荧光定量聚合酶链反应技术检测结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA

目的探讨结核分枝杆菌感染在结节病发病中的作用;方法荧光定量聚合酶链反应技术检测22例结节病肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA;结果22例肺泡灌洗液中9例检出结核分枝杆菌;结论结核分枝杆菌感染可能是结节病病因之一。     

定量聚合酶链反应技术研究进展

自Ｍｕｌｌｉｓ等于 1985年创建了聚合酶链反应(ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ ,ＰＣＲ)技术以来 ,该技术经过十几年的发展与完善 ,已在基础研究领域得到了广泛的应用 ,并在临床疾病的诊断方面进行了一些探索性研究。根据ＰＣＲ扩增策略和检测产物手段的不同 ,可分为定性ＰＣＲ(ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ ,以下简称ＰＣＲ)和定量ＰＣＲ(ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ ,Ｑ ＰＣＲ)。一、ＰＣＲ在结核分支杆菌检测中的研究现状1989年Ｈａｎｃｅ等[1] 将ＰＣＲ用于结核分支杆菌的检测 ,1990年我国引进该项技术 ,从而在…     

实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌-DNA对肺结核的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中结核分枝杆菌-DNA（TB-DNA）对肺结核的诊断价值。方法肺结核52例（菌阳20例,菌阴32例）,肺炎35例,采用FQ—PCR法检测其支气管肺泡灌洗液中TB—DNA水平。结果52例肺结核组的阳性率为65．4％（菌阳19例,菌阴15例）,35例非肺结核组的阳性率为5．7％,经统计学比较,FQ-PCR法检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和培养法（P均〈0．05）,FQ-PCR法特异性高。结论FQ-PCR法检测BALF中TB-DNA为痰涂片阴性及无痰患者提供良好的诊断依据。     

荧光定量聚合酶链反应技术检测结核分支杆菌的临床应用

我们采用荧光定量聚合酶链反应 (ＦＱ ＰＣＲ)技术检测了115例结核患者高度疑有结核分支杆菌的标本和 3 0例非结核病的患者标本 ,并与培养法、抗酸染色法和ＰＣＲ 电泳法进行了比较 ,现报告如下。对象与方法　对象 :115例临床诊断为结核病的患者为四川省人民医院门诊和住院患者 ,符合结核病诊断标准。 3 0例非结核患者为对照组 ,其中肺炎 2 5例 ,慢性支气管炎 5例。标本包括痰、胸腹液、晨尿和精液。方法 :标本经处理后 ,进行碱性复红染色 ;罗氏培养基培养 ;ＰＣＲ电泳 ,每份用该法检测 2次。ＦＱ ＰＣＲ :仪器为美国ＡＢＩ公司生产的 770 0…     

荧光定量聚合酶链反应检测献血员HCMV-DNA

目的　了解献血员血清中HCMV核酸含量。方法　采用FQ -PCR法定量检测 36 3例献血员的血清标本。结果　经FQ -PCR检测 ,血清标本HCMVDNA平均拷贝数为 1 2× 10 5基因拷贝 /μl。献血员的血清HCMV含量在不同性别及职业、文化程度、经济水平、献血次数、献血年限、ALT水平、是否定期献血组间均差异无显著性 ,只是在不同年龄段之间有差别。以FQ -PCR为“金标准” ,发现ELISA法灵敏度为 6 7 89% ,特异度为 93 16 % ,阳性预测值为 95 4 3%。结论　FQ -PCR能够避免PCR后处理导致的假阳性污染 ,并实现实时定量     

实时荧光定量聚合酶链反应法检测痰结核杆菌DNA及其临床应用

结核杆菌培养法周期长，而且存在药物抑菌现象，容易产生假阴性结果。痰涂片抗酸染色计数法在敏感度、特异度等方面均不理想。本研究采用Taqman荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术，检测痰标本结核杆菌载量的实时荧光定量PCR体系，评价该体系检测结核杆菌以及监控抗结核药效的可行性。     

