川芎嗪对人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的逆转作用研究

目的建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP,探讨川芎嗪对COC1/DDP顺铂耐药性的逆转作用及其机制。方法采用逐步递增DDP浓度、体外间歇诱导法诱导建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP;CCK-8(cell counting kit-8)检测川芎嗪对COC1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用;GSH和GSSG试剂盒检测细胞内GSH的水平,高效液相色谱测定细胞内顺铂的含量。结果历时5个月建立了在1.0μg/mL DDP作用下生长良好的耐药细胞株COC1/DDP,耐药指数为9.44,对卡铂、长春新碱和阿霉素有不同程度的交叉耐药性;川芎嗪0.25 mg/mL对COC1/DDP的顺铂耐药性有逆转作用,逆转倍数达到3.76倍;与COC1比较,COC1/DDP细胞内GSH水平增高,顺铂含量下降,但经川芎嗪0.25 mg/mL干预后,COC1/DDP胞内的GSH水平降低,顺铂的含量增加(P<0.01)。结论川芎嗪对COC1/DDP的顺铂耐药性有逆转作用,其机制可能与干预COC1/DDP细胞内GSH/GST-π解毒系统,增加细胞内顺铂的含量有关。     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株的建立及其耐药机制的研究

目的 通过建立人卵巢癌体外耐药模型，研究卵巢癌对顺铂的耐药机制。方法应用顺铂连续作用并逐步提高药量的递增压力选择法，从人卵巢腺癌细胞ＣＯＣ１中分离出对顺铂耐药的细胞亚株（ＣＯＣ１／ＤＤＰ），并比较耐药细胞和亲代细胞某些生物学特性差异。结果ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂的耐药性是ＣＯＣ１的６．５倍，群体倍增时间较亲代细胞缩短了１２．９％。对卡铂和丝裂霉素Ｃ有不同程度的交叉耐药性，对阿霉素和５－氟尿嘧啶则保持敏感。并且耐药细胞内铂离子含量及ＤＮＡ链间交联指数均明显低于ＣＯＣ１细胞，但免疫细胞化学显示ＣＯＣ１及ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞内均无Ｐ糖蛋白表达。结论ＣＯＣ１／ＤＤＰ细胞对顺铂耐药的主要原因是细胞内药物浓度降低及ＤＮＡ链间交联形成减少，与Ｐ糖蛋白关系不大。     

人肝癌顺铂耐药细胞株 HepG2的建立

目的：体外建立顺铂（ DDP）诱导的人肝癌耐药细胞株（ HepG2／DDP）,研究其生物学特性。方法以采用药物大剂量冲击结合低剂量持续诱导方法诱导HepG2细胞株,建立人肝癌顺铂耐药细胞株HepG2／DDP;MTT法检测顺铂对HepG2和HepG2／DDP的半数抑制浓度（IC50）和耐药系数（RI）,绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间,并用流式细胞仪（ FCM ）检测细胞周期。结果历时5个月成功建成HepG2／DDP细胞株,MTT法检测DDP对HepG2的IC50为1．35μg／ml,HepG2／DDP的IC50为23．35μg／ml,RI达17生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本HepG2人肝癌细胞,且倍增时间增加;细胞周期分析发现相对于亲本HepG2细胞,G0／G1期细胞减少、S期与G2／M期细胞增多。结论成功建立稳定耐药细胞株HepG2／DDP。     

人肝癌顺铂耐药细胞株HepG2的建立

目的体外建立顺铂(DDP)诱导的人肝癌耐药细胞株(HepG2/DDP),研究其生物学特性。方法以采用药物大剂量冲击结合低剂量持续诱导方法诱导HepG2细胞株,建立人肝癌顺铂耐药细胞株HepG2/DDP;MTT法检测顺铂对HepG2和HepG2/DDP的半数抑制浓度(IC50)和耐药系数(RI),绘制细胞生长曲线及计算细胞倍增时间,并用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期。结果历时5个月成功建成HepG2/DDP细胞株,MTT法检测DDP对HepG2的IC50为1.35μg/ml,HepG2/DDP的IC50为23.35μg/ml,RI达17生长曲线表明其增殖速度明显低于亲本HepG2人肝癌细胞,且倍增时间增加;细胞周期分析发现相对于亲本HepG2细胞,G0/G1期细胞减少、S期与G2/M期细胞增多。结论成功建立稳定耐药细胞株HepG2/DDP。     

