NPM1基因沉默的HL-60及其耐药细胞株的建立

本研究旨在构建针对HL-60细胞及其耐药细胞株(HL-60/ADR)的NPM1-RNAi的细胞模型,为研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用奠定实验基础。通过针对NPM1基因的shRNA与线性化的pGCSIL-GFP载体进行连接转化,对获得的重组子(pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA)进行PCR和测序鉴定。采用慢病毒载体系统将pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体与pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA共转染293T细胞,包装成NPM1-RNAi-LV,将慢病毒载体感染HL-60及HL-60/ADR细胞。采用实时定量RT-PCR和Western blot法分别从mRNA和蛋白水平验证建立的细胞株的转染效率。结果表明,成功构建了重组真核表达载体pGCSIL-GFP-NPM1-shRNA,并通过慢病毒载体系统包装成NPM-1-RNAi-LV;将NPM1-RNAi-LV转染至HL-60及HL-60/ADR细胞后,从mRNA水平上看,对细胞的NPM1 mRNA表达有显著抑制,达到90%以上(p<0.05);从蛋白水平上看,对细胞的NPM蛋白表达具有显著的抑制效果,表明转染后的HL-60及HL-60/ADR细胞的NPM1基因特异性沉默。NPM1基因沉默后,HL-60/ADR对阿霉素的耐药性有一定程度的下降。结论:成功构建了NPM1-RNAi的HL-60及HL-60/ADR细胞模型,为进一步研究NPM1基因在白血病耐药过程中的作用建立了良好的实验基础。     

小鼠单核巨噬细胞Ufm1基因shRNA慢病毒载体构建及鉴定

目的 构建小鼠Ufm1基因RNA干扰慢病毒载体,并实现该基因在小鼠单核巨噬细胞系（RAW264.7）中的稳定表达抑制.方法 根据小鼠Ufm1基因设计两条RNA干扰序列,合成靶序列双链DNA,与pFU-GW-RNAi载体连接,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.pFU-GW-RNAi载体、pHelper 1.0载体及pHelper 2.0载体共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,并测定其滴度,随后感染RAW264.7细胞,建立稳定转染细胞株.将RAW264.7细胞分为空白组、阴性对照组及RNA干扰慢病毒感染组,用Real-time PCR检测Ufm1基因mRNA的表达量.结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序证实,shRNA片段完全正确插入慢病毒载体pFU-GW-RNAi中.在荧光显微镜下观察可见,293T细胞呈绿色荧光,并测得病毒滴度为9×105 TU/μl.重组慢病毒感染RAW264.7后,用Real-time PCR检测到Ufm1基因mRNA的表达受到抑制.结论 成功构建了小鼠RNA干扰慢病毒载体,并能够在RAW264.7细胞中有效沉默靶基因.     

核转运蛋白2慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的探索构建针对人类核转运蛋白2(KPNA2)基因的重组慢病毒干扰RNA(sh RNA)载体的方法,研究其对人骨肉瘤细胞株MG63的沉默效率。方法针对KPNA2基因设计小片段干扰序列。加入AgeⅠ酶和Eco RⅠ酶酶切位点,根据设计好的序列合成单链DNA oligo并退火合成双链DNA oligo。将合成好的双链DNA oligo与GV115载体重组,形成GV115-sh RNA慢病毒载体。聚合酶链式反应(PCR)法鉴定筛选出阳性重组子,经测序后包装慢病毒载体。荧光法测定病毒滴度,重组慢病毒感染骨肉瘤细胞株MG63,通过显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达来计算其转染效率。RT-PCR法检测重组慢病毒RNA干扰载体对人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2表达的沉默效率。实验结果数据以均数±标准差(sx±)表示,应用SPSS 13.0统计软件分析,两组均数间的比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计意义。结果经PCR分析和测序证实,成功构建KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体;荧光法测定病毒滴度为4×108 TU/ml;荧光显微镜下观察GFP,显示细胞感染效率达到80%以上;RT-PCR检测对照组及实验组KPNA2 m RNA表达分别为0.991±0.087 vs.0.216±0.012,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KPNA2基因重组慢病毒RNA干扰载体构建成功,并有效干扰人骨肉瘤细胞株MG63中KPNA2 m RNA的表达。     

