siRNA沉默hTERT基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞hTERT的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对hTERT基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测hTERTmRNA表达水平，Westernblot检测hTERT蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制hTERT的表达，hTERTsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组hTERTmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的hTERTsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞hTERT的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。     

RhG-CSF对乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的影响

目的：探讨人重组粒细胞集落刺激因子（RhG-CSF）对乳腺癌细胞株MCF-7的增殖作用的影响。方法：体外培养人乳腺癌细胞株MCF-7,将含不同浓度RhG-CSF的培养液与MCF-7细胞共同培养不同时间,采用MTT比色法计算细胞生长增殖率;Anexxin V/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率。实验结果用SPSS.v16.0软件分析。结果：不同浓度RhG-CSF处理细胞后,可以显著促进MCF-7细胞株的增殖（P〈0.01）,且当浓度为10μg/L时增殖作用最强。同时各浓度的RhG-CSF亦可抑制MCF-7细胞凋亡（P〈0.01）。结论：RhG-CSF可以显著促进人乳腺癌细胞株MCF-7增殖。当浓度小于10μg/L时,增殖呈浓度依赖性。大于10μg/L时,增殖能力反而逐渐下降。同时RhG-CSF亦可抑制MCF-7细胞凋亡。     

靶向VEGF的不对称siRNA抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖

目的:探讨靶向血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果。方法:设计靶向VEGF的4种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),包括对称siRNA(siRNA21/21,siRNA23/23)与不对称siRNA(asymmetric siRNA,aiRNA;aiRNA21/23,aiRNA19/21)。siRNA转染入MCF-7细胞后,MTT及流式细胞术检测MCF-7细胞增殖及凋亡情况,RT-PCR、ELISA法检测MCF-7细胞中VEGF基因和蛋白的表达。结果:与对照组相比,aiRNA21/23、siRNA23/23、aiRNA19/21、siRNA21/21这4种siRNA都能有效抑制VEGF mRNA的表达[(71.4±5.01)%、(40.0±3.11)%、(37.2±2.79)%、(11.1±0.99)%vs(2.4±0.11)%,P<0.01],且抑制MCF-7细胞的增殖[(44.7±5.38)%、(38.5±5.67)%、(33.6±2.18)%、(33.1±3.18)%vs(2.2±0.28)%,P<0.01],其中以不对称aiRNA21/23的抑制效果最明显。与对照组比较,aiRNA21/23显著促进MCF-7细胞的凋亡[(49.9±4.02)%vs(4.7±0.91)%,P<0.01]。结论:靶向VEGF基因的siRNA可抑制MCF-7细胞的增殖、促进细胞凋亡,尤以不对称siRNA的效果最明显。     

RNA干扰对乳腺癌MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用

目的：为探索治疗乳腺癌新途径，研究RNA干扰（RNA interferance，RNAi）对MCF-7细胞株WT 1基因表达的抑制作用。方法：设计制备多对针对WT 1基因的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），转染MCF-7细胞，采用实时定量PCR（real—time quantitative polymerase chainreaction，RQ-PCR）法测定WT1 mRNA的表达，western blot测定WT1蛋白的表达，流式细胞仪检测加入长春新碱后的MCF-7细胞凋亡率。结果：siRNA能有效抑制WT1基因的表达，但不呈剂量关系，在较低浓度可维持RNAi至少4d时间，WT1基因表达下调的MCF-7细胞凋亡率增加。结论：RNAi能有效抑制MCF-7细胞中WT1基因的表达，同时转染siRNA后细胞对长春新碱敏感。     

