癌钙调蛋白／鱼精蛋白截短体融合基因在原核表达载体中的构建及鉴定

目的在原核表达载体中构建癌钙调蛋白（OM）／鱼精蛋白截短体（tp）融合基因,进行基因测序鉴定。方法提取SD大鼠腹腔巨噬细胞,并进行细胞计数,经巨噬细胞特异性抗体CD68鉴定。设计引物扩增OM基因,并在其3’端引入印的编码基因,经PCR扩增获得OM／tp融合基因,通过中间载体PUC57进行目的基因克隆,将阳性克隆质粒酶切,与原核表达载体PET32a连接,转化大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,小量提取质粒,送样经公司测序鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳获得OM／tp目的基因,与预期的目的基因大小一致,回收目的基因与中间载体PUC57连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α后,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PUC57-OM／tp,经测序鉴定后与预期的序列一致。质粒PUC57-OM／tp酶切后与载体PET32a连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,菌检PCR获得约500bp的阳性克隆,与预期大小一致。抽提质粒PET32a—OM／tp经测序后与预期的序列一致。结论OM／tp融合基因的成功构建,为该融合蛋白促进视神经损伤后再生的研究奠定了基础。     

癌钙调蛋白在神经系统及视神经再生方面的研究进展

癌钙调蛋白（OM）是钙结合蛋白家族中的一员,属于肌钙蛋白c超家族,它具有不同于其他钙结合蛋白的特异性钙结合（CD）区域。通过研究其结构和分布特征,发现OM在调节细胞的电活动、调控细胞内信号传导通路及细胞周期等方面发挥着重要的作用。近年来,OM在促进神经轴突再生方面的研究是目前研究的热点之一,尤其是在视神经再生的研究方面取得了一定的成绩,并有待运用于临床。OM促进视神经再生的作用为解决脊髓和脑神经的再生性难题打下了基础。对OM的概念、组织的分布、主要的作用及机制、与视神经再生的关系方面进行综述。     

晶体钙—钙调蛋白的研究

钙－钙调蛋白（Ｃａ－ＣａＭ）系统有以下特征：它普遍存在于动物细胞，是“恐吓”信使，过量时将导致细胞死亡；是活泼的信使，瞬间的变化可引起持久反应，常与环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）信使系统共同作用。晶体Ｃａ－ＣａＭ涉及晶体诸多方面的生理功能，高钙与多种白内障有关，已有大量的有关报道，特别就其生物功能和白内障的发生机制进行了较多的研究。     

癌钙调蛋白在炎症反应促视神经再生作用中的研究进展

癌钙调蛋白(oncomodulin,OM)作为钙结合蛋白的一种,逐渐为我们熟知.近年来有研究证实,OM源于活化的炎症细胞(中性粒细胞),是体内先天免疫系统和神经元之间一种有效的生长促进信号,通过炎症反应诱导的OM是受损视神经轴突再生的关键.OM的促视神经轴突再生作用逐渐成为研究的热点之一.本文就近年来OM作用机制和炎症诱导下OM与视神经再生关系方面的研究和进展做一综述.     

钙调蛋白在大鼠晶状体生长发育和白内障形成中作用的研究

目的 探讨钙调蛋白(CaM)活性变化在大鼠晶状体生长发育和白内障形成中的作用。方法 从大鼠脑组织中提取钙调蛋白，从牛心中提取钙调蛋白依赖型磷酸二酯酶(PDE-I)，测定不同生长发育阶段和硒性白内障大鼠晶状体中钙调蛋白的相对活性。结果 钙调蛋白相对活性随大鼠年龄增长下降，硒性白内障晶状体中钙调蛋白相对活性高于同年龄正常晶状体。结论 钙调蛋白参与晶状体的生长发育过程，钙调蛋白相对活性升高是白内障形成的原因之一。     

rhLEDGF p52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

目的 :构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体 , 获得rhLEDGF p52 蛋白。方法:利用基因重组技术将 rhLEDGF p52 基因构建于原核表达载体 pET30a( )中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过 IPTG 诱导在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对 rhLEDGF p52 进行鉴定并用 Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化。结果:成功构建 rhLEDGF p52 基因原核表达载体,在大肠杆菌 BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGF p52蛋白表达量占菌体蛋白总量的 34.63%。Western Blot 结果显示 rhLEDGF2 蛋白能够特异性与 LEDGF-ab 结合。Ni-NTA His.Bind.Resin 方法进行纯化后的 rhLEDGF p52,终浓度达 520mg/L,分析其纯度达 87.93%。结论:获得 rhLEDGF p52 蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