慢病毒载体Venus在HL-60细胞应用的可行性研究

随着对急性髓系白血病(AML)发生、发展的基因机制深入研究,构建转染效率高且对细胞无毒性作用的载体变得十分重要。为了研究补体C3a的受体蛋白C3aR1(complement component 3a receptor 1)在AML中的作用,构建了携带C3aR1的第三代慢病毒载体Venus。本研究主要观察Venus慢病毒载体在急性髓系白血病中应用的可行性。采用磷酸钙沉淀法将重组载体Venus-C3aR1转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒,感染HL-60细胞,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)观察感染效率,用RT-PCR和流式细胞术鉴定感染后HL-60细胞C3aR1的表达情况。用CCK8法绘制细胞生长曲线、观察细胞诱导分化能力来判断慢病毒载体的细胞毒性作用。结果显示,流式细胞仪(FCM)检测慢病毒感染率>95%,感染后HL-60细胞上C3aR1表达明显增加,病毒包装成功。慢病毒感染前后细胞生长曲线及诱导分化能力无明显变化,说明慢病毒载体不影响HL-60细胞的一般生物学特性,无明显的细胞毒性作用。结论:Venus慢病毒载体对AML细胞株HL-60的感染效率高,能够整合到细胞基因组中实现目的基因的稳定表达。慢病毒感染对细胞无明显的细胞毒性作用,不会干扰靶基因在细胞株中功能,因此慢病毒载体可以为白血病细胞的研究提供可靠的技术支持。     

RPS14基NRNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

背景：有研究表明,造血干／祖细胞内RPSl4表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示RPS14的正常表达有助于维持机体的正常造血。目的：构建RPSl4基因HRNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。方法：针对已经筛选确定的RPSl4基因RNAi有效靶序列,构建GC-shRPSl4慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shRPS14、pHelper1．0载体和pHelper2．0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度：并将获得的RPSl4shRNA慢病毒载体GC-shRPSl4转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用WestemBlot检测靶细胞内RPSl4蛋白的表达。结果与结论：经测序证实,构建出了了RPSl4shRNA的慢病毒载体GC-shRPS14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×10^9TU／mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75％,WesternBlot检测到转染后RPS14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后RPSl4蛋白表达沉默。     

稳定下调血管内皮钙黏蛋白表达对K562细胞药物敏感性的影响

目的:探索稳定下调VE-cadherin蛋白对K562细胞药物敏感性的影响及其可能的机制。方法:设计靶向人VE-cadherin的特异性干扰序列,连同IRES-GFP及NEO基因片段,构建重组慢病毒载体;三质粒系统包装慢病毒颗粒,感染K562细胞,筛选稳定下调VE-cadherin的K562细胞。应用CCK8法测定K562细胞对伊马替尼药物敏感性的变化,AnnexinⅤ/7-AAD标记细胞,流式细胞术检测细胞凋亡;荧光定量PCR检测白血病细胞CD133、ALDH1的转录水平;Western blot方法检测白血病细胞VE-cadherin、BCR-ABL和β-catenin表达水平。结果:成功构建重组慢病毒载体pLB-sh VEC-NEO-IRES-GFP,并包装慢病毒,筛选出稳定下调VE-cadherin蛋白的K562细胞株。稳定下调K562细胞VE-cadherin表达后,在相同药物浓度处理下白血病细胞增殖率降低,凋亡率升高,CD133及ALDH1转录水平降低,BCR-ABL融合蛋白表达水平无明显变化,总β-catenin蛋白表达水平下降,细胞核β-catenin蛋白水平亦下降。结论:稳定下调K562细胞VE-cadherin蛋白的表达可使白血病细胞药物敏感性增高,其机制可能与降低β-catenin蛋白的稳定性、减少β-catenin蛋白的核转位有关的。     