LRP16基因在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

背景与目的:既往研究表明雌激素通过其受体!直接上调LRP16的表达,LRP16基因的高表达促进乳腺癌细胞的增殖。本研究旨在探讨LRP16基因在乳腺癌组织中的表达状况及其与临床病理特征的关系。方法:收集52例乳腺癌组织及其配对癌旁组织,Northernblot与半定量RT-PCR法分别检测22例和30例标本中LRP16mRNA水平。免疫组化法检测肿瘤组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及Ki-67的表达情况。结果:Northernblot检测结果表明,22例癌组织LRP16mRNA的表达较癌旁组织高2倍的有9例,高表达率为40.9%(9/22)。高表达LRP16的9例中有7例ER阳性,8例PR阳性;而非高表达13例中ER阳性6例,PR阳性5例,两组ER与PR阳性率均有显著性差异(P<0.05)。LRP16高表达的9例中只有1例PR和ER同时阴性,而非高表达的13例中有7例。22例患者中,13例肿瘤直径3.0～4.5cm,其中LRP16基因高表达组占8例;有腋窝淋巴结转移的12例中8例LRP16高表达。8例高表达Ki-67患者中6例LRP16高表达。半定量RT-PCR检测结果表明,30例肿瘤标本中9例(30.0%)LRP16mRNA的表达水平明显高于癌旁组织,9例LRP16高表达者ER、PR均阳性,Ki-67高表达,且瘤体直径均大于3.5cm,均有腋窝淋巴结转移,与非高表达组比较差异有显著性(P<0.05)。结论:LRP16基因表达水平与ER/PR阳性率、细胞增殖活性、肿瘤直径、远处淋巴结转移密切相关,提示LRP16基因可能参与促进乳腺癌的增殖与转移。     

RNA干扰RSK4基因表达对裸鼠移植瘤生长与转移影响观察

目的：应用慢病毒干扰载体（RSK4-RNAi—LV）干扰RSK4基因在乳腺癌细胞株MCF-7中的表达,研究RSK4基因被干扰后对裸鼠移植瘤生长及转移的影响。方法：将转染了siRNA（RSK4-RNAi—LV）的MCF-7细胞组（实验组）、转染了siRNA（NC—GFP-LV）的MCF_7细胞组（阴性对照组）和未转染的MCF-7细胞组（空白对照组）分别接种至裸鼠乳腺脂肪垫下,建立裸鼠移植瘤模型,观察每纽裸鼠移植瘤生长情况;应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测3组移植瘤组织中RSK4mRNA及其蛋白的表达;HE染色观察3纽裸鼠内脏转移情况。结果：实验纽的移植瘤平均体积为（2264．08±367．47）mm2,明显大于阴性对照组（843．67±318．13）mm。及空白对照组的（720．45±241．35）mm。差异有统计学意义,F=112．425,P=0．02;实验组瘤体平均体质量为（1．44±0．25）g,明显重于阴性对照组（0．73±0．20）g及空白对照组的（0．70±0．21）g,差异有统计学意义,F=89．54,P=0．01。实验组裸鼠移植瘤肺转移6只,空白对照及阴性对照组各1只。实验组肿瘤组织RSK4mRNA的相对表达量为0．140±0．843,明显低于阴性对照组的1000±0．000（P=0．008）和空白时照组的0．878±0．689（P=0．005）。实验组、阴性对照组和空白对照组RSK4蛋白的表达量分别为0．138±0．023、0．532±0．032和0．465±0．057,3组间差异有统计学意义,F=73．1,P=0．003;实验组RSK4蛋白表达量明显低于阴性对照组（P=0．006）和空白对照组（P=0．012）。结论：慢病毒干扰MCF-7细胞中RSK4基因表达能促进MCF-7细胞裸鼠移植瘤的生长及转移。     