AmpliSensor—聚合酶链反应定量检测肺结核患者外周血结 …

目的 探讨ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－聚合酶链反应定量检测外周血中结核分支杆菌ＤＮＡ在肺结核的应用价值。方法 采用ＱｌＡａｍｐ和ＡｃｕＰｕｒｅ法提取，制备全血中模板ＴＢ－ＤＮＡ，应用ＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ－ＰＣＲ定量检测，并与ＩＳ６１１０－单管巢式聚合酶链反应（ＳＮ－ＰＣＲ）作比较。结果２００例肺结核患者的血液标本中，两种方法测得结核分支杆菌ＤＮＡ的阳性率分别为６０．５％、６３．５％。８５例非结核肺病     

应用竞争性荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的:建立竞争性荧光定量聚合酶链反应(CFQ-PCR),并探讨CFQ-PCR在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义.方法:根据HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,和一条特异的TaqMan探针;根据上述引物序列,采用分子克隆技术制备内对照DNA;再根据内对照序列合成一条内对照DNA特异的与上述TaqMan探针不同标记的TaqMan探针;将适量的内对照DNA加入到PCR反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增.结果:在30μL CFQ-PCR反应体系中,加入约20拷贝内对照DNA能够稳定地获得共扩增曲线;经琼脂糖凝胶电泳分析,加入约100-500拷贝内对照DNA能够有效地获得共扩增产物条带信号;在210个临床HBsAg阳性血清标本的CFQ-PCR扩增中识别出8个未能有效扩增的标本,60份HBsAg阴性血清标本中识别出2个内对照未能有效扩增的标本,后经DNA纯化处理,上述全部标本的内对照均获得阳性扩增结果,其中有7个HBsAg阳性血清标本获得HBV DNA扩增阳性结果.结论:CFQ-PCR能够有效地提示临床标本HBV DNA体外扩增时由于扩增失败导致的假阴性,适合临床推广应用.     

荧光定量聚合酶链反应检测输血传播病毒方法的建立及应用

[目的]建立输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测方法,为快速、准确地定量检测TTV奠定基础.[方法]根据TTV ORF2区基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.将PCR扩增的TTV的ORF2区基因片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测.[结果]应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系.与定量对照曲线比较计算,10例TTV标本中TTV拷贝数为3.8×105～8.9×1O8拷贝/μl.[结论]检测TTV的FQ-PCR方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

巢式实时荧光定量聚合酶链反应检测结核分枝杆菌DNA的临床应用

目的探讨巢式实时荧光定量PCR（QNRT-PCR）检测结核分枝杆菌（MTB）DNA的临床价值。方法应用SYBR Green I建立检测结核分枝杆菌MTP64基因的QNRT—PCR方法,分别检测24份肺结核患者痰液,27份结核性胸膜炎患者胸水,以及对照组75份痰液和胸水的MTBDNA含量。结果以培养为金标准,QNRT—PCR敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）分别为95．83％、61．54％、69．70％和94．12％,结核性胸膜炎的阳性率为70．37％。三种PCR方法阳性率比较,差异具有统计学意义（P〈0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR拷贝数配对检验差异没有统计学意义（P〉0．05）,QNRT—PCR与实时荧光定量PCR的Cr值配对检验差异具有统计学意义（P〈0．01）。结论QNRT—PCR方法可检测痰液和胸水MTB DNA,对含微量MTB DNA样本的高敏感性在结核病的早期诊断中有重要参考价值。     

应用聚合酶链反应检测非典型鼠疫菌

典型的鼠疫动物病流行以现有的检测手段不难发现。但是,在动物鼠疫间歇期即使进行大量的常规细菌学调查也常常难已发现。这在前苏联的里海西北部和我国的云南都有实例,美国也有类似的情况。然而,事实证明,鼠疫菌仍以某种形式存在于自然界的疫源地内,只是现有的检测手段没有发现而已。为探求间歇期鼠疫菌的检测方法,本文应用聚合酶链反应(PCR),对实验诱变的7株非典型鼠疫菌进行检测,结果如下。1 材料与方法     