姜黄素促卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP凋亡机制探索

目的研究姜黄素对耐药卵巢癌细胞的促凋亡作用及其可能的机理。方法用MTT法检测不同浓度姜黄素、化疗药物〔顺铂(DDP),紫杉醇〕及姜黄素联合化疗药物(姜黄素+顺铂,姜黄素+紫杉醇)作用于卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP细胞48h后各组的细胞抑制率,并用流式细胞仪检测上述各组细胞的凋亡率。RT-PCR技术检测姜黄素、顺铂、姜黄素+顺铂作用于COC1/DDP细胞48h后各组的磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基(PI3KCA)mRNA的表达。结果不同浓度姜黄素作用COC1/DDP 48h后,细胞的抑制率和凋亡率随着姜黄素浓度的升高相应增高,姜黄素联合化疗药物作用组比单用化疗药物组的细胞抑制率及细胞凋亡率高(P<0.05)。顺铂与姜黄素联合用药与顺铂单独作用相比PI3 KCA mRNA的表达降低(P<0.05)。结论姜黄素能够促进卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP的凋亡,这一作用可能与姜黄素和化疗药物协同诱导该细胞系的凋亡有关,其机制可能为降低PI3 KCA基因的表达。     

姜黄素对卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP的增敏作用及其机制的研究

目的:探讨姜黄素对卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP的增敏作用并探讨其机制.方法:采用MTT法检测姜黄素对COC1/DDP细胞的增敏作用;用流式细胞仪检测单用顺铂、单用姜黄素、顺铂与姜黄素合用作用于COC1/DDP细胞48 h后的细胞凋亡率;Western blot法检测单用顺铂及顺铂与姜黄素合用后各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Survivin的表达.结果:姜黄素浓度在15～35 μmol/L以内时以一定的剂量-效应关系对COC1/DDP有明显的增殖抑制作用.顺铂的浓度在1.25～5 mg/L时加入20 μmol/L姜黄素后耐药细胞生存率下降明显(P＜0.05),尤以2.5 mg/L顺铂和20 μmol/L姜黄素联合作用时,耐药细胞生存率下降最明显;COC1/DDP中顺铂与姜黄素联合用药与单独用顺铂及单用姜黄素相比,凋亡率明显增加(P＜0.05);顺铂与姜黄素联合用药与单独用顺铂相比Bcl-2、Survivin蛋白的表达明显降低(P＜0.05),Caspase-3蛋白的表达明显增高(P＜0.05).结论:姜黄素能够显著抑制COC1/DDP增殖,并能增强该细胞系对顺铂的敏感性,其机制可能与降低Bcl-2、Survivin蛋白的表达,增加Caspase-3蛋白的表达有关.     

人卵巢癌顺铂耐药细胞株OVCAR-3/DDP的建立及相关基因表达水平的研究

目的建立人卵巢癌顺铂耐药细胞株OVCAR-3/DDP,初步探讨其耐药机制。方法采用顺铂(DDP)浓度梯度递增诱导法,建立人卵巢癌OVCAR-3细胞株的顺铂耐药细胞株OVCAR-3/DDP;通过细胞计数和MTT法评估细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期情况,以评价OVCAR-3/DDP的生物学特性;采用RT-PCR法检测Mfn2、EGFR及MMP2 mRNA水平。结果成功建立了OVCAR-3/DDP顺铂耐药细胞株,其对DDP耐药指数是1.92;与亲本细胞株OVCAR-3相比,OVCAR-3/DDP生长速度减慢,倍增期是OVCAR-3细胞的1.36倍(P<0.05);流式细胞术检测结果显示细胞主要停滞于G2/M期(P<0.05);与OVCAR-3细胞相比,OVCAR-3/DDP细胞中Mfn2、EGFR及MMP2 mRNA水平均明显升高(P<0.05)。结论建立的OVCAR-3/DDP细胞株对顺铂耐药性稳定;OVCAR-3/DDP细胞对顺铂耐药可能与Mfn2、EGFR、MMP2基因转录水平上调有关。     

hMLH1基因对人卵巢癌耐药细胞株顺铂敏感性的研究

目的 探讨错配修复基因hMLH1对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP顺铂耐药的逆转作用及其机制.方法 分别用重组质粒pcDNA3.1-hMLH1和空质粒pcDNA3.1转染SKOV3/DDP细胞.RT-PCR和Western blot检测hMLH1的表达.MTT检测转染前后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性的变化.经顺铂DDP作用后,流式细胞术和Western blot法检测细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,瞬时转染24 h后,SKOV3/DDP细胞中hMLH1 mRNA和蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05).MTT结果显示,转染细胞的IC50值(13.95±2.45)较未转染的细胞(94.16±5.18)明显减小.流式细胞仪和Western blot检测结果表明,顺铂作用24 h后,转染了重组质粒的耐药细胞的凋亡率提高到(33.33±2 31)%,同时凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达受到抑制(1.35±0.39),与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 hMLH1基因能增强卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,其机制可能与降低该耐药细胞内Bcl-2的表达水平,促进细胞凋亡有关.     