SPARC—与角膜创伤修复有关的钙调蛋白

在鼠和人体内SPARC氨基酸序列高度保守,序列同源性为92%,SPARC在眼的许多组织有较高水平表达。内皮损伤、屈光性角膜手术后,角膜上皮和内皮细胞质可见SPARC的出现,SPARC能通过细胞外基质调节细胞与基质间的相互作用,诱导细胞呈圆形;促进培养的内皮细胞和成纤维细胞重排,在损伤部位由成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞表达,这些细胞从事于基底膜的合成和重建;以Ca^2 依赖方式特异性结合Ⅲ、Ⅳ型胶原,参与细胞外基质装配、更新或重建的钙依赖性的过程;指导细胞迁移或增殖,介导角膜上皮和角膜基质间相互作用过程,作为一种修复因子参与角膜创伤修复过程,包括角膜植物免疫过程、角膜物理化学损伤等过程。     

rhLEDGF P52基因原核表达载体的构建、诱导表达及蛋白纯化

目的构建rhLEDGFp52基因原核表达载体,获得rhLEDGFp52蛋白。方法利用基因重组技术将rhLEDGFp52基因构建于原核表达载体pET30a(+)中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确后,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,经免疫蛋白印迹试验对rhLEDGFp52进行鉴定并用Ni-NTAHis.Bind.Resin方法进行纯化。结果成功构建rhLEDGFp52基因原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性形式表达,rhLEDGFp52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%.WesternBlot结果显示rhLEDGF2蛋白能够特异性与LEDGF-ab结合。Ni-NTAHis.Bind.Resin方法进行纯化后的rhLEDGFp52,最终质量浓度达520mg·L-1,分析其纯度达87.93%.结论成功获得rhLEDGFp52蛋白,这为深入研究其生物学功能奠定了基础。     

大鼠PEDF基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

目的构建PEDF基因腺病毒表达载体，为基因治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）奠定基础。方法从大鼠视网膜组织中提取总RNA，RT—PCR扩增PEDF基因cDNA，并将回收的PEDF基因克隆人质粒pGEM—Teasy载体中，亚克隆人腺病毒表达载体质粒pDC316中，DNA序列分析加以证实。利用腺病毒Admax系统，通过含有目的基因片段PEDF的穿梭载体pDC316／PEDF和病毒骨架质粒共转染293细胞的方法包装出重组腺病毒AdPEDF。Western Blot对重组腺病毒进行鉴定。结果基因测序表明PEDF基因包含了大鼠PEDF基因阅读框内的全部序列，与NCBI Sequence Viewer中公布的大鼠PEDF mRNA序列（NM-177927）完全一致。获得了表达PEDF蛋白的重组腺病毒。结论成功构建了PEDF基因腺病毒表达载体，为进一步研究基因治疗脉络膜新生血管奠定了基础。     

大鼠FOXP3基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建大鼠F0XP3真核表达载体,为转基因治疗角膜移植免疫排斥反应提供实验基础.方法 采用RT-PCR技术从SD大鼠脾脏扩增FOXP3基因,EcoRI、xhoI双酶切peDNA3.1载体和FOXP3,DNA连接酶连接,构建pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体,测序鉴定.结果 从大鼠脾细胞中成功克隆获得了1290bp的FOXP3基因,测序结果表明正确构建了含有FOXP3基因的pcDNA3.1-FOXP3真核表达载体.结论 成功构建了真核表达载体pcLDNA3.1-FOXP3,为进一步研究其对角膜移植免疫排斥反应的影响奠定了基础.     

