人角质化细胞生长因子2基因克隆、表达及其产物的纯化和鉴定

背景：人角质化细胞生长因子2具有广慢的生理功能，在胚胎发育、组织的修复、神经的再生、血管的生成和肿瘤发展中具有重要作用。目的：克隆人角质化细胞生长因子2基因，于大肠杆菌中表达，并检测其生物学活性，为进一步开发提供实验依据。设计：开放性实验。单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。材料：实验于2000—09／2002—05在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所病毒基因工程国家重点实验室完成。pBV220温控表达载体为病毒基因工程国家重点实验室构建．EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA连接酶（Promega公司）；人角质化细胞生长因子2特异性聚合酶链反应引物（上海博亚生物技术有限公司合成）；肝素-Sepharose CL-6B（Pharmacia公司）；快速聚合酶链反应产物纯化试剂盒、总RNA提取Trizol试剂盒、反转录-聚合酶链反应试剂盒（GIBCO公司）；质粒DNA快速提取试剂盒（博大公司）；BL-21-codon plus compent cells（Stratagene公司）。方法：用高表达菌株BL-21-codon plus compentent cells表达重组人角质化细胞生长因子2蛋白并初步纯化和检测其活性。通过反转录-聚合酶链反应从自然流产胎儿肺组织中钓取人角质化细胞生长因子2cDNA，将其克隆人pBV220载体质粒。在大肠杆菌BL-21-codon plus compent cells中表达人角质化细胞生长因子2蛋白。采用亲和层析和离子交换层析分离纯化．以细胞增殖实验测定表达蛋白的生物活性。主要观察指标：人角质化细胞生长因子2cDNA的片段长度和序列，人角质化细胞生长因子2基因在大肠杆菌中的表达，纯化人角质化细胞生长因子2的活性。结果：人角质化细胞生长因子2cDNA片段大小约500bp．人角质化细胞生长因子2蛋白在BL-21中得到高效表达，于上清中可溶性表达，SDS-PAGE显示相对分子质量约20000；人角质化细胞生长因子2蛋白对NIH3T3细胞具有显著的促有丝分裂活性，1，5，10μg／L人角质化细胞生长因子2A值（490nm）高于空白对照组，差异有非常显著性意义（分别为0.174&;#177;0．022，0．220&;#177;0、029，0．306&;#177;0．050,0．066&;#177;0．004，P〈0．001）。结论：成功克隆人角质化细胞生长因子2基因，并于大肠杆菌BL-21中得到高效表达；纯化的人角质化细胞生长因子2蛋白能刺激NIH3T3细胞的增殖，具有显著的促有丝分裂活性。     

人成纤维细胞生长因子7的基因克隆和蛋白鉴定

目的:构建人成纤维细胞生长因子7的重组原核表达质粒pGEX-4T-3-FGF7,并诱导其基因在大肠杆菌DH5α中大量表达,纯化蛋白并检验生物学活性。方法:实验于2006-12在本实验室完成。采用逆转录-聚合酶链反应技术,从人皮肤成纤维细胞内扩增编码人成纤维细胞生长因子7的cDNA序列,以DNA重组技术将获得的目的基因片段连接至原核表达载体pGEX-4T-3上,经抗生素筛选挑取阳性克隆扩增后,提取DNA进行酶切鉴定和测序。同时应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹方法对其表达产物进行特异性鉴定。超滤纯化蛋白后以四甲基偶氮唑盐法测定其在不同浓度作用下对人表皮角化细胞系生长的影响。结果:克隆出的成纤维细胞生长因子7基因的cDNA包括翻译起始密码子、编码序列和终止密码子等部分,含有成纤维细胞生长因子7基因的cDNA的表达质粒pGEX-4T-3-hFGF7在DH5α细菌体内能够表达,并且随着诱导时间的延长,成纤维细胞生长因子7基因的表达量增加,重组人成纤维细胞生长因子7蛋白主要存在于包涵体中。在所测浓度范围内该蛋白可以剂量依赖模式促进人表皮角化细胞系细胞在体外分裂增殖。结论:人成纤维细胞生长因子7基因可以在原核细胞中获得表达并具有促角质细胞增殖的生物活性,为深入研究该蛋白在皮肤创伤愈合中的具体作用奠定了基础。     

血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测术

背景:目前血管内皮细胞生长因子制备困难,来源有限,限制了临床的应用.目的:用基因工程的方法在人肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165,分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性.为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2005-04/2007-01在陕两省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:携带目的基因血管内皮生长因子165的克降质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建,PGEM-T easv 质粒购自美国Promerga公司,原核表达质粒购自德国Qiagen公司,DH5 α、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存.方法:利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段,构建表达质粒pQE30-VEGF165,在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2 -NTA进行蛋纯化.经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白.主要观察指标:①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果.②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果.③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化.④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性.⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性.结果:重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23 000的蛋白,其以不溶性的包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%左右,经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白,浓度约为0.2g/L,ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性,鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性.结论:实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白,为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源.     

