GM-CSF重组腺病毒转染外周血树突状细胞的研究

目的:利用GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,诱导培养树突状细胞(dendriticcell,DC),并与细胞因子培养的DC进行生物学特性的比较。方法:将GMCSF重组腺病毒转染正常人外周血单核细胞,或用重组细胞因子GMCSF,诱导培养获得DC,通过相差显微镜观察DC表面形态变化,FACS分析GMCSF基因转染对DC表面免疫分子表达的影响,Westernblot鉴定GMCSF的表达,ELISA检测IL12分泌水平,MTT法检测DC激发同种异体T细胞增殖的能力。结果:GMCSF重组腺病毒转染外周血单核细胞,能扩增获得DC,该DC高表达CD1a、HLADR、CD80和CD86等免疫分子,并表达细胞因子GMCSF和IL12,对同种异体淋巴细胞有更强的刺激活性。结论:用GMCSF重组腺病毒可从外周血单核细胞中扩增到DC,为DC瘤苗临床应用提供实验基础。     

皮肤T细胞淋巴瘤的免疫治疗

阐述免疫治疗包括细胞因子[白介素—2(IL—2)、白介素-12(IL—12)]、免疫核素(^131I—T101)、免疫毒素IL—2—融合毒素(DAB389-IL2)]、单克隆抗体抗CD5(T101)和某些新的局部免疫调节剂(如CTLA4—1g、LFA-tip、BCX—34)、维甲酸类药物如targretin、panretin与光效应药物如hypercin或δ—ALA试治皮肤T细胞淋巴瘤。     

逆转录病毒载体介导人 GM-CSF 基因在 HL-60 白血病细胞的高效转移和表达

目的探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性，为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７，获得重组逆转录病毒，将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞，经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群，应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实，ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移并整合到ＨＬ－６０细胞基因组中，而未转基因和转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经ＰＣＲ检测未能扩增出特异性片段。经ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ－１检测，转基因细胞分泌的ＧＭ－ＣＳＦ生物学活性为６０～２００ｎｇ／ｍｌ（细胞１×１０６，培养２４小时），而未转基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞培养上清无ＧＭ－ＣＳＦ活性。结论逆转录病毒载体介导的ｈＧＭ－ＣＳＦ基因能在体外培养的人ＨＬ－６０白血病细胞中获得高效的转移和表达。     

重组溶瘤单纯疱疹病毒oHSV2 治疗结直肠癌的实验研究

  目的  评估重组溶瘤单纯疱疹病毒oHSV2在CT26结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤效果,初步探讨其治疗机制。  方法  构建CT26细胞荷瘤小鼠肿瘤模型。1）小鼠瘤内注射oHSV2,ELISA法测定血清中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macro-phage colony-stimulating factor,GM-CSF）浓度;2）荷瘤小鼠分为oHSV2组、5-氟尿嘧啶（5-FU）组（阳性对照组）、磷酸盐缓冲液（PBS）组（阴性对照组）。给药后,记录小鼠体质量、肿瘤体积、生存期及生活状态等变化,评估病毒抗肿瘤效果;3）流式细胞术定量检测肿瘤引流淋巴结（tumor-draining lymphnode,TDLN）内树突状细胞（dendritic cell,DC）及瘤体内CD4+T与CD8+T的比例。  结果  1）瘤内注射oHSV2后,血清中的GM-CSF浓度不断升高。首次给药后第8 天出现高峰（3150±327.1）pg/mL,后缓慢下降;2）相比PBS组,oHSV2和5-FU组均表现出显著的抗肿瘤效果,小鼠生存期显著延长（50 d vs. 36 d,P＜0.01;51 d vs. 36 d,P＜0.01）,但oHSV2治疗未引起小鼠体质量下降。治疗起始第28天,5-FU组平均体质量较PBS组有显著性差异（16.61 g vs. 22.07 g,P＜0.01）,oHSV2组与PBS组差异无统计学意义（P>0.05）,且小鼠病毒注射区皮肤无坏死、溃疡;3）流式分析结果显示相比PBS组,oHSV2治疗组的DC（6.49% vs. 3.73%,P＜0.01）,CD4+T（15% vs. 8.57%,P＜0.01）与CD8+T（8.19% vs. 5.15%,P＜0.01）比例升高。而5-FU组各细胞比例较PBS组明显降低（P＜0.05）。  结论  瘤内注射oHSV2有效抑制结直肠癌细胞生长,病毒治疗与化疗药物相比不伴有明显的毒副反应。病毒在荷瘤小鼠体内复制产生具有生物活性的GM-CSF,可增强抗肿瘤免疫。      