P21-GFP融合基因表达载体的构建与在视网膜色素上皮细胞的表达定位

目的构建绿色荧光蛋白GFP—p21融合基因表达载体,并观察其在人视网膜色素上皮细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对视网膜色素上皮细胞细胞周期的影响提供实验基础。方法以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21 cDNA,应用基因重组技术与GFP基因融合,构建以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的重组表达质粒pGFP—p21。利用脂质体转染体外培养的人视网膜色素上皮细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pGFP—p21融合蛋白在细胞中的分布和定位,用Western Blot方法分析其蛋白的表达。结果①酶切、DNA测序均证实插入片断的正确性。②荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP—C1转染组中,细胞内绿色荧光呈弥散分布;重组质粒pGFP—p21转染组中,绿色荧光主要集中在细胞核内。③Western Blot证实了pGFP—P21融合基因的表达。结论成功的构建了pGFP—p21质粒。视网膜色素上皮细胞能高效表达pGFP—p21融合基因,且主要定位于细胞核内,与p21基因的表达方式相同。     

大鼠opticin表达基因小发夹RNA真核表达质粒的构建及鉴定

　　目的　构建针对大鼠opticin表达基因(OPTC)的特异性小发夹RNA(shRNA)真核表达质粒。方法　用DNA重组技术将针对大鼠OPTC基因不同位点所设计的4个shRNA序列克隆到真核表达质粒中。根据构建的4对质粒设置shRNA-1组、shRNA-2组、shRNA-3组、shRNA-4组,同时只加转染试剂不加质粒的细胞设为正常对照组,转染阴性质粒的细胞为阴性对照组。用脂质体lipofectimine 2000将4个shRNA质粒分别转染至体外培养的原代大鼠睫状体非色素上皮(NPE)细胞,转染后采用半定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测OPTC基因的mRNA及opticin蛋白的相对表达量和抑制率。结果　各组质粒转染大鼠NPE细胞后,shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4组细胞OPTC mRNA相对表达较正常对照组均明显下调(F=10.239,P＝0.000),各组OPTC mRNA抑制率为85.7%、62.87%、54.87%、48.77%。各质粒干扰组细胞opticin蛋白表达较正常组均有不同程度下降(F=17.870,P=0.000),各组opticin蛋白抑制率为78.7%、34.6%、31.1%、16.8%。结论　OPTC基因干扰质粒shRNA-1可以有效抑制大鼠睫状体NPE细胞opticin的表达。      

应用基因芯片筛查鼻息肉相关差异表达基因

目的应用基因表达谱芯片筛查鼻息肉相关差异表达基因。方法采用含有人类全长基因的寡聚核苷酸芯片检测6例鼻息肉组织、6例正常鼻黏膜组织的相关差异表达基因,选择部分差异表达基因进行RT-PCR验证。结果筛查出鼻息肉组织差异表达基因共1886条,共同差异表达基因18条,上调基因12条,下调基因6条,包括编码横跨膜4超家族蛋白、IFN-γ诱导蛋白IP-30前体、补体因子前体、胰岛素生长因子结合蛋白、IL-8、RGS1、GRRK4、CCL20、子宫球蛋白等基因。RT-PCR测定差异表达基因IL-8、RGS1与基因芯片检测结果一致。结论鼻息肉基因表达谱存在差异,RGS1通过影响细胞信号传导通路发挥作用,IL-8促使炎性细胞释放多种炎性递质参与鼻息肉发病,IFN-γ诱导蛋白和胰岛素生长因子结合蛋白等基因在鼻息肉发病中起重要作用。     

