人源血管内皮生长因子突变体的克隆、分离纯化及活性研究

目的：为获得大量人源血管内皮生长因子突变体（hVEGF121’）的重组蛋白，本文研究了其发酵条件，分离纯化方法．并初步考察了其生物活性。方法：应用PCR介导的定点突变方法，将hVEGF121中对其活性影响较小的1-8位和115～12l位两个肽段替换成破伤风毒素（TT）的两个强表位肽段618-627位和831-837位，构建高效表达的pET28a／hVEGF121’重组质粒，考察诱导条件对目的蛋白表达量的影响；所得包含体经过DEAE-Cellulose离子交换柱纯化；初步比较了VEGF121和突变体VEGF121’的免疫和杭肿瘤效果。结果：最佳表达条件为：乳糖诱导时间6h，诱导浓度2mmol／L；离子交换纯化后可得到电泳纯的突变体hVEGF121’；初步的动物免疫发现突变体VEGF121’和VEGF121有相近的免疫滴度，但前者杭肿瘤效果更显著。结论：经发酵纯化后得到重组人源血管内皮生长因子突变体（hVEGF121’）的纯品，并初步展现良好的抗肿瘤效果.     

VEGF165的载体构建、表达及其生物学活性

目的:构建血管内皮生长因子(VEGF)165原核表达载体,在大肠杆菌中表达,获得重组VEGF165,并通过细胞和鸡胚尿囊膜试验鉴定其生物学活性.方法: 本实验室保存的T-VEGF165质粒,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,将其克隆至原核表达载体pET28a( )中,获得含人VEGF165全序列基因的表达载体pET28a( )-VEGF165,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化,获得VEGF165蛋白.通过体外促进HUVEC细胞增殖及鸡胚尿囊膜血管增生实验鉴定其生物学活性.结果:成功构建了VEGF165蛋白的原核表达载体,表达纯化了VEGF165蛋白,经过细胞增殖试验及鸡胚尿囊膜血管增生实验,证明该蛋白具有良好的促进血管内皮细胞增殖的生物学活性.结论:成功地获得了人VEGF165重组蛋白,并证实了该蛋白具有促进血管内皮细胞增殖活性.     

人血管内皮生长因子(VEGF165)在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白.[方法]用PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165cDNA,并定向克隆入原核表达载体pET-28a中.用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定.根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性.[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165cDNA片段.克隆的VEGF165cDNA长576bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致.SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25ku的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20%.MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖.[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165.     

人血管内皮生长因子(VEGF_(165))在大肠杆菌中的表达及鉴定

[目的]克隆人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。[方法]用 PCR技术,从人心脏cDNA文库中扩增VEGF165 cDNA,并定向克隆人原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠 杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165,Western-blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖 的特性,用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。[结果]从人心脏cDNA文库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的 VEGF165 cDNA长576 bp,编码191个氨基酸残基,序列与文献报道一致。SDS-PAGE电泳显示,经IPTG诱导,高效表达出25 ku 的rVEGF165,主要存在于包涵体中,约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示,复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静 脉血管内皮细胞增殖。[结论]克隆、测定了人VEGF165基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。     

血管内皮生长因子在原核细胞中的高效表达、纯化与活性研究

目的用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子（VEGF165），分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性，为后期构建携带VEGF165蛋白的预成血管化组织工程骨提供充足的蛋白来源。方法利用PCR亚克隆的方法获得目的基因片段，构建表达质粒pQE30-VEGF165，在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni^2＋--NTA进行蛋白纯化。酶联免疫吸附（ELISA）和Western blot技术检测纯化的VEGF165蛋白免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。结果重组表达质粒pQE30-VEGF。在大肠杆菌中成功的表达了相对分子质量为23000的蛋白,该蛋白以不溶性包涵体的形式存在，占菌体总蛋白的30％左右。经过分离和Ni柱纯化获得了VEGF165蛋白，浓度约为0．2mg／ml，ELISA和Westernblot实验显示其具有良好的免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜实验和matrigel血管形成实验显示所表达的蛋白具有良好的生物学活性。结论本实验在原核细胞中稳定、高效的表达了具有活性的VEGF165蛋白，为后期预购血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。     

人血管内皮生长因子（VEGF165）在大肠杆菌中的表达及鉴定

【目的】克隆人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达、纯化重组VEGF165(rVEGF165)蛋白。【方法】用PCR技术，从人心脏cDNA库中扩增VEGF165 cDNA，并定向克隆入原核表达载体pET-28a中。用IPTG诱导VEGF165在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。用HisTrap亲合层析柱纯化重组rVEGF165 Western—blot鉴定。根据人VEGF165的促血管内皮细胞增殖的特性，用MTT法检测重组VEGF165的生物学活性。【结果】从人心脏cDNA库中扩增出VEGF165 cDNA片段。克隆的VEGF165 cDNA长576bp，编码191个氨基酸残基，序列与献报道一致。SDS-PAGE电泳显示，经IPTG诱导，高效表达出25ku的rVEGF165，主要存在于包涵体中，约占菌体总蛋白的20％。MTT检测显示，复性后的rVEGF165能呈剂量依赖性地促进脐静脉血管内皮细胞增殖。【结论】克隆、测定了人VEGF165基因，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出rVEGF165。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究

目的：制备抗重组人血管内皮生长因子（VEGF）165单克隆抗体。方法：构建人VEGF165原核表达载体pET-3a/VEGF165,并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化表达产物。用初步纯化的rhVEGF165免疫小鼠制成杂交瘤细胞,小鼠腹腔接肿,收集腹水纯化后制成抗rhVEGF165单克隆抗体。结果：VEGF165诱导的内皮细胞增殖可被本研究制备的单克隆抗体中和,并表现出较好的剂量依赖关系。结论：本研究利用DNA重组技术制备人VEGF165,并利用它进一步制备了抗重组人VEGF165单克隆抗体。     