小鼠生精细胞发育特异基因spafa3的表达分析和克隆纯化冰

背景:雄性哺乳动物生精细胞自发性或诱发性凋亡现象与细胞凋亡相关基因有着密切的联系.spata3是一个新发现的小鼠生精细胞凋亡相关基因.目的:探讨小鼠生精细胞发育特异基因spata3的表达特性,制备高纯度的可溶性GST-SPATA3融合蛋白.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-10/2008-08在山西医科大学生物化学与分子生物学实验室和组织学与胚胎学实验室完成.材料:pMD19-T Simple克隆载体及大肠杆菌菌株E.coli DH5α(TaKaRa公司),表达载体pET-41a(+)plasmid DNA(Novagen公司),大肠杆菌菌株E.coil BL21(DE3)(Solarbio公司);1,2,3,5,8周龄雄性和8周龄雌性BALB/c小鼠.方法:麻醉后颈椎脱臼处死小鼠,取出各小鼠的睾丸组织和8周龄小鼠的火脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、脾脏、卵巢、子宫,提取各组织总RNA.通过聚合酶链反应、定量聚合酶链反应和原位杂交研究spata3 mRNA表达及定位:通过构建原核表达载体,诱导并纯化蛋白,制备抗体.主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应分析spata3组织特异性表达.②荧光定量聚合酶链反应分析spata3的阶段特异性表达.③spata3 mRNA细胞定位的杂交信号.④SPATA3重组蛋白在原核细胞的表达及其纯化.⑤重组蛋白的Western blot 分析.结果:反转录-聚合酶链反应表明spata3具有显著的睾丸组织特异性表达特征;实时定量聚合酶链反应显示spata3在精子发生后期高表达,可能与精子细胞的变态成形过程密切相关;原位杂交证明spata3转录本主要定位在圆形和长形精子细胞内,进一步提示该基因参与了精子细胞发育后期的形态变化.DNA序列测定和SDS-PAGE分析证明spata3原核表达载体构建成功并可被商效诱导表达;Western blot印迹杂交显示纯化的SPATA3重组蛋白具有高度的特异性.结论:spata3是小鼠睾丸组织特异表达的精子发生相关基因,在圆形和长形精子细胞中处于高水平转录状态;实验获得的高纯度可溶性融合蛋白完全满足后期抗体制备的需要.     

血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测

背景：目前血管内皮细胞生长因子制备困难，来源有限，限制了临床的应用。目的：用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165，分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性。为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源。设计、时间及地点：开放性实验，单一样本观察，于2005-04／2007-01在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成。材料：携带目的基因血管内皮生长因子165的克隆质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建，PGEM-Teasy质粒购自美国Promerga公司，原核表达质粒购自德国Qiagen公司，DH5o、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存。方法：利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段，构建表达质粒pQE30-VEGF165，在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2＋NTA进行蛋白纯化。经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白。主要观察指标：①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果。②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果。③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化。④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性。⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。结果：重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23000的蛋白，其以不溶性的包涵体形式存在，占菌体蛋白的30％左右，经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白，浓度约为0．2g／L，ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性。结论：实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白，为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。     

神经细胞黏附分子L1-Ig(1-4)的原核表达及其功能

目的:利用基因克隆、表达、纯化等分子生物学手段获取具有生物活性的神经细胞黏附分子L1(L1)的Ig(1-4)结构域融合蛋白。方法:实验于2001-10/2004-12在解放军第二军医大学神经生物教研室完成。①从新生4d的SD大鼠的海马组织中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链反应法获取L1-Ig(1-4)基因,进行序列分析后构建表达载体pET28a( )-L1-Ig(1-4)。②转染大肠杆菌BL21,用IPTG诱导L1-Ig(1-4)的表达。③利用Ni2 -NTA柱纯化和复性。④用L1-Ig(1-4)融合蛋白观察培养脊髓原代神经元轴突生长情况及其活性,未加入融合蛋白的细胞做对照。结果:①克隆出编码正确的大鼠L1-Ig(1-4)基因。②并在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物占全菌总蛋白的28.3%。③Ni2 -NTA柱纯化后的纯度达90%以上。④加入融合蛋白后脊髓神经元突触的生长能力较未加入融合蛋白的细胞增强犤(56±3.8),(43±2.7)μm,P<0.01犦。结论:通过原核表达可大量获得L1-Ig(1-4)融合蛋白,该融合蛋白同样具有促神经生长的生物学活性。     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素(GNLY)质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2(IL-2)刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a( )中,得到重组质粒pET28a( )-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍(Ni)亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Westernblot)进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a( )-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞活性的研究打下了基础。     