不同存在形式人卵巢癌细胞株的细胞内顺铂浓度测定

目的　了解人卵巢癌细胞株COC1及其耐药亚株COC1/DDP以多细胞团簇形式和单细胞形式存在的细胞内顺铂浓度的差异 ,探讨细胞存在形式在COC1/DDP耐药中的作用。方法　选用半贴壁生长的人卵巢癌细胞株COC1及其耐药亚株COC1/DDP ,应用常规继代培养法获取多细胞团簇 ,对照组用相应的单细胞悬液 ,高效液相色谱测定细胞内顺铂浓度。结果　顺铂作用 2h后COC1单细胞悬液和多细胞簇的胞内浓度分别是 (11.2 0 6 2 7± 1.340 6 )ng/10 6细胞和 (11.14 78± 1.176 2 )ng/10 6细胞 ,无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,COC1/DDP分别为 (5 .2 835± 0 .772 8)ng/10 6和 (4 .86 83± 1.0 380 )ng/10 6细胞 ,无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,同种存在形式的两种细胞间比较有统计学差异 (P <0 .0 1) ,前者分别为后者的 2 .1倍和 2 .3倍 ,而两种存在形式的细胞COC1与COC1/DDP细胞内顺铂浓度的差值经比较亦未发现统计学差异 (P >0 .0 5 )。结论　相同浓度药物作用下COC1细胞内顺铂浓度高于COC1/DDP细胞 ,细胞存在形式不是影响细胞内顺铂浓度的主要因素     

葡萄籽原花青素对人卵巢癌耐药细胞COC1/DDP在体外的增殖抑制作用

目的 观察葡萄籽来源的原花青素(grape seed proanthoeyanidin extract,GSPE)对人卵巢癌耐药细胞COC1/DDP在体外的增殖抑制作用,并初步探讨其作用机制.方法 以MTT法检测不同浓度的GSPE(0、20、40、80、160、320μg/ml)不同时间(12、24、36、48、72 h)对COC1/DDP的增殖抑制作用,HE染色观察细胞形态变化,流式细胞仪和TUNEL检测细胞周期和凋亡,Western blot检测细胞内Caspase-3蛋白的表达.结果 GSPE对COC1/DDP具有明显的增殖抑制作用,且呈剂量-时间依赖性,不同浓度GSPE能引起细胞形态明显的凋亡改变.流式细胞术和TUNEL表明GSPE可以诱导细胞凋亡,且随着药物浓度增加,凋亡率升高.Western blot检测显示随着药物浓度增加,Caspase-3蛋白表达增加.结论 原花青素可以在体外抑制人卵巢癌耐药细胞COCl/DDP的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与上调Caspase-3蛋白表达有关.     

卵巢癌耐药细胞株SKOV3／DDP的建立及其与凋亡途径蛋白的关系

目的：通过顺铂（cisplatin,DDP）诱导卵巢癌细胞珠 SKOV3建立耐药细胞株 SKOV3/DDP,并研究其与凋亡途径蛋白的关系。方法应用倒置显微镜观察 DDP 对细胞形态的影响,四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测 DDP 对 SKOV3和 SKOV3/DDP 细胞的增殖抑制情况,流式细胞术（flow cytometry, FCM）检测细胞凋亡率以及细胞中 X链锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor-of-apoptosis protein,XIAP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine-aspartic acid protease-3,Caspase-3）、B 细胞淋巴瘤/白血病2（B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2）和生存素（Survivin）的表达情况。结果 MTT法检测发现DDP作用后,SKOV3/DDP细胞的增殖抑制率较 SKOV3细胞显著降低（P＜0．01）,且存在着浓度和时间依赖效应（P＜0．01）。由半数抑制浓度（50％concentration of inhibition,IC50）比较得 SKOV3/DDP 细胞24、48、72h 耐药指数（resistance index,RI）分别为2．434、2．950、3．780。FCM检测表明,DDP 作用后,SKOV3/DDP 凋亡率显著低于 SKOV3细胞（P＜0．01）。与SKOV3细胞相比,SKOV3/DDP细胞中XIAP、Bcl-2、Survivin蛋白高表达,Caspase-3蛋白低表达,差异有统计学意义（P＜0．01）。结论成功建立卵巢癌耐药细胞株 SKOV3/DDP,其耐药机制可能与 XIAP、Caspase-3、Bcl-2和Survivin蛋白的异常表达有关,表明这些蛋白参与了卵巢癌DDP耐药的形成。     