G-CSF与GM-CSF序贯联合治疗化疗后骨髓抑制的研究

目的　探讨粒细胞集落刺激因子 (G -CSF)和粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM -CSF)序贯联合治疗化疗后骨髓抑制的疗效。方法　采用随机单盲的方法 ,将化疗致骨髓抑制的 87例患者 ,分为G -CSF→GM -CSF组、GM -CSF→G -CSF组给药治疗。于用药后第 3、6、9、12、16、2 0天进行外周血白细胞、中性粒细胞、血小板计数。结果　用药后第 3天 ,白细胞计数 >8.0× 10 9/L者 ,共有 18例被退出 ,69例进入随后的研究。用药后第 6天 ,G -CSF→GM -CSF组的白细胞及中性粒细胞计数高于GM -CSF→G -CSF组 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;第 9、12天无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;第 16、2 0天 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 )。用药后 2组血小板计数均增高 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　G -CSF→GM -CSF序贯用药治疗肿瘤患者化疗后骨髓抑制的疗效优于GM -CSF→G -CSF ,而不良反应不加重     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

GM-CSF 基因修饰肿瘤细胞疫苗治疗前后黑素瘤患者CD8 +T细胞的变化及其对预后的影响

目的:探讨粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰的肿瘤细胞疫苗(GM-CSF modified tumor cell vaccine,GVAX)治疗前后黑素瘤患者外周血免疫指标的变化及其对预后的影响。方法:收集2007年10月至2012年12月期间于天津医科大学肿瘤医院接受GVAX治疗的56例黑素瘤患者,采用流式细胞技术检测患者治疗前后外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK)及树突状细胞(DC1和DC2)的比例,分析治疗前后外周血各免疫细胞比例的变化,并探讨其与患者预后的关系。结果:GVAX治疗后患者外周血CD8+T细胞比例较前升高[(37.56±12.76)%vs(34.71±12.30)%,P=0.006],CD4+T细胞比例降低[(53.44±13.36)%vs(56.27±13.15)%,P=0.017],CD4+/CD8+比值降低[1.61(1.37)vs 1.75(0.71),P=0.009]。治疗后CD3+T、NK、Treg、DC1、DC2与治疗前的差异无统计学意义(P>0.05)。晚期患者GVAX治疗前外周血CD8+T细胞比例大于均值组与小于均值组相比,中位生存时间显著延长(29.16 vs 13.34个月,P=0.012)。结论:GVAX治疗黑素瘤可增强CD8+T细胞为主的抗肿瘤免疫应答,晚期患者外周血CD8+T细胞比例可作为预测GVAX疗效的指标,为判断预后起到一定的提示作用。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人粒细胞 巨噬细胞集落刺 激因子(GM CSF)基因的重组腺病毒载体,为进 一步研究GM CSF基因在肿瘤基因治疗中的应 用提供实验基础。方法:采用PCR方法,从重 组质粒pcDNA3.1 GM CSF扩增出GM CSF 基因片段,通过穿梭质粒pShuttle,将带有CMV 启动子的目的片段克隆入Adeno X腺病毒 DNA中,获得重组腺病毒DNA,通过脂质体转 染HEK293细胞,经包装扩增后,获得重组腺 病毒Adeno X GM CSF,PCR鉴定,ELISA法 检测表达产物。结果:含GM CSF基因的重组 腺病毒Adeno X GM CSF构建成功,经PCR鉴 定和DNA测序等证实了其正确性,重组腺病毒 上清液中GM CSF表达量达26ng/mL。结论: 含GM CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

