nude mouse model, HER-2×CD3 BsAb was combined with effectorcells (peripheral blood lymph cells from normal human being) for observations on in Vivo growth of tumors.Results: Compared with the control group, using effector cells combined with anti-CD3 McAb, Herceptin orHER2×CD3 BsAb, tumor cell growth in vitro and in vivo was significantly inhibited (P<0.05), most remarkablyin the HER2×CD3 BsAb case. The growth of xenografts with HER2×CD3 BsAb combined with effector cells wasalso significantly inhibited when compared with the anti-CD3 McAb or Herceptin groups (P<0.05). Conclusion:HER-2/neu might be a useful target for immunotherapy in colorectal carcinoma, anti-HER2×anti-CD3 BsAbexerting clear anti-tumor effects.     

Proportion of CD4+CD25+ regulatory T cell is increased in the patients with ovarian carcinoma

Objective: To study the frequency of the CD4⁺CD25⁺ regulatory T cells (Tregs) in the patients with ovarian carcinoma and its possible mechanism. Methods: The percentages of CD4⁺CD25⁺ Tregs in the peripheral blood lymphocytes (PBLs), tumor infiltrating lymphocytes (TILs) and tumor associated lymphocytes (TALs) from 13 patients with ovarian carcinoma and in the PBLs from 14 healthy women were determined by flow cytometry. The expression of CD69 on CD4⁺PBLs from the patients was detected. PBLs from healthy women were cultured in complete RPMI 1640 containing the supernatant from SKOV3 cell line with or without PHA (phytohemagglutinin) stimulation for 72 hours, then the percentage of CD4⁺CD25⁺ T cells was detected. Results: CD4⁺CD25⁺ Tregs in the PBLs from patients with ovarian carcinoma were significantly increased compared with those from the control. The percentage of CD4⁺CD25⁺ Tregs in TILs was higher than that in PBLs and TALs from the patients, but not significantly. The expression of CD69 on CD4⁺PBLs from the patients was negative. The percentages of CD4⁺CD25⁺ T cells in PBLs cultured with SKOV3 supernatant elevated significantly compared with those without supernatant whether PHA was added or not (P = 0.001 and 0.001, respectively). Conclusion: There is an increasing of the proportion of CD4⁺CD25⁺ Tregs in PBLs, TILs and TALs of the patients with ovarian carcinoma, which probably results from up-regulation of soluble factor secreted by ovarian carcinoma cells.     

人细胞毒T淋巴细胞杀伤胃癌细胞及诱发凋亡的实验研究

目的　测定特异性细胞毒 T淋巴细胞 (CTL )对胃癌细胞的体外杀伤活性及观察形态学改变。方法　用分离胃腺癌患者的癌细胞经丝裂霉素 C处理后 ,作为抗原与抗CD3单克隆抗体、重组白细胞介素 - 2刺激患者自体外周血单个核细胞 ,体外诱导 CTL,用 MTT比色法测定 CTL 对自体癌细胞、人胃癌细胞株 (BGC- 82 3和 MGC- 80 3)的体外杀伤活性。将 CTL与 BGC- 82 3共同温育 ,通过透射和扫描电镜观察杀伤靶细胞的形态改变。结果　 CTL对自体胃癌细胞有特异性杀伤作用 ,可使靶细胞凋亡或溶解坏死。结论　体外混合细胞培养诱导出的 CTL,对靶细胞有明显的杀伤作用     

三氧化二砷对大肠癌LoVo细胞的影响及其与5-Fu的协同作用

目的：观察三氧化二砷(Arsenic Trioxide，As2O3)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用，并研究其和5-氟脲嘧啶(5-FU)的协同作用。方法：用MTT法检测细胞的体外生长抑制情况。用光镜、电镜观察细胞的形态学变化，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：As2O3对LoVo细胞的抑制作用随着浓度和作用时间的增加而增大，通过光镜、电镜可观察到细胞的凋亡。经流式细胞仪检测As2O3作用后的肿瘤细胞，G0/G1细胞从42．3％下降到31．3％，S期细胞从39％上升到62％。药物作用48h，As2O3(0．3mg／L)组抑制率为30．38％，而联合治疗组抑制率增至73．75％。结论：As2O3对LoVo细胞具有杀伤作用，其对LoVo细胞生长抑制的影响主要作用于G0／G1期细胞。As2O3与5-FU对大肠癌LoVo细胞具有协同作用。     

The effect of anti-CD28 on the CD3-AK proliferation and tumoricidal activity

Objective

The aim of this study was to costimulate the CD3-AK cells with anti-CD28 monoclonal antibody (mAb), observe the effect of cell proliferation and cytotoxicity and explore the regulatory role of CD28 mAb on the CD3-AK tumoricidal activity.

Methods

To prepare CD3-AK cells, observe the number and morphology of the activated T cells with the inverted microscope and detect the inhibitory rate of the myeloma cells by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT).

Results

Adding the anti-CD28 mAb to the CD3-AK cells, the number of cells increased significantly (P < 0.05) and the cytotoxic activity of the cells was significantly higher (P < 0.05).

Conclusion

The addition of anti-CD28 mAb has a strong synergistic effect, which can effectively enhance the tumoricidal activity of CD3-AK.     

CD/5-FC系统对小鼠胃癌细胞杀伤作用的研究

目的：探讨CD5／5－FC自杀基因系统对小鼠胃癌细胞的体外杀伤作用及其机制。方法：以逆转录病毒载体介导CD基因转导小鼠胃癌细胞株MFC,采用MTT法测定CD／5－FC系统的体外杀伤作用及其“旁观者”效应;利用Hoechst 33258荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法检测凋亡细胞,同时采用半定量RT－PCR技术检测凋亡相关基因的表达。结果：转导CD基因可使MFC对5－FC高度敏感,并且显示出强大的“旁观者”效应。经5－FC作用后,荧光染色可见到典型的凋亡细胞核形态学改变,琼脂糖凝胶电泳出现典型的DNA梯度,同时发现凋亡相关基因bcl-2基因表达下调,而bax与caspase-3基因表达上调。结论：CD／5－FC自杀基因系统对小鼠胃癌细胞MFC具有强大的杀伤作用,体外杀伤作用是通过诱导MFC的凋亡来完成。