血管内皮生长因子在大肠杆菌中表达?提纯及功能测定

目的:利用细菌表达系统合成大量重组血管内皮生长因子(VEGF)蛋白.方法:将VEGF165 cDNA克隆于表达载体PET-32a( )后转染BL-21株表达重组VEGF蛋白,用分离His蛋白的层析柱提纯重组VEGF蛋白.结果:重组VEGF蛋白经氨基酸序列测定证实.Western blot测定发现His蛋白.功能测定发现重组VEGF蛋白可阻断细胞表面Neuropilin-1的表达.结论:上述表达系统制备大量具有生物活性的重组VEGF蛋白     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor （VEGF165）in pichia pastoris and Its Biological Activity

Objective :To express human vascular endothelial growth factor(hVEGF165) cDNA in Pichia pastroris,purify the expressed product and detect the biological activity of it.Methods:By inserting hVEGF165 cDNA coding 165 amino acid esidues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/hVEGF165 was constructed and transformed to yeast host strain KM71,then multiple-copy insert transformants were screened out and cultured in flasks,and hVEGF165 was expressed under the induction of 1% methnol.Results:SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expressed.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purified by Heparin-Sepharose CL6B affinity chromatography,the purity of expressed product reached above 90%,Biological assays proved that the expressed product could stimulate the proliferation of HUVEC.Conclusion:hVEGF165 was successfully expressed.The study opened up a wide prospect for the application of VEGF165 in the prevention and treatment of ischemic heart disease and other tissue ischemic diseases such as secondary arterial occlusion in limbs.     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor Receptor Flt—1 Extracellular Domain 1—3 Loop cDNA in Pichia pastoris,Purification of the Expressed Product and Detection of Its Biological Acti

Objective:to express human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 extracellular domain 1-3 loop cDNA in Pichia.pastroris,and to purify the expressed product and detect its biological activity.Methods:By inserting human Flt-1(1-3 loop)cDNA coding 316 amino acid residues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/Flt-1(1-3) was constructed and transformed to yeast host strain GS115,then His^ Muts phenotype transformant was screened out and cultured in flasks,and Flt-1(1-3) was expressed under the induction of 1% methanol.Results SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d ,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expresses.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purifed by CM-Sepharose FF and Sephacry1 S-100 chromatography,the purity of the expressed product reached obove 90%,Biological assay proved that the expressed product could bind to hVEGF165 and inhibit the proliferation of HUVEC stimulated by hVEGF165.Conclusion:Human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 exracellular domian 1-3 loop was successfully expressed.The study lays f foundation for further application of the expressed product in the troduct in the treatment of vasoformation related diseases,such as tumor and diabetic retinopathy.     

人血管内皮生长因子165的克隆和在大肠杆菌中的表达

克隆和在大肠杆菌中表达人血管内皮生长因子１６５（ＶＥＧＦ１６５）。方法利用ＰＣＲ的方法从胎脑ｃＤＮＡ库扩增得到人ＶＥＧＦ１６５的全长ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因重组技术构建ＶＥＧＦ１６５的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行表达，用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达产物。结果经测序表明，克隆的ＶＥＧＦ１６５与文献报道相符，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明经用ＩＰＴＧ诱导后，ＶＥＧＦ１６５在大肠杆菌中表达出。结论克隆和表达出ＶＥＧＦ１６５，为以后进一步研究ＶＥＧＦ１６５的功能奠定了基础     

带信号肽人VEGF165 cDNA克隆

目的：克隆带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ,以便进一步在真核系统表达人ＶＥＧＦ１６５蛋白或基因治疗。方法：设计引物;从人胎脑ｃＤＮＡ文加ＰＣＲ扩增目的基因;ＤＮＡ片段回收与酶切鉴定;与Ｍ１３ｍｐ１８重组;单链序列测定。结果：克隆片段与人ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ序列一致。结论：克隆ＤＮＡ片段为带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

人血管内皮生长因子基因cDNA的克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的：克隆和在COS－7细胞中表达人血管内皮生长因子165（VEGF165）。方法：利用RT－PCR方法，从新鲜卵巢癌组织中扩增到人VEGF165的全长cDNA，并测定其核酸序列；利用基因重组技术构建VEGF165的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF165；应用脂质体介导的基因转移术将这一表达载体导入COS－7细胞后，免疫组化（SP法）检测瞬时表达的产物。结果：经酶切鉴定和基因测序证实，克隆的基因片段为人VEGF65cDNA，重组质粒pcDNA3．1－VEGF165转染COS－7细胞后，免疫组化检测有VEGF表达，结论：成功克隆人VEGF165基因，并在COS－7细胞获得表达。     

利用重组人VEGF165制备单克隆抗体的研究

目的 :制备抗重组人血管内皮生长因子 (VEGF) 16 5单克隆抗体。方法 :构建人 VEGF16 5原核表达载体 p ET- 3a/ VEGF16 5 ,并使其在大肠杆菌中高效表达 ,纯化表达产物。用初步纯化的rh VEGF16 5免疫小鼠制成杂交瘤细胞 ,小鼠腹腔接种 ,收集腹水纯化后制成抗 rh VEGF16 5单克隆抗体。结果 :VEGF16 5诱导的内皮细胞增殖可被本研究制备的单克隆抗体中和 ,并表现出较好的剂量依赖关系。结论 :本研究利用 DNA重组技术制备人 VEGF16 5 ,并利用它进一步制备了抗重组人VEGF16 5单克隆抗体。