重组人胱抑素C在大肠杆菌中的表达及纯化

目的研究构建人胱抑素C(Cys C)的重组表达质粒及其在大肠杆菌中的表达和纯化。方法采用反转录-聚合酶链反应从人肝组织中获取Cys C cDNA,并将其插入到pET-28a(+)质粒中,重组质粒pET-28a-CysC转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达可溶性CysC。重组CysC采用Ni2+-NTA系统进行层析纯化。结果核酸序列测定与预期一致,CysC表达水平达到146mg/L,约占菌体总可溶性蛋白的13.5%,表达产物用SDS-PAGE鉴定,其相对分子质量为13.3×103,经纯化后蛋白纯度达90%。结论成功构建Cys C原核表达系统和蛋白纯化,为制备抗体以及研制Cys C免疫纳米微球测定试剂奠定了基础。     

胶质细胞生长因子真核表达载体的构建及其在脊髓内的表达

目的:构建胶质细胞生长因子2真核表达载体pEGFP-N1-GGF2,观察其在大鼠脊髓内的表达。方法:实验于2004-01／10在解放军第二军医大学长征医院神经外科实验室完成。出生1周SD大鼠2只和体质量250-300 g雄性成年SD大鼠12只。将成年大鼠分为对照组和实验组,每组6只。①采用反转录聚合酶链反应方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出胶质细胞生长因子2 的全序列cDNA。②以融合蛋白方式克隆到增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1-GGF2。③采用基因注射法将阳离子脂质体Transfectam和pEGFP-M1-GGF2混合后转染至实验组大鼠胸段脊髓组织中;对照组大鼠只注射脂质体和空白质粒pEGFP-N1的混合物。基因注射后1周,两组各取3只大鼠麻醉后取材行反转录聚合酶链反应,另取3只大鼠麻醉后取出T8,T9脊髓,冰冻切片后行荧光照相,观察绿色荧光蛋白表达情况。结果:12只大鼠均进入结果分析。①大鼠胶质细胞生长因子2 cDNA的克隆结果:成功克隆胶质细胞生长因子2 cDNA。②重组质粒pEGFP- N1-GGF2的构建结果:酶切鉴定及测序分析证实成功构建胶质细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-GGF2。③反转录聚合酶链反应证明胶质细胞生长因子mRNA表达:实验组基因转染1周后局部脊髓内胶质细胞生长因子2 mRNA的表达显著增加。④pECFP-N1-GGF2基因体内转染结果:实验组注射局部脊髓内灰质和白质神经细胞内均有较多绿色荧光蛋白表达;而对照组未见荧光蛋白表达。结论:阳离子脂质体介导胶质细胞生长因子2基因体内转染的方法是可行的,增强型绿色荧光蛋白可作为报告基因观察胶质细胞生长因子2 基因在体内的表达。     

2014-2018年山西省脊髓灰质炎病毒学监测结果分析

目的评价山西省2014—2018年脊髓灰质炎（脊灰）病毒学监测情况。方法按照世界卫生组织第4版《脊髓灰质炎实验室手册》的要求进行病毒分离和鉴定，对2014—2018年山西省报告的急性弛缓性麻痹（AFP）病例及接触者粪便标本进行脊灰病毒学监测和结果分析，分离到的L20B阳性分离物做型内鉴定，由中国疾病预防控制中心（CDC）病毒病预防控制所国家脊灰实验室对脊灰病毒衣壳蛋白VP1编码区进行核苷酸序列测定和分析。结果2014—2018年山西省CDC脊灰实验室共收到927例AFP病例及其接触者粪便标本共2 042份，分离到脊灰病毒21株，分离率为1.03%，11株经鉴定为疫苗相似株，9株为疫苗高变异株，1株为疫苗衍生脊灰病毒；分离到非脊灰肠道病毒103株，分离率为5.04%。结论山西省AFP监测系统敏感，2014—2018年山西省CDC脊灰实验室在AFP病例及接触者粪便标本中未发现脊灰野病毒，山西省继续维持无脊灰状态。     