实时定量聚合酶链反应技术在鉴别结节病与增殖性结核病中的应用

目的利用实时定量聚合酶链反应（PCR）方法检测结节病和结核病病理组织中结核分枝杆菌DNA，以探讨结核分枝杆菌在结节病发病中的作用及本方法在结节病与增殖性结核病鉴别中的应用价值。方法以上海市肺科医院1998年1月至2003年12月住院患者76例为研究对象，其中结核病组30例、结节病组31例和正常对照组（其他疾病）15例，利用定量PCR检测用石蜡包埋的淋巴结或肺组织中结核分枝杆菌DNA，并以胎鼠肺组织作为阴性对照。结果结核病组结核分枝杆菌DNA检出的阳性率（30／30）明显高于结节病组（6／31）和正常对照组（2／15），结节病组与正常对照组结核分枝杆菌DNA检出的阳性率无明显差别。结核病组结核分枝杆菌DNA检出的绝对和相对拷贝数明显高于结节病组和正常对照组，结节病组与正常对照组无明显差别，而胎鼠肺组织中未检出结核分枝杆菌DNA。结论本研究结果不支持结核分枝杆菌感染与结节病的相关性。实时定量PCR法检测石蜡包埋病理组织中结核分枝杆菌DNA可作为鉴别增殖性结核和结节病的方法之一。     

两种实时荧光定量聚合酶链反应检测血清HCV RNA的比较

目的 比较全自动病毒载量检测系统(COBAS TaqMan)和国产荧光定量PCR试剂盒对血清HCV RNA载量的检测结果,探讨两种检测方法在临床诊断和治疗中的应用价值.方法 收集26例慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗前和治疗过程中2、4、8、12、24、36和48周的系列血标本,共168份,采用COBAS TaqMan 48全自动分析系统和广州某国产TaqMan实时PCR试剂盒分别检测系列血清中的HCV RNA载量.统计学处理采用x2检验和t检验.结果 当血清HCV RNA≥1×104IU/mL时(0周),COBAS检测和国产试剂盒均能很好测定HCV载量,而且国产试剂盒检测值为1.35×107IU/mL高于COBAS检测值2.21×106IU/mL,差异有统计学意义(t=2.05,P<0.05);血清HCV RNA<1×104IU/mL时(2～48周),COBAS检测出的HCV阳性率为21.4%(30/140),远高于国产试剂盒的1.4%(2/140),差异有统计学意义(t=3.66,P<0.01);治疗4周时,COBAS检测26例患者中14例血清HCV为阳性,12例病毒载量低于检测下限,获得快速病毒学应答(RVR);国产试剂盒检测结果为3例血清HCV为阳性,23例获得RVR.COBAS与国产试剂盒梧比,转阴率差异有统计学意义(x2=10.575,P<0.01).治疗12周时,COBAS检测完全早期病毒学应答(cEVR)率为95.7%(22/23),国产试剂盒检测的cEVR为100%(17/17),差异无统计学意义(x2=0.726,P>0.05).结论 国产荧光定量PCR试剂盒可用于HCV疑似患者的筛查和高HCVRNA载量者的确诊,对于低HCV RNA载量的疑似患者和抗病毒治疗过程中HCV载量的检测,COBAS则更为敏感.

Abstract：

Objective To compare the plasma hepatitis C virus(HCV)RNA levels detected by the fully automated viral load detection system(COBAS TaqMan)and the national real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)kit,and to investigate the clinical application value of these two methods in clinical practice.Methods A total of 168 serial plasma samples collected from 26 patients with chronic hepatitis C(CHC)before and at week 2,4,12,24,36 and 48 of antiviral treatment were detected by both COBAS Taqman 48 analyzing system and the national real-time quantitative PCR kit.The results of two methods were compared by chi square test and t test.Resnlts Both COBAS and national kit showed great positive detecting results when HCV RNA≥1×104IU/mL(at week O),and the virus load value detected by national kit was significantly higher than that detected by COBAS(t=2.05,P<0.05).However,when HCV RNA<1×104(at week 2-48),the positive rate of HCV detected by COBAS was significantly higher than that detected by national kit (t=3.66,P<0.01).At week 4 of treatment,the rapid virological response(RVR)rate was 46.2 % (12/26)detected by COBAS,while that was 88.5%(23/26)detected by national kit,and the difference was significant(x2=10.575,P<0.01).At week 12 of treatment,the complete early virological response(cEVR)was 95.7%(22/23)detected by COBAS,while that was 100%(17/17)detected by national kit,and the difference was not significant(x2=0.726,P>0.05).Conclusions The national TaqMan real-time quantitative PCR kits could be used to screen the suspected cases of HCV infecrion and to diagnose CHC cases with high HCV virus load.COBAS detection is more sensitive in cases with low HCV virus load and in on-treatment monitor during anti-HCV therapy.     