体外树突状细胞诱导细胞毒T淋巴细胞杀伤肺癌细胞A549的研究

 目的　研究负载有肺癌细胞株A549可溶性抗原并携带外源粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的树突状细胞（DC）在体外激活自身T淋巴细胞形成的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对A549细胞的杀伤作用。方法　用肺癌细胞株A549可溶性抗原致敏DC,再用含有GM-CSF外源基因的腺病毒感染DC,将所得的DC与T细胞混合培养以形成对A549细胞有特异杀伤作用的CTL。细胞分为未处理（N-DC）组、加抗原未感染病毒（A-DC）组和加抗原感染病毒（G-A-DC）组。通过测定乳酸脱氢酶（LDH）计算CTL对A549细胞的杀伤率。结果　当CTL与A549细胞,即效应细胞与靶细胞比值（E／T）为5∶1时,N-DC组的杀伤率为（1.9±0.7）%,A-DC组为（21.3±2.6）%,G-A-DC组为（34.5±4.9）%;当E／T为10∶1时,N-DC组的杀伤率为（4.8±0.8）%,U-DC组为（35.4±3.6）%,G-A-DC组为（51.3±2.9）%;E／T为20∶1时,N-DC组的杀伤率为（5.3±0.2）%,A-DC组为（40.5±7.7）%,G-A-DC组为（72.5±4.7）%。3组之间的杀伤率差异有统计学意义（n＝2,F＝356,P＜0.05）,通过两两比较,得出G-A-DC组的杀伤率高于其他两组（P＜0.001）,且A-DC组高于对照组（P＜0.001）。结论　以肺癌细胞株A549可溶性抗原致敏的DC可诱导出对A549具有特异杀伤作用的CTL,当所致敏的DC通过腺病毒感染而带有外源基因GM-CSF时,所诱导的细胞毒杀伤反应进一步增强。     

GM—CSF基因转染瘤苗预防性免疫保护作用的实验研究

为了观察低肿瘤负载时ＧＭＣＳＦ 基因转染瘤苗抗肿瘤作用及其效果。应用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭＣＳＦ）基因转染的、６０Ｃｏγ射线照射后制成的瘤苗,进行预防性免疫保护作用的研究;对荷瘤小鼠,手术切除肿瘤结节,研究该基因疗法对预防术后肿瘤复发的影响。结果表明, ＧＭＣＳＦ 基因转染瘤苗预防性免疫治疗后,能诱导小鼠产生特异性免疫反应,抵抗随后野生型亲本肿瘤细胞的攻击,并能有效地预防手术后肿瘤复发。以上结果揭示了应用该疗法进行肿瘤基因治疗的可行性。     

脑胶质瘤患者自体免疫治疗前后T细胞亚群的变化

 目的 探讨脑胶质瘤患者自体免疫治疗的临床应用，观察该治疗对T细胞亚群水平的影响。方法 试验组21例脑胶质瘤患者接受自体树突状细胞免疫治疗，对照组19例接受常规治疗，进行临床随访并检测两组T细胞亚群水平的变化。结果 试验组中位生存时间（29个月）远大于对照组（10个月），两组生存曲线分布差异有显著性意义（P〈0．05）。脑胶质瘤患者外周血中CD^3＋含量、CD^4＋含量以及CD^4＋／CD^8＋比值明显低于正常对照组（P〈0．01），免疫治疗后患者外周血CD^3＋、CD^4＋、CD^8＋含量以及CD^4＋／CD^8＋比值与对照组比较均增加（P〈0．05），但CD^4＋／CD^8＋比值仍低于健康成人组（P〈0．05）。结论 脑胶质瘤存在免疫功能抑制，自体树突状细胞肿瘤疫苗治疗可一定程度重建、增强机体肿瘤免疫应答，抑制脑胶质瘤的复发和进展，从而有效地延长脑胶质瘤患者的生存时间。     

Gene Gun Transfection of Human Glioma and Melanoma Cell Lines with Genes Encoding Human IL-12 and GM-CSF

We used particle-mediated gene transfer by a custom-built gene gun to transfect two well-established human glioma (D54MG and U251) and melanoma (SK mel 28 and Ed 141) cell lines, as well as two glioma lines locally established from primary patient tumors (Ed 147 and Ed 149). Using -galactosidase as a reporter gene, D54MG, U251, Ed 141 and SK mel 28 showed an average transfection efficiency of 15–40%, whereas Ed 147 and Ed 149 had mean transfection efficiencies of 3% and 5% respectively. Twenty-four hours after transfection with the gene encoding human interleukin-12 (IL-12), ELISA was performed on cell supernatants (mean of n=12 for each cell line). IL-12 expression was extremely variable between the different cell lines, ranging from 52 to 1151pg/10⁶ cells/24h. Results were very similar when cells were exposed to 20,000rads of gamma irradiation 2h after transfection. When the cell lines were transfected with human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, 24h levels were: 13.0 (Ed 147), 17.8 (Ed 149), 18.6 (Ed 141), 27.4 (D54MG) and 27.7ng/10⁶ cells/24h (U251). SK mel 28 produced 88.1ng/10⁶ cells/24h. We conclude that the gene gun can efficiently transfect a variety of immortalized, well-established and locally-established glioma and melanoma cell lines. High dose gamma irradiation does not adversely affect the expression of the foreign gene (IL-12) at 24h. Significantly, transfected cell lines show different levels of expression depending on the particular gene/plasmid introduced. Therefore, each cell line has to be assessed individually for the level of expression of each introduced gene.     