4种乙型肝炎病毒前S1抗原试剂的成本-效果分析

目的探讨乙型肝炎病毒前S1抗原(PreS1Ag)4种酶联免疫吸附试验检测试剂的经济效果。方法运用经济学的成本-效果分析方法评价4种PreS1Ag检测试剂(威海威高生物科技有限公司、上海阿尔法生物技术有限公司、北京兴盛源公司、上海复星长征医学科学有限公司)的成本和总符合率。结果 4种PreS1Ag检测试剂的单纯单次试验的试剂成本分别为8.13、7.91、8.44、8.44元,总符合率分别为0.82、0.63、0.65、0.55,成本-效果比分别为9.92、12.56、12.99、16.80。结论威海威高公司的PreS1Ag检测试剂为最佳成本-效果比检测试剂。     

SARS冠状病毒多聚酶表位区的原核表达及应用

目的原核表达SARS冠状病毒非结构蛋白RNA多聚酶表位区,了解其在SARS病毒感染诊断及作为病毒复制指标的意义。方法通过PCR扩增获得RNA多聚酶表位区基因,与原核表达载体Pet32a 连接,转化E.coliBL-21表达获得重组融合蛋白。经切胶透析纯化后,应用ELISA检测SARS患者及动物模型血清标本的IgG抗体。结果获得原核表达的RNA多聚酶表位区。ELISA检测正常人血清均阴性,SARS患者血清阳性率为95%;检测SARS病毒感染实验动物血清阳性率100%,灭活纯化病毒接种恒河猴均为阴性。结论RNA多聚酶表位区具有很好的抗原性,可用于感染诊断的检测及作为病毒复制性指标。     

有双重活性的重组胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的分离纯化

背景：研究表明,将干扰素与胸腺素α1联合应用可增强干扰素的抗病毒作用。目的：获得既具有干扰素抗病毒活性又有胸腺素α1增强免疫功能的双重活性重组融合蛋白。设计、时间及地点：体外对比试验,于2003—03／2004—12在重庆康尔威药业股份有限公司药物研究所完成。材料：融合基因片断由上海生工合成,人羊膜细胞、水泡性口炎病毒购自上海生化与细胞生物所,对照品IFNα1b、IFNα2a和胸腺素α1为市售药品。方法：选择大肠杆菌偏爱的密码子,将合成的胸腺素α1与复合干扰素编码序列构成的融和基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-22b（＋）、在宿主菌BL21（DE3）-Codon plus-RP-X中表达融合蛋白。通过硫酸铵沉淀、疏水层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子筛层析等方法进行分离纯化。采用细胞病变抑制法测定融合蛋白的抗病毒活性,采用细胞增殖实验检测融合蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。主要观察指标：重组融合蛋白抗病毒的活性和促小鼠脾淋巴细胞增殖活性。结果：①在大肠杆菌中表达的融合蛋白呈胞内可溶性表达,表达量占细菌总蛋白的20％以上。②纯化后,融合蛋白的纯度达96％以上。③融合蛋白的抗病毒活性优于市售的IFNα1b、IFNα2a。④融合蛋白的促淋巴细胞增殖活性与市售胸腺素α1相似。结论：在大肠杆菌中表达的胸腺素α1与复合干扰索融合蛋白既具有干扰素抗病毒活性又有胸腺素α1的增强免疫功能。     

脑缺血再灌注后细胞色素C和卡配因基因表达对神经细胞凋亡的影响

背景细胞凋亡与细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)、卡配因、Bcl-2家族和半胱天冬酶家族等基因表达有密切关系.脑缺血再灌注过程中,下调卡配因的表达,抑制Cyt C的释放可减少细胞凋亡.目的研究大鼠局灶性脑缺血再灌注后神经细胞凋亡及其与Cyt C和卡配因基因表达的关系.设计随机对照的实验研究.地点和材料实验地点青岛大学医学院脑血管病研究所和山东省脑血管病防治重点实验室.动物成年健康雌性SD大鼠36只,体质量230～270 g,清洁级,由中国科学院上海实验动物中心提供.方法全部实验均由所有作者完成.具体方法应用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型,应用TUNEL法观察脑缺血再灌注后神经细胞凋亡,原位杂交技术检测Cyt C mRNA和卡配因mRNA的表达.主要观察指标凋亡细胞数;Cyt C和卡配因的阳性细胞数.结果脑缺血再灌注后2 h脑组织即出现凋亡细胞,在皮质区和纹状体区分别于1 d和2 d达高峰,此后逐渐减少.脑组织Cyt C mRNA和卡配因mRNA的表达自缺血再灌注后2 h后逐渐增高,皮质区12 h达高峰[分别为(122.50±6.69)和(138.50±6.25)个/视野],纹状体区1 d达高峰[分别为(119.25±5.12)和(105.00±4.58)个/视野],以后逐渐下降.Cyt C mRNA和卡配因mRNA的表达与细胞凋亡的区域基本一致.结论脑组织皮质区神经细胞较纹状体区对缺血性损伤更为敏感,Cyt C和卡配因基因表达在诱导细胞凋亡中具有重要作用.     