沉默HuR的表达增加人乳腺癌耐药MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性

目的：研究RNA干扰人抗原R（human antigen R,HuR）基因的表达对人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adr对多柔比星（doxorubicin）敏感性的影响。 方法： 构建靶向 HuR基因 的shRNA表达质粒（pGenesil-siHuR）,稳定转染至MCF-7/Adr细胞,real-time PCR检测细胞中 MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测MCF-7/Adr细胞中由 MDR1 基因编码的P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）的表达,MTT法检测pGenesil-siHuR 转染后MCF-7/Adr细胞在多柔比星作用后的存活率和IC50,流式细胞术检测MCF-7/Adr细胞的凋亡率。 结果： 与未转染的MCF-7/Adr细胞比较,pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞中 MDR1 mRNA的表达水平明显减低\[（0184±0.029） vs （1.203±0.026）,P<0.01\],P-gp表达水平明显降低。pGenesil-siHuR质粒转染MCF-7/Adr细胞后,MCF-7/Adr细胞对多柔比星的IC50从未转染的(148.2±2.3）nmol/L降至(42.9±0.4）nmol/L;经多柔比星处理后,pGenesil-siHuR质粒转染组MCF-7/Adr细胞的凋亡率明显上升\[（34.6±1.1）% vs （1.1±0.2）%,P<001\]。 结论： RNA干扰HuR的表达能抑制 MDR1基因 的表达,增加耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞对多柔比星的敏感性。     

利用siRNA阻抑survivin基因表达诱导乳腺癌细胞系MCF-7细胞凋亡的研究

背景与目的:survivin属IAP基因家族成员,表达于多种肿瘤组织中,能促使细胞逃避凋亡,并促进细胞的异常有丝分裂。本研究旨在探讨敲除survivin基因后,癌细胞的增殖和凋亡情况。方法:利用RNAi阻抑人乳腺癌细胞内survivin基因的表达,RT-PCR和Westernblot法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达,MTT法检测细胞生长增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:survivinsiRNA转染组,survivin基因表达水平与未转染组比较下调了64%。随着siRNA浓度的增加,细胞增殖抑制率逐渐增高,200nmol/L剂量组细胞增殖抑制率最高,可达60.9%。不同浓度的siRNA可不同程度地诱导细胞凋亡,200nmol/L剂量组凋亡率最高,可达29.0%。结论:survivinsiRNA有可能成为治疗乳腺癌的新药物。     

Knockdown of c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast tumor cells growth in vitro and in vivo

IntroductionBreast cancer is the leading cause of cancer death in women worldwide. Elevated expression of c-Myc is a frequent genetic abnormality seen in this malignancy. For a better understanding of its role in maintaining the malignant phenotype, we used RNA interference (RNAi) directed against c-Myc in our study. RNAi provides a new, reliable method to investigate gene function and has the potential for gene therapy. The aim of the study was to examine the anti-tumor effects elicited by a decrease in the protein level of c-Myc by RNAi and its possible mechanism of effects in MCF-7 cells.MethodA plasmid-based polymerase III promoter system was used to deliver and express short interfering RNA (siRNA) targeting c-myc to reduce its expression in MCF-7 cells. Western blot analysis was used to measure the protein level of c-Myc. We assessed the effects of c-Myc silencing on tumor growth by a growth curve, by soft agar assay and by nude mice experiments in vivo. Standard fluorescence-activated cell sorter analysis and TdT-mediated dUTP nick end labelling assay were used to determine apoptosis of the cells.ResultsOur data showed that plasmids expressing siRNA against c-myc markedly and durably reduced its expression in MCF-7 cells by up to 80%, decreased the growth rate of MCF-7 cells, inhibited colony formation in soft agar and significantly reduced tumor growth in nude mice. We also found that depletion of c-Myc in this manner promoted apoptosis of MCF-7 cells upon serum withdrawal.Conclusionc-Myc has a pivotal function in the development of breast cancer. Our data show that decreasing the c-Myc protein level in MCF-7 cells by RNAi could significantly inhibit tumor growth both in vitro and in vivo, and imply the therapeutic potential of RNAi on the treatment of breast cancer by targeting overexpression oncogenes such as c-myc, and c-myc might be a potential therapeutic target for human breast cancer.     