利用慢病毒载体构建过表达人TCRP1基因的慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

目的 利用慢病毒载体构建过表达人舌癌耐药相关基因（TCRP1）的慢性髓系白血病（CML K562细胞系并检测其生物学功能。方法 将TCRP1的重组质粒与包装质粒共转染293T细胞，收集病毒液测定滴度后感染K562细胞，使用嘌呤霉素筛选TCRP1过表达的细胞株K562/TCRP1，荧光定量PCR和Western blot方法检测TCRP1的表达，采用连续细胞计数法和CCK-8法分别对K562/TCRP1及其对照细胞株的增殖情况进行检测，并分析2个细胞株对不同浓度的伊马替尼（IM）的药物敏感性。结果 TCRP1慢病毒表达载体成功转染进入K562细胞，荧光定量PCR和Western blot结果显示K562/TCRP1细胞株的TCRP1表达在mRNA水平和蛋白水平均显著高于对照组，连续细胞计数法和CCK-8法结果表明K562/TCRP1细胞的增殖能力和细胞活力增强，IM处理K562/TCRP1细胞的IC50值显著高于其对照细胞（P <0.05）。结论 利用慢病毒载体成功构建了TCRP1过表达的K562细胞株，并且发现TCRP1的过表达可能增强K562细胞的增殖能力和IM耐药能力，为进一...     

携带人OCT4A基因的慢病毒载体的构建及其稳定转染K562白血病细胞株的建立

本研究旨在构建共表达人OCT4A与绿色荧光蛋白（GFP）慢病毒载体pLVX-OCT4A-ZsGreen1,并通过感染获得稳定表达重组质粒的白血病K562细胞系,观察OCT4A在其中的表达。根据Gen Bank数据库提供的OCT4A mRNA序列,合成编码mRNA基因的特异性引物序列,通过RT-PCR技术扩增出OCT4A全长片段,克隆至pCR-Blunt载体。将OCT4A DNA片段酶切回收后克隆至经EcoR1酶切线性化的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-OCT4A-ZsGreen1慢病毒重组质粒,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确。经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒并感染人白血病细胞系K562,通过流式细胞仪分选获得稳定表达的白血病细胞系,应用Real-time PCR和Western blot方法分别检测稳定转染细胞系的OCT4A mRNA和OCT4A蛋白表达。应用CCK-8法和平板细胞克隆形成试验测定OCT4A对K562细胞增殖能力的影响。结果表明,经限制性内切酶检测及基因测序证实成功构建了携带OCT4A基因的重组慢病毒;包装病毒颗粒超速离心后病毒滴度达（1.43±0.25）×10^8U/ml;病毒感染K562细胞后经流式细胞仪分选获得GFP＋细胞,实时定量PCR及Western blot证实病毒感染后OCT4A基因及蛋白的表达可有效上调;CCK-8法及平板集落形成试验显示病毒感染的K562细胞体外增殖活性明显升高,与对照组相比均有统计学差异（P〈0.05）。结论：成功构建了表达OCT4A基因的慢病毒载体,并且获得可稳定上调OCT4A表达的K562细胞株。     

沉默SET基因对急性早幼粒白血病NB4-R1细胞的作用

目的:探讨沉默SET基因对耐维甲酸急性早幼粒白血病NB4-R1细胞生物学特性的影响。方法:将含SET基因特异shRNA干扰序列的慢病毒载体pGCSIL,与其他包装质粒在293T细胞中包装成具有感染性的慢病毒质颗粒。收集并浓缩慢病毒,转染体外培养的NB4-R1细胞并建立稳定转染的细胞株。用荧光实时定量PCR和蛋白凝胶电泳Western blot验证转染后SET基因在NB4-R1细胞中的干扰效率,并检测沉默SET基因对蛋白磷酸酶PP2A表达的影响。用流式细胞术分析沉默SET基因前后NB4-R1细胞周期的变化。结果:与对照组相比,实验组SET基因的表达被有效抑制,PP2A表达增高。沉默SET基因导致NB4-R1细胞G_0/G_1期明显增加,S期细胞比例明显减少,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:利用慢病毒靶向干扰SET基因的表达可以使PP2A表达增高,并扰乱NB4-R1细胞的增殖周期。本研究为进一步研究SET相关的急性早幼粒细胞白血病临床靶向治疗奠定实验基础。     