痰聚合酶链反应和血清结核抗体检测等指标在菌阴肺结核诊断中的临床意义

目的 探讨菌阴肺结核的血清学指标的诊断意义.方法 对自2004年至2006年被确诊为继发性肺结核、同时具有痰PCR、血LAM-TB、血清腺苷脱氨酶(ADA)及血沉(ESR)检测结果的住院病人分为菌阴和菌阳组,进行上述指标的比较.结果(1)菌阳组四项指标的阳性率明显高于菌阴组,菌阴组中LAM-TB敏感性优于其它三项指标,痰PCR敏感性低.(2)菌阴肺结核中血沉增快、血清LAM-TB阳性、ADA增高在PCR阳性和阴性组间没有统计学显著性差异(P＞0.05).(3)菌阴肺结核中两项指标联合检测均较单项指标检测的敏感性增高,以LAM-TB联合ESR的敏感性为最高达91.6％,三或四项指标联合检测可提高敏感性l～4％.结论 在菌阴肺结核的诊断中,LAM-TLB的敏感性优于ESR、痰PCR、ADA,而痰PCR的敏感性较低,指标的联合检测可提高诊断的敏感性.     

荧光定量聚合酶链式反应检测恶性疟原虫的研究

目的 评价荧光定量聚合酶链式反应（FQ－PCR）检测恶性疟原虫的效果。方法 以不同浓度梯度标准对照作为参照,对127份疟区血样进行检测,并将所得结果与镜检、常规PCR法比较。结果 恶性疟原虫镜检、常规PCR、FQ－PCR检出的阳性率分别为33．1％、38．5％和40．9％;定量检测结果与镜检阳性率呈直线相关,相关系数为0．961。结论 FQ－PCR检测方法有较高的灵敏度和特异度,用于恶性疟原虫的定性及定量检测有较好的应用前景和研究价值。     

应用等位基因特异性多重聚合酶链反应同步检测结核分枝杆菌的耐药性

目的建立可同步检测结核分枝杆菌katG和ropoB基因突变的等位基因特异性多重聚合酶链反应（MAS-PCR）的方法，以快速检测结核分枝杆菌对利福平（RFP）和异烟肼（INH）的耐药性。方法根据结核分枝杆菌katG和rpoB基因序列，分别设计特异性寡聚核苷酸引物，采用MAS-PCR技术，分别检测katG基因315位点和rpoB基因中531、526和516三个最常见的突变位点。结果19株INH敏感株中均未发现katG基因315位点的突变，耐药株中发现有79．2％（61／77）的菌株存在突变；15株RFP敏感株中未发现rpoB基因突变。MAS-PCR方法可检测出81．5％（66／81）的利福平耐药株。结论MAS-PCR方法对katG和rpoB基因的同步检测有较高的敏感性和特异性，有望用于耐药结核分枝杆菌的快速检测。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（RifampicinResistartceDeterminingReglon，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，53ITCG和531TrG）．应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较．部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中．其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份哺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株．其中利福平耐药株48份．荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到53l密码子突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变．3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子．TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为I晦床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

聚合酶链反应在肺结核诊断上的临床应用

聚合酶链反应在肺结核诊断上的临床应用赵新芳，欧阳杰，张成军，赵学信，马英红，何恩泉采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测临床标本中的结核菌，并同涂片和培养法比较，以评价ＰＣＲ在肺结核诊断上的应用价值。临床标本收集：１７８份肺结核和３３份非结核肺部疾病痰标...     

SYBR实时定量聚合酶链反应检测鸭乙型肝炎病毒的研究

采用SYBR实时定量聚合酶链反应(PCR)检测鸭乙型肝炎病毒(DHBV)，现将结果报道如下。