siRNA沉默HYAL1基因表达对人乳腺癌细胞生长和增殖的影响

背景与目的：有研究证实透明质酸酶（hyaluronidase,Hyase）与人乳腺癌的恶性潜能相关。本研究拟探讨RNA干扰是否能有效抑制Hyde基因HYAL1的表达以及人乳腺癌细胞的生长和增殖。方法：体外化学合成HYAL1序列特异性双链RNA（dsRNA）,在脂质体（SiPORT Lipid）的介导下转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-453S、ZR-75和ZR-75-30。荧光共聚焦显微镜下观察转染效率,RT-PCR分析HYAL1 mRNA的表达,MTT测定细胞的增殖,流式细胞仪测定细胞周期。结果：（1）HYAL1-siRNA能有效地封闭HYALl基因的表达．使HYAL1 mRNA相对水平明显降低（P〈0．05）;（2）HYAL1-siRNA能明显抑制细胞增殖（P〈0．05）;（3）HYAL1-siRNA使细胞周期G0／G1期细胞百分比明显增加,S期的细胞百分比显著减少（P〈0．05）。结论：siRNA-HYAL1能有效抑制人乳腺癌细胞株HYAL1基因的表达,抑制细胞增殖,将更多的细胞阻滞在G0／G1期。     

Increased AP-1 activity in drug resistant human breast cancer MCF-7 cells

The expression, DNA binding, and transactivating activity of activator protein 1 (AP-1) was examined in a series of multidrug resistant (MDR) MCF-7 human breast cancer cells that have increasing levels of MDR1 gene expression. We observed an increase in the amount of both c-jun and c-fos mRNA in cells with 12-, 65-, or 200-fold higher resistance to adriamycin when compared to drug-sensitive MCF-7 wild type (WT) cells. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) demonstrated an increase in the DNA binding activity of an AP-1 complex in nuclear extracts from MDR MCF-7 cells when compared to extracts from WT cells. We observed a proportional increase in luciferase expression from a reporter vector containing consensus AP-1 binding sites in transiently transfected MDR cells when compared to WT cells, indicating that AP-1 mediated gene expression is increased in drug-resistant MCF-7 cells. Since the MDR1 promoter contains a putative AP-1 binding site, we used EMSA to examine AP-1 binding activity to an oligonucleotide probe that contained the relevant MDR1 promoter sequences (–123 to –108). Nuclear extracts from resistant MCF-7 cells displayed an increased level of DNA binding of Jun/Jun dimers to the probe, indicating that AP-1 was capable of binding to this promoter site. A luciferase reporter construct containing triplicate copies of the MDR1 promoter sequence was expressed at higher levels in transiently transfected MDR cells when compared to expression in WT cells. Co-transfection of WT cells with a c-jun expression vector and either of the AP-1 luciferase constructs demonstrated that c-jun could activate gene expression from both the consensus and the MDR1 AP-1 sites in a dose dependent manner. In addition, RT-PCR and western blot analysis showed that levels of MDR1 mRNA and Pgp were increased in c-jun transfected WT cells. Taken together, these data indicate that increased AP-1 activity may be an important mediator of MDR by regulating the expression of MDR1.     

多药耐药乳腺癌细胞MCF-7/Adr中体外转录的小分子干扰RNA(siRNA)对mdr1基因的干扰作用

目的 探讨多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／Adr中体外转录的小分子干扰RNA（siRNA）对mdr1基因的干扰作用。方法将siRNA转染多药耐药乳腺癌细胞MCF-7／Adr后，采用共聚焦荧光显微镜、Northernblot和Westernblot分析siRNA在蛋白和mRNA水平对mdr1基因的静止作用；并用MTT法测定siRNA处理后阿霉素对MCF-7／Adr细胞的杀伤作用。结果 特异性siRNA能明显抑制P170蛋白表达及其mRNA，并能明显提高阿霉素对MCF-7／Adr细胞的杀伤作用。结论 siRNA能逆转细胞耐药性，可能将为肿瘤耐药的治疗提供又一新技术。     