HL-60 细胞 Nucleostemin 表达下调对 PI3K / AKT / mTOR 通路相关分子的影响简

本研究旨在探讨白血病细胞中nucleostemin （NS）基因下调对其非依赖p53通路的候选途径PI3 K/A KT/mTOR的相关分子表达的影响.通过重组慢病毒表达载体NS-RNAi-GV248转染至p53缺失型HL-60细胞以干扰NS基因的表达.用Real-time PCR技术评价转染后HL-60细胞NS基因的表达情况并检测干扰前后PI3 K/AKT/mTOR信号通路中相关分子水平表达的变化.结果表明：重组慢病毒载体NS-RNAi-GV248成功感染了HL-60细胞,在荧光显微镜下可见GFP荧光水平较高,大于80％.Real-time PCR结果显示,NS基因mRNA的抑制率在HL-60细胞中为56.5％;干扰NS的表达后PI3K、AKT和GβL基因mRNA表达量分别为0.491±0.084、0.398±0.164、0.472±0.097,下调明显,与空白对照组（分别为1.002±0.171、1.000±0.411、1.001 ±0.206）比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：在HL-60细胞中PI3K/AKT/mTOR通路相关分子的变化与NS基因的下调呈正相关,两者的关联性为证明PI3 K/AKT/mTOR信号通路可能是NS的一种非依赖p53作用途径提供了依据.     

槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究

目的 探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位。方法 经全反式维甲酸（ATRA）、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法；PML蛋白细胞分内分布定位采用免疫荧光技术；PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法。结果 （1）ATRA处理后，NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现，K562细胞无变化；经槲皮素处理后，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。（2）ATRA处理后，NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白恢复定位，HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化；槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白聚积于POD结构，随后降解，在HL-60及K562细胞，PML蛋白发生相似改变。（3）ATRA、槲皮素对各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在不同诱导剂刺激下，PML在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制；PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用。     

黄芩提取化合物单体SBX抗白血病效应及机制研究

本研究探讨黄芩提取化合物单体成分SBX对不同人白血病细胞株的抗白血病效应及其可能的相关机制。体外培养人HL-60、NB4、U937、K562、Jurkat细胞,应用CellTiter-Glo发光法进行细胞活力检测,筛选出敏感细胞株,应用流式细胞术检测SBX对敏感细胞细胞周期的影响,应用蛋白Pathway Array技术检测SBX对敏感细胞蛋白表达的影响。结果显示,SBX(10-200μmol/L,72 h)对各种类型的人白血病细胞均有抑制作用,并呈浓度依赖性(r值分别为0.86,0.88,0.95,0.94,0.96),对HL-60细胞抑制作用最强。流式细胞术显示SBX(50,100μmol/L,48h)对HL-60细胞周期的影响主要是引起G0/G1期阻滞。蛋白Pathway Array技术分析SBX(50μmol/L,48 h)对HL-60蛋白表达的影响显示,p-PKCα/βⅡ、p-p38、Cdc25B、XIAP蛋白表达水平上调,而p-AKT、p-SAPK/JNK、cyclin E、Notch4、Cdk4、Cdc2、Akt、Bcl-2、Bax、cdc42、TNF-α、p27、CaMKKa蛋白表达水平下调。结论:SBX能够抑制各种类型人白血病细胞的增殖,其中敏感细胞株为HL-60。SBX主要影响HL-60的EGFR、Ras/Raf/MAPK和Notch信号传导通路,并通过这些信号传导通路影响细胞周期相关蛋白表达的水平,导致细胞周期G0/G1期阻滞。     

大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统。方法采用EcoRⅠ酶双酶切将目的基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定。成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度。重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察转染效率及miR-1表达水平。结果测序结果显示目的基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数（MOI）50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达。结论成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体。     

HA1重组慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建ha1基因慢病毒载体并获得稳定的产毒细胞,为进一步研究异基因造血干细胞移植后ha1介导的GVHD和GVL的分离机制奠定基础。将已构建好的T-ha1质粒酶切获得目的基因后,将目的基因定向克隆入慢病毒表达质粒pRRLSIN、cPPT、PGK/GFP、WPRE,构建含有ha1基因的重组慢病毒载体,经PCR、酶切及测序鉴定其正确性,并将成功构建的pLenti-ha1质粒与包装质粒一起共转染293T细胞,通过实时定量PCR测定病毒滴度。结果表明：含有ha1基因的重组慢病毒载体经PCR、酶切和测序鉴定构建正确,且测定的病毒滴度为2.0×108TU/ml。结论：本研究成功地构建了ha1的慢病毒载体。     