紫衫醇与顺铂诱导卵巢癌SKOV_3细胞凋亡的研究

目的 :研究两种不同的抗癌药物诱导细胞凋亡的规律 ,为卵巢癌的化疗提供理论依据。方法 :紫衫醇与顺铂分别作用于体外培养的卵巢癌SKOV3 细胞系 ,通过组织细胞化学染色、荧光染色、电子显微镜、DNA凝胶电泳、流式细胞术等方法进行检测和观察。结果 :经两种抗癌药物处理的卵巢癌SKOV3 细胞出现典型的细胞凋亡特征 ,在顺铂处理 0～ 36小时内 ,细胞凋亡呈均一的持续性增强 ,在 5～ 2 5nmol ml剂量范围内呈依赖性增强 ,凋亡率最高达 72 %。紫衫醇诱导细胞凋亡亦具有时间和剂量依赖性 ,2 5nmol ml浓度处理 12小时 ,凋亡率最高达 5 5 % ;但时间过长 (>12小时 )或浓度过大 (>5 0nmol ml) ,凋亡率下降。结论 :紫衫醇与顺铂能有效地诱导肿瘤细胞凋亡 ,诱导细胞凋亡是化疗药物治疗癌症的重要机制之一     

Mifepristone对卵巢癌细胞的单己糖神经酰胺表达及耐药性的影响

目的研究单己糖神经酰胺在卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP对顺铂耐药性中的作用,探索mifepristone对COC1/DDP细胞耐药性逆转的机制.方法将耐药细胞分为顺铂组、顺铂+mifepristone组,MTT方法检测各组细胞抑制率;采用改良的Hahomori方法分别提取、纯化耐药细胞COC1/DDP(用mifepristone处理前后)和敏感细胞COC1的中性鞘糖脂,高效薄层层析、凝胶光密度成像系统分析各组CMH的差异将耐药细胞分为三组顺铂组、mifepristone组、顺铂+mifepristone组,用透射电镜观察各组细胞的超微形态结构变化.结果mifepristone可以逆转COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性,1.25μmol/L的mifepristone与浓度为(0.1～1.25)μg/ml的顺铂联合应用,使细胞的抑制率从单用上述浓度顺铂时的(8.84±6.29)%～(17..71±8.00)%上升为(15.26±6.75)%～(27.15±7.69)%(P＜0.001),且有剂量依赖性.耐药细胞的CMH表达率为(37.14±3.34)%,明显高于敏感细胞的(14.05±1.44)%(P＜0.001),耐药细胞经1.25μmol/L、5μmol/L mifepristone处理后,CMH分别下降到(26.62±2.63)%(P＜0.05)和(17.50±0.67)%(P＜0.001).顺铂和mifepristone联合作用,透射电镜观察到耐药细胞出现异染色质浓缩、边聚,产生了凋亡小体.结论mifepristone在较低浓度即可逆转卵巢癌细胞COC1/DDP对顺铂的耐药性,其增敏机制可能与抑制单己糖神经酰胺的表达、促进细胞凋亡相关.     

三氧化二砷对卵巢癌细胞抑制作用及机制的研究

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）对卵巢癌细胞HO-8910体外生长的影响及其相关机制.方法：用倒置显微镜对细胞进行观察,用免疫细胞化学染色法检测p53基因表达.结果：（1）三氧化二砷作用浓度在0～12.0 μmol/L时,随着剂量的增加对卵巢癌细胞抑制作用增强.（2）卵巢癌细胞p53基因表达增强.结论：较高浓度三氧化二砷对卵巢癌细胞株HO-8910细胞有生长抑制作用并呈剂量-时间依赖效应 As2O3作用引起卵巢癌细胞HO-8910细胞凋亡的机制与p53基因表达增强有关.     

EXPRESSION DIFFERENCES OF VASCULAR GROWTH FACTORS IN HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A549 AND CISPLATIN-RESISTANT HUMAN LUNG ADENOCARCINOMA CELL LINE A_(549)~(DDP)

Objective To elucidate the expression differences of vascular growth factors in human lungadenocarcinoma cell line A549 and cisplatin-resistant human lung adenocarcinoma cell line A549DDP . Methods RT-PCR and immunohistochemistry was used to detect the mRNA and protein expressions of vascular endothelial growth factor ( VEGF) and basic fibroblast growth factor ( bFGF) in A549 and A549DDP . Results VEGF and bFGF mRNA were expressed in A549 and in A549DDP VEGF and bFGF mRNA expression levels in A549DDP were significant higher than those in A549 (P< 0 .025 ). VEGF and bFGF protein expressions were all strong positive in A549 and A549DDP. Conclusion There are certain differences between VEGF and bFGF expressions in A549 and A549DDP . Drug-resistance of lung cancer is associated with those above genes over-expressions. Over-expression of vascular growth factors are related to drug resistance of lung cancer.