利用基因芯片技术对大鼠角膜新生血管基因表达谱的研究

目的 运用基因芯片技术研究大鼠角膜新生血管的基因表达谱。方法40只SD大鼠在实验眼角膜缝线后第4d和第12d处死。用有5705条基因的Oligo芯片检测角膜组织的基因表达谱。结果缝线后第4d，5705条基因中，差异表达基因为57条，其中上调29条，下调28条（ratio〉4或〈0．25）。上调明显的基因有SCYA2、S100A9、MMP-3、TIMP-1、ILIR2等；下调明显的基因有GALE、GATM和GALDl等。缝线后第12d，差异表达基因为38条，其中上调34条，下调4条。上调明显的基因有MMP-3、MMP-12、MMP-13、TIMP-1、SCYA2、S100A9等。下调明显的基因有ALDH1A1等。第4d和第12d上调的基因明显多于下调的基因。结论角膜新生血管的形成是许多不同因子共同调控的结果。     

大鼠β-防御素2真核表达载体构建及转染大鼠角膜上皮细胞的研究

目的：应用基因工程技术构建含大鼠β-防御素2(rat beta defensin 2,rBD-2)目的基因的真核重组质粒,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,检测目的基因在转染细胞中的表达,探讨应用该载体获得重组rBD-2在眼表细胞中表达的可行性,并为进一步研究rBD-2的体内外抗微生物活性提供实验基础,以期为感染性角膜病防治提供新方法。

方法：将采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成rBD-2 DNA片段连接到真核表达载体pIRES2-ZsGreen1的XhoⅠ与BamHⅠ酶切位点之间,构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组表达载体,重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,卡那霉素筛选出阳性克隆子,经酶切、测序鉴定重组载体构建成功后,采用脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,此处实验分为三组即重组载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染的大鼠角膜上皮细胞组、未转染的空细胞组以及空载体pIRES2-ZsGreen1所转染的大鼠角膜上皮细胞组,在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况,最后经实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测各组转染细胞中rBD-2基因mRNA的表达差异。

结果：成功构建pIRES2-ZsGreen1-rBD-2真核重组质粒,应用实时荧光定量RT-PCR相对定量法检测到重组质粒pIRES2-ZsGreen1-rBD-2转染组的大鼠角膜上皮细胞中rBD-2基因的mRNA表达水平明显多于另两组。

结论：应用基因工程技术构建的rBD-2真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-rBD-2,通过脂质体法转染大鼠角膜上皮细胞,能够使外源rBD-2基因在大鼠角膜上皮细胞中被转录成mRNA。     

CD105特异性shRNA表达质粒的构建和筛选

目的:使用Pgenesil-1质粒构建CD105RNA干扰重组体,在激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型中,筛选高效抑制CD105基因表达的shRNA。方法:根据CD105基因序列信息设计了3条shRNA以及1条非特异阴性序列,利用含U6启动子的表达质粒Pgene-sil-1构建其RNA干扰重组体。采用视网膜下注射的方法使shRNA表达质粒转染大鼠视网膜和脉络膜,观察质粒所携带绿色荧光蛋白基因表达情况。根据不同的表达质粒对BN大鼠CNV模型2wk时CD105基因mRNA表达的抑制效果与空白对照及仅加转染试剂组比较分析,筛选有效的抑制序列。结果:转染后1d,在荧光显微镜下可见有明显的绿色荧光分布于实验眼视网膜全层,包括RPE层。2~3wk荧光强度比1wk增强,并持续表达4wk。空白对照眼无绿色荧光表达。构建了3条CD105shRNA和阳性对照Pgenesil-HK,基因测序证实目的序列成功插入质粒Pgenesil-1中。研究发现不同的质粒转染后对CD105在CNV高峰期的表达干预效果不同。Pgenesil-eng2和Pgenesil-eng3可明显抑制CNV模型在2wk时CD105mRNA的表达,抑制效率分别为(78±5)%(P<0.01);(52±3)%(P<0.01)。转染Pgenesil-eng1,Pgenesil-HK组及仅加转染试剂组与空白对照组相比CD105mRNA表达水平无明显变化。结论:在阳离子脂质体辅助下,Pgenesil-1质粒可以成功地将目的基因转染至大鼠视网膜各层次,且表达强度高,时间长于4wk。Pgenesil-eng2能明显抑制BN大鼠视网膜组织CD105mRNA的表达。