热休克蛋白96白血病抗原肽抗髓系白血病效应的研究

目的研究热休克蛋白96（HSP．gp96）白血病抗原肽的抗白血病效应及相关机制。方法将不同的白血病细胞株（K562、HL-60、U937）分别分为A、B细胞株组,A组加预先构建的HSP．gp96重组腺病毒感染,B组不加以感染。将两组细胞株均制备为相应的抗原肽（分别设为A1、B1组）,外周血单个核细胞诱导树突细胞（DC）后分别负载A。及B．组抗原肽以分别获取相应的DC复合物（分别设为A1、B2组）。用四甲基偶氮唑蓝反应比色法检测各组对T淋巴细胞增殖的影响,用乳酸脱氢酶释放法检测其在不同效靶比下的自然杀伤细胞（NK）活性和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应,并比较K562来源的A：组复合物对3种白血病细胞株杀伤效应的不同。结果与A、B及B。组相比,3种不同细胞株的A1、A2和B2组均可刺激T淋巴细胞的增殖,同时也能增强NK细胞活性和CTL效应（P均〈0．05）。其中A1、A2组对NK活性和CTL效应的增强尤为显著。且随着效靶比的增加,A1、A2和B2组NK细胞活性和CTL效应也明显增强。另外,K562细胞株制备的A2组复合物的CTL效应在K562细胞中明显增强,与HL一60及U937细胞相比,差异有统计学意义。结论HSP—gp96白血病抗原肽抗白血病效应明显,经DC诱导后其作用增强,且后者对同源细胞株的杀伤效应具有特异性。     

人白血病细胞株对L-门冬酰胺酶敏感性与门冬酰胺合成酶表达水平的相关性

本研究探讨人白血病细胞株门冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AsnS)的表达水平及与白血病细胞株对L-Asparaginase(L-Asp)敏感性的关系。用实时定量PCR技术(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)检测Jurkat,HL-60,U937,NB4,THP-1,Namalwa,Karpas299和K562等8种细胞株基础的和经L-Asp处理后的AsnS表达水平,用CCK-8实验检测细胞对L-Asp处理的敏感性。结果表明,8种细胞株之间AsnS的基础表达水平存在很大程度的变异,经L-Asp处理后细胞株的AsnS表达显著上调(p0.05),AsnS低水平表达细胞对L-Asp相对敏感,而AsnS高表达细胞对L-Asp相对耐药。在8种细胞株中,U937对L-Asp高度敏感,其AsnS表达水平最低,而K562细胞株对L-Asp天然耐药,AsnS表达水平最高。结论:AsnS在天门冬氨酸耗竭后的细胞生物学行为中起着重要的作用,AsnS的表达水平反映了细胞对L-Asp的敏感性,L-Asp在AsnS低表达白血病的治疗中有潜在的应用价值。     

白血病细胞系中抑癌基因PTEN启动子区甲基化状态检测及其去甲基化研究

目的 探讨抑癌基因PTEN表达沉默的机制及诱导PTEN表达对白血病细胞的作用.方法 应用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation specific PCR,MSP)检测白血病细胞系HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937、NB4、K562中PTEN基因启动子区域甲基化状态;用甲基化转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理白血病细胞,MSP检测甲基化状态的改变、RT-PCR检测PTEN mRNA水平的改变、瑞特染色观察细胞形态学改变、膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)标记染色检测细胞凋亡.结果 检测的白血病细胞系中HL-60、Nalm-6、Raji、KG-1a、U937细胞PTEN基因显示超甲基化状态,而NB4和K562细胞显示低甲基化状态;5-Aza-CdR处理HL-60和Nalm-6细胞后,PTEN基因甲基化降低、mRNA表达水平则逐渐增高,并呈剂量依赖性,细胞出现凋亡现象.结论PTEN基因启动子区异常甲基化可能导致该基因转录表达失活或沉默,甲基化抑制剂可以诱导PTEN表达,并引起白血病细胞凋亡.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成OligoDNA,退火形成双链DNA,与HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper1.0载体、pHelper2.0载体通过lipofectamineTM2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96h提取细胞总蛋白,采用Westernblot检测NG2的表达。结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011TU/L。Westernblot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%（P〈0.05）。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。