自体CIK细胞联合化疗治疗转移性肾癌的临床疗效

目的评价化疗联合自体CIK（cytokine-induced killer）细胞治疗转移性肾癌的临床疗效及安全性。方法19例转移性肾癌患者接受至少1周期的5-氟尿嘧啶和(或)吉西他滨（5-fluorouracil/gemcitabine,5-Fu/Gem）化疗,化疗结束后接受4～8次CIK细胞治疗,细胞回输后应用3天d1~d3白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）和胸腺肽α-1。结果19例患者中1例部分缓解（PR）,13例稳定（SD）,5例进展（PD）,疾病总控制率（CP＋PR＋SD）为73.68%。评价为PD的5例患者无进展生存期（PFS）为(4.43±2.85)月;其余14例患者PFS未到,中位PFS已达11.64月。结论CIK细胞联合化疗治疗转移性肾癌疗效确切,疾病控制率得到明显提高,患者带瘤生存时间明显延长。     

自体干细胞移植治疗T细胞淋巴瘤31例临床分析

目的 探讨自体干细胞移植治疗T细胞淋巴瘤的疗效和其预后因素.方法 回顾性分析31例给予自体干细胞移植治疗的T细胞淋巴瘤的临床资料,观察3年总生存率和无进展生存率,分析一般状况(PS)、乳酸脱氢酶(LDH)、移植前状况、分期、外周T细胞淋巴瘤预后指数(PIT)评分对生存的影响.结果 全组中位随访时间为28(5～68)个月...     

肿瘤抗原致敏树突状细胞治疗胶质瘤的实验研究

 目的　研究肿瘤冻融抗原致敏树突状细胞 (DC)治疗胶质瘤的疗效。方法　从大鼠骨髓中分离出单核细胞后 ,加入添加rGM CSF和rIL 4的IMDM培养基中培养后鉴定。制备大鼠C6胶质瘤冻融抗原以及DC疫苗 ,同时肿瘤冻融抗原致敏DC体外细胞毒试验 ;建立动物模型 ,体内应用DC疫苗并观察疗效。结果　单核细胞培养 8天后可获得大量的树突状细胞 ;体外细胞毒试验发现对相应的C6肿瘤细胞有明显的杀伤作用 ;动物实验发现治疗组肿瘤生长明显抑制 ,而对照组肿瘤明显生长 ,两组肿瘤体积有显著性差异P <0 .0 1。结论　建立了体外扩增大鼠骨髓DC以及制备DC疫苗的方法 ,采用冻融抗原致敏DC疫苗治疗荷瘤动物生存时间明显延长 ,肿瘤生长明显抑制 ,为研究其在脑胶质瘤临床免疫治疗打下基础     

Serial Transplantation of Adult T Cell Leukemia Cells into Severe Combined Immunodeficient Mice

The precise mechanism of the neoplastic cell growth of adult T cell leukemia (ATL) still remains unclear. In the present study, we have succeeded in serial transplantation of ATL cells from a patient into severe combined immunodeficient (SCID) mice. In this model, we found that only a leukemic cell clone from an ATL patient could be successively transplanted into SCID mice, although it was difficult to maintain leukemic cell clones in vitro , suggesting that the microenvironment provided by SCID mice is suitable for leukemic cell growth. We could not detect human T cell leukemia virus type I (HTLV-I) mRNA or interleukin 2 (IL-2) mRNA in either the tumor cells growing in mice or the original leukemic cells. Thus, it appears that neither HTLV-I viral expression nor the IL-2 autocrine mechanism is directly involved in the neoplastic cell growth of fresh ATL cells as well as HTLV-I-infected cell lines, at least in SCID mice. In addition, we could passage frozen cells and obtain a large number of expanded leukemic cells in this model. Such a serial transplantation model, which can avoid the changes in the nature of leukemic cells that are frequently observed in in vitro culture, and which can propagate leukemic cell clones, would be very suitable not only to study the mechanism of neoplastic cell growth, but also to test potential therapeutic agents for ATL.     