急性脑卒中患者血小板活化程度以及元活苏的脑保护作用

背景:反映血小板活化程度的特异性分子血小板颗粒膜糖蛋白和肿瘤坏死因子α在正常全血中含量很少,在脑梗死患者血浆中含量增高,元活苏对脑缺血的保护作用是否与此有关?目的:通过测定急性脑卒中患者血浆血小板颗粒膜糖蛋白、肿瘤坏死因子α的含量及元活苏对缺血性脑卒中患者的脑保护作用,并与复方丹参的治疗效果比较.设计:病例分析.单位:平顶山煤业集团公司总医院内科和郑州大学第二附属医院神经内科.对象:选择2001-01/2003-10平顶山煤业集团公司总医院内科住院的高血压合并急性脑卒中患者144例.随机分为2组:观察组72例,男47例,女25例;年龄90～42岁,平均(69±11)岁.对照组72例,男49例,女23例;年龄85～37岁,平均(68±10)岁.方法:两组患者均进行常规吸氧、降压、脱水、抗凝等方法治疗,对照组给予复方丹参注射液500 mL,1次/d,用药14 d.治疗组给予复方丹参注射液500 mL,1次/d,共14 d和元活苏20mL+生理盐水250 mL,1次/d,共14 d.①入院时和治疗3周后采用欧洲卒中量表(总分最低为0分,最高为100分,分值越高,说明神经功能恢复程度越好)评估两组患者神经功能恢复情况.②入院时(时间窗24～72 h)以及治疗后3周分别抽肘静脉血5mL,采用放免法分析血浆血小板颗粒膜糖蛋白、肿瘤坏死因子α含量,分析两者水平及元活苏干预后神经功能变化.主要观察指标:治疗前和治疗3周后,①两组患者神经功能恢复情况.②两组患者血浆血小板颗粒膜糖蛋白、肿瘤坏死因子α含量.结果:144例患者全部进入结果分析.①欧洲卒中量表评分结果:两组患者治疗后明显高于治疗前[观察组:(79.95±18.64)分,(59.65±19.87)分;对照组:(74.66±15.88)分,(61.25±18.68)分,(t=2.678～4.351,P＜0.01)];治疗后观察组高于对照组(t=2.016～2.158,P＜0.05).②血浆血小板颗粒膜糖蛋白、肿瘤坏死因子α含量:两组患者治疗后明显低于治疗前[观察组:(22.12±9.52)μg/L,(50.41±22.35)μg/L;(1.05±0.24)μg/L,(1.62±0.50)μg/L;对照组:(26.66±8.22)μg/L,(48.63±21.54)μg/L;(1.35±0.44)μg/L,(1.66±0.48)μg/L,(t=2.678～4.351,P＜0.001)],治疗后观察组低于对照组(t=2.016～2.158,P＜0.05).结论:元活苏能显著能降低急性脑卒中患者血浆血小板颗粒膜糖蛋白、肿瘤坏死因子α含量,提高神经功能评分,显著改善神经功能缺损症状.     

人血管内皮生长因子与绿色荧光蛋白标记双基因共表达AAV载体的构建及鉴定

背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.     