MST1 基因对乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的影响

目的:探讨 MST1 ( mammalian sterile 20-like kinase 1)基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖与凋亡的影响.方法:构建含有标签蛋白FLAG的MST1质粒pCMV-FLAG-MST1;将构建好的pCMV-FLAG-MST1质粒在脂质体lipofectamine 2000的介导下转染MCF-7细胞,通过Western 印迹法分析MST1在MCF-7中的表达情况;分别在转染后12、24、36和48 h通过MTT法观察MST1对细胞增殖的影响;转染后36 h加入5-溴-2'脱氧尿嘧啶(bromodeoxy uridine,BrdU),通过其掺入比率显示MST1对细胞增殖的影响;转染后36 h加入顺铂,作用14 h后通过Annexin Ⅴ检测其对细胞凋亡的影响.结果:成功构建 pCMV-FLAG-MST1质粒;MTT及BrdU检测显示,转染pCMV-FLAG-MST1质粒后 MCF 7细胞增殖明显受到抑制;Annexin Ⅴ检测结果提示,高表达MST1后,细胞的凋亡率相对增高.结论:在乳腺癌细胞MCF 7中高表达MST1,不仅可以抑制细胞增殖,还可以促进细胞凋亡.     

小干扰RNA靶向MIF对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响#br#

目的探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响。 方法取对数生长期的SGC 7901细胞,采用脂质体法分别转染靶向人MIF的siRNA（siMIF组）或阴性对照序列（NC组）,48 h后采用Western blotting检测MIF蛋白的表达情况,MTT法观察转染后24、48、72 h的细胞增殖情况,流式细胞仪检测转染后72 h的细胞凋亡率,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达变化。 结果siMIF组转染48 h后的MIF相对表达量为0321±0104,低于NC组的1078±0212,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组转染48～72 h后的细胞增殖率低于NC组,差异有统计学意义（P＜005）。转染MIF siRNA 72 h后,siMIF组的细胞凋亡率为（235±36）％,高于NC组的（47±17）％,差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组Bcl 2的相对表达量为0663±0209,低于NC组的1129±0178,而Bax相对表达量为0981±0225,高于NC组的0587±0254,以上差异均有统计学意义（P＜005）。 结论siRNA靶向沉默MIF能够降低SGC 7901细胞中MIF蛋白表达,抑制SGC 7901细胞的增殖并促进凋亡,在胃癌的靶向治疗中有一定前景。     

survivin基因的RNA干涉抑制人乳腺癌SKBr-3细胞体外增殖的作用

目的:研究RNA干涉(RNAinterference,RNAi)抑制survivin基因表达后对人乳腺癌SKBr3细胞体外增殖能力的影响。方法:通过RTPCR和间接免疫荧光检测转染survivin靶向的小干涉RNA表达载体pSUPERS1后SKBr3细胞中survivin基因的表达;集落形成实验、MTT比色法检测细胞体外增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期。结果:转染pSUPERS1后,SKBr3细胞中survivin的mRNA和蛋白表达水平明显降低;克隆形成率(38±16.70)%比对照组(90.3±4.04)%显著降低;细胞增殖减慢,主要阻滞于G1期(74.03±8.91)%。结论:RNA干涉沉寂survivin基因表达后明显抑制了人乳腺癌SKBr3细胞的体外增殖能力。     

甲异靛对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡影响的实验研究

目的：研究甲异靛对人乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。方法：采用MTT法检测甲异靛对MCF-7乳腺癌细胞的增殖抑制;流式细胞仪测定细胞凋亡率;光学显微镜观察细胞形态的变化;westernblot法测定caspase-3、PARP及bcl-2表达。结果：甲异靛能明显抑制MCF-7乳腺癌细胞增殖。甲异靛诱导MCF-7细胞凋亡,呈现典型细胞凋亡的形态变化,并呈时间和剂量依赖性,凋亡率最高可达（68.40±4.87）%,在细胞凋亡过程中出现PARP分子断裂和bcl-2下调,未检测到caspase-3。结论：甲异靛能诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡抑制细胞增殖,其发生机制可能与下调bcl-2有关。