冻融抗原冲击致敏的树突状细胞对结肠癌小鼠的治疗作用

目的 :研究冻融的肿瘤抗原冲击致敏的骨髓来源的树突状细胞 (DC)对结肠癌小鼠是否具有治疗作用。方法 :用小鼠结肠癌细胞株C2 6冻融抗原体外冲击致敏BALB/c小鼠骨髓来源的DC ,观察其体外刺激荷瘤小鼠脾细胞增殖的能力及其诱导的CTL对C2 6肿瘤细胞的杀伤活性 ;体内以 3× 10 5DC /只一次或多次接种于已荷瘤 10d结肠癌的小鼠同侧腹股沟皮下 ,观察抗原冲击的DC对肿瘤生长的抑制作用以及对荷瘤小鼠生存期的影响。结果 :体外抗原冲击致敏的DC能显著刺激荷瘤小鼠脾脏T细胞增殖 ,其诱导的CTL对C2 6肿瘤细胞具有显著的杀伤作用 ,在效靶比为 10∶1,5∶1,2 .5∶1时其杀伤率分别 88 1% ,71.4%和 5 0 .0 % ;抗原冲击致敏的DC体内多次皮下免疫后对肿瘤的生长具有显著的抑制作用 ,能显著延长荷瘤小鼠的生存期。一次性DC体内免疫接种对荷瘤小鼠的治疗作用不明显。结论 :肿瘤细胞冻融抗原体外冲击致敏的DC多次皮下免疫对结肠癌小鼠具有显著的治疗效果     

Immunotherapy of a Murine T Cell Lymphoma Localized to the Brain

Mouse YC8 T cell lymphoma was used as a model to determine whether an effective immunotherapy procedure could be devised for the treatment of lymphoma localized to the brain. Implantation of 5 × 10⁴ YC8 cells into the left cerebral hemisphere induced rapid loss of the animal's body weight. Severe loss of weight and early deaths were observed in the untreated control group. Although resistance can be conferred to the brain by immunization of naive BALB/c mice, adoptive chemoimmunotherapy procedures were surprisingly not effective in inducing remissions in animals with lymphoma confined to the brain. Even passive transfer of effector cells from immunized, tumor resistant donor animals combined with systemic IL-2 treatment did not impart resistance to recipients with brain tumors. However, regression of the intracranial tumor and apparent cures could be accomplished, when ex vivo cultured effector cells were transferred intravenously.     

小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞对特异性CTL的体内外诱导作用

目的 探讨白细胞介素-12(IL-12)诱导小鼠红白血病细胞产生的树突状细胞,对白血病特异性CTL细胞的诱导作用,及体内免疫后对抗肿瘤免疫应答的诱导效果.方法:采用4/小时~(51)Cr释放法,检测CTL杀伤活性;观察小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞体内免疫冶疗后对肿瘤的抑制作用,采用了HE染色和电镜等技术,分析肿瘤组织的病理学变化.结果:IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC,在体外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL.采用IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC免疫C57 BL/6小鼠.体内诱导出的CTL杀伤活性明显高于对照组.实验组小鼠能够有效的抵抗野生型FBL-3细胞的再攻击;肿瘤生长受到明显的抑制,组织学观察显示,肿瘤局部有较多炎性细胞浸润和细胞坏死;透射电镜可观察到典型的凋亡征象,结论:IL-12诱导小鼠FBL-3红白血病细胞产生的树突状细胞,在体内外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL,体内免疫后可增强抗肿瘤免疫应答,该结果为白血病的免疫治疗提供了新的途径.     

CIK治疗后肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞变化研究

目的:探讨CIK(CellInductionKiller)治疗后肿瘤患者的免疫功能状态。方法:采用流式细胞术检测20例肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞。结果:肿瘤患者CD3+、CD4+、CD3-/CD16+56+细胞和CD4/CD8比值明显低于对照组并呈显著性差异,而CD8+细胞高于对照组(P<0.01)。CIK生物治疗后CD3+、CD4+、CD3-/CD16+56+细胞和CD4/CD8比值都升高,其中CD4+、CD3-/CD16+56+细胞与治疗前比较呈显著性差异(P<0.05),而CD8+细胞与治疗前比较降低(P<0.05)。结论:肿瘤患者的免疫功能低下,CIK生物治疗能够提高机体的免疫功能。流式细胞术对患者免疫功能的监测,具有快速、灵敏、准确的特点,对于评价疗效、判断预后具有重要价值。