重组水蛭素克隆的表达及其产物的分离纯化

目的：在原核细胞中表达具有生物活性的重组水蛭素变异物１（ｒＨＶ１）并进行重组产物的分离纯化研究。方法：以质粒ｐＢＶ２２０为载体，在大肠杆菌ＤＨ５α中表达ｒＨＶ１，发色底物法测定其抗凝血酶生物活性；利用超滤、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０以及凝血酶亲合层析进行重组产物的分离纯化。结果：在大肠杆菌中获得了ｒＨＶ１的活性表达，表达量约占总蛋白的１６．９％，活力达到２０～３０ＡＴＵ／ｍｌ培养液；初步的纯化研究得到了具抗凝生物活性的ｒＨＶ１纯品，ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一条带。结论：重组水蛭素变异物１的活性表达及其分离纯化研究填补了国内空白，为研制国产高效重组抗凝药物带来希望。     

血管内皮细胞生长因子受体2基因短发夹RNA介导基因沉默对白血病的抑制

背景：血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR2）在血管内皮细胞生长因子的信号转导中有主导效应，并在某些疾病包括白血病的病理性血管生成中起关键作用。另外，白血病细胞分泌的血管内皮细胞生长因子还诱导自身表达VEGFR2．从而维持自身存活、增殖。目的：观察表达VEGFR2短发夹RNA（shorthairpin RNA，shRNA）的慢病毒载体Lenti6，shVEGFR2在全身性NOD／SCID白血病模型鼠中的作用，设计：随机、平行对照、开放性实验。单位：中山大学附属第二医院儿科，中山大学生物工程研究中心。材料：实验于2004-05／2006-01在中山大学附属第二医院医学研究中心、中山大学生物工程研究中心完成。分别以HL60，EA·hy926细胞株作为实验用白血病细胞、人血管内皮细胞的来源。Block-iT Lentiviral RNAi ExpressionSystem（Invitrogen）；humanVEGFR2Mcb（PE标记，R＆D）。CD31组化试剂盒（武汉博士德公司），CD33-PE流式细胞荧光标记抗体（BD公司）。方法：（D制备并筛选VEGFR2基因的最有效siRNA，并据此设计shRNA寡核苷酸链。②构建pU6／shVEGFR2入门克隆。瞬时转染细胞，构建表达克隆Lenti6／shVEGFR2，与VimPowed”PackagingMix共转染到293FT“细胞中，产生携带表达克隆的慢病毒载体。③pU6／shVEGFR2入门克隆转染和Lenti6／shVEGFR2转导HL60细胞，MTT法测定HL60细胞抑制率。④建立HL60白血病模型后观察注入人血管内皮细胞后小鼠骨髓微血管的分布。⑤将NODISCID小鼠20只随机分为4组，每组5只：白血病模型鼠组，白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒组，白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组及白血病模型鼠静脉注射内皮细胞组。检测各组小鼠的骨髓细胞CD33表达变化、骨髓微血管密度变化及外周血细胞涂片、肝、脾的肿瘤浸润情况，以了解Lenti6／shVEGFR2重组慢病毒对小鼠白血病的作用。主要观察指标：①VEGFR2siRNA鉴定结果。②pU6，shVEGFR2入门克隆转染HL60后对其VEGFR2表达的影响。③pU6，shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6／shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后细胞抑制率比较。④慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGFNEGFR2旁分泌和自分泌的影响。结果：①pU6，shVEGFR2入门克隆转染HL60后对其VEGFR2表达的影响：VEGFR2siRNAc抑制HL60细胞效率最高，利用其构建的pU6／shVEGFR2入门克隆并转染HL60，抑制细胞效率达84．9％；显著抑制HL60细胞VEGFR2基因mRNA和蛋白的表达。②pU6／shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6／shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后细胞抑制率比较：pU6／shVEGFR2入门克隆转染、Lenti6／shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后48h细胞抑制率相近，48h后入门克隆转染组细胞抑制率明显下降（P〈0．01）；而表达克隆转导组细胞抑制率变化缓慢，在96h达高峰，120h稍降，变化无显著差异。③慢病毒介导的shRNA对HL60模型鼠VEGFNEGFR2旁分泌和自分泌的影响：白血病模型组、白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒组、白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组小鼠骨髓流式细胞仪HL60检测结果分别为（25．8％±4．9）％，（14．3％±5．1）％．（8．4＋2．6）％，三组比较，差异有显著性意义（P〈0．05）；白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组微血管密度明显小于白血病模型鼠静脉注射内皮细胞组。白血病模型鼠静脉注射重组慢病毒和内皮细胞组与其他组相比HL60细胞数最低。结论：①pLenti6／shVEGFR2表达克隆转导HL60细胞后持续高水平抑制细胞。重组慢病毒Lenti6／shVEGFR2具有抑制白血病小鼠骨髓血管生成的作用。②VEGFR2siRNA可阻断白血病HL60细胞VEGF／VEGFR2自分泌的内环路，在体外、动物体内均得到验证。③VEGFNEGFR2自分泌链和旁分泌链的联合阻断加强了抗白血病效果：