重组腺病毒Ad-huVEGF121的制备

目的：构建能够用于骨缺血研究的能表达huVEGF121的重组腺病毒载体。方法：将huVEGF121克隆至穿梭质粒，线性化后转染含骨架质粒的BJ5183菌，构建重组腺病毒质粒。酶切及PCR法鉴定；将其线性化后转染293细胞，通过观察绿色荧光监测病毒产生，免疫组化检测VEGF121表达。结果：成功的将hu—VEGF121克隆至穿梭质粒pTrack—CMV，正确构建了重组腺病毒质粒，感染293细胞得到大量病毒。结论：成功构建了huVEGF121重组腺病毒，为缺血性骨病的进一步研究奠定了基础。     

人Toll样受体2胞外区基因重组腺病毒的制备及鉴定

目的 构建含有人Toll样受体2(TLR2)胞外区基因的重组腺病毒载体并进行鉴定.方法 应用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增TLR2胞外区全长基因,克隆人pMD18-T载体并经测序验证后,通过KpnⅠ和HindⅢ双酶切将目的 片段定向克隆至经相同处理的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭质粒中.将构建止确的重组质粒pAdTrack-CMV-TLR2用Pme Ⅰ酶切线性化后转化感受态AdEasier-1细菌,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒.将鉴定正确的重组质粒pAd-TLR2经PacⅠ酶切线性化后,以脂质体法转染至293细胞中进行包装并扩增病毒.观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达并测定病毒滴度,用PCR法鉴定重组腺病毒.结果 RT-PCR扩增得到的目的 基因片段与GenBank中的序列一致,经酶切鉴定及PCR检测证实携带人TLR2胞外区全长基因的重组腺病毒制备成功,获得高滴度(3×109pfu/ml)的重组腺病毒.结论 成功制备了表达人TLR2胞外区基因的重组腺病毒,为后续研究奠定了基础.     

人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

目的　构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础。方法　自行设计一对分别含有KpnⅠ和XholⅠ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack CMV,获得重组质粒pAdTrack CMV Survivin。通过KpnⅠ和XholⅠ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy 1 的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达。结果　成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1 65×108pfu/L。Western blot检测可见16 5kD的Survivin蛋白表达。结论　该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

人β防御素2腺病毒表达载体的构建及其在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建和鉴定人β防御素2（HBD2）的重组腺病毒表达载体，并观察其转染大鼠真皮多能干细胞（dMSCs）后的表达。方法反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增HBD2全长cDNA，亚克隆至穿梭质粒（pAdTrack-CMV）中，然后转化含骨架质粒（pAdEasy-1）的大肠杆菌BJ5183，通过同源重组产生腺病毒载体质粒。PacⅠ酶切阳性的重组质粒后转染293细胞，包装出重组病毒载体。用所得重组腺病毒感染dMSCs细胞，并采用RT-PCR和荧光免疫组织化学检测其在dMSCs中的表达情况。结果 经测序、酶切及聚合酶链反应（PCR）鉴定，表明已成功地扩增到HBD2全长cDNA，并将其顺序克隆到穿梭质粒和骨架质粒中，进而组装出腺病毒表达载体。经RT-PCR和免疫组织化学证实构建的病毒载体可感染dMSCs，并有效表达HBD2。结论 本实验成功地构建了含HBD2基因的腺病毒表达载体，并证实其可在dMSCs中表达。     

人骨形态发生蛋白12基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建及制备人骨形态发生蛋白12(BMP12)基因重组腺病毒,证明其可感染脂肪组织来源干细胞并表达蛋白。方法:将包含有BMP12cDNA全长序列的BMP12-pED6质粒用限制性内切酶EcoRI进行酶切,得到一个1260bp大小的含有BMP12cDNA的目的基因片段。将目的基因片段插入质粒pcDNA3.1后,用KpnI和PmeI进行双酶切,插入pAdtrack-CMV。插入目的基因片段的穿梭质粒pAdtrack-CMV-BMP12用PmeI进行酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-1一起电转化入感受态BJ5183菌株。用PCR及多种酶切方法鉴定重组体。最终将线性化的重组质粒利用脂质体转入293A细胞中进行病毒包装。BMP12基因随着重组腺病毒在感染的293A细胞中扩增而得到复制,并通过CsCl梯度离心法得以纯化。Elisa法检测Ad-BMP12感染脂肪组织来源干细胞后BMP12的蛋白表达。结果:pAdtrack-CMV-BMP12经酶切证实有1260bp的插入片段。酶切及PCR鉴定证实BMP12基因重组腺病毒载体构建成功。GFP(green fluorescent protein)表明重组腺病毒扩增成功并制备出高滴度重组病毒。该重组病毒可成功感染脂肪来源组织干细胞并表达BMP12蛋白。结论:BMP12基因能够重组于腺病毒载体,可以进行有效扩增,产生高浓度的重组腺病毒,从而用于BMP12基因治疗的研究。     

人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack－CMV－FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ;经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ,使用PEI试剂转染293 A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ;利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ;将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ,并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。     

骨形成蛋白2重组腺病毒的构建及异位诱导成骨的研究

目的 构建骨形成蛋白2（BMP2）重组腺病毒,探讨其诱导成骨的作用。方法 将BMP2基因克隆到转移载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP2重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒。然后,用其进行裸鼠异位诱导成骨。结果经过PCR及酶切鉴定,证明获得了BMP2转移质粒pAdTrack-BMP2和BMP2腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。组织学观察显示,2周时局部大量纤维样细胞聚集,软骨细胞分化;5周时骨小梁形成,软骨细胞已退化。结论 BMP2组腺病毒的构建及其异位诱导成骨的功能为其在BMP2基因治疗中的应用奠定了良好的基础。     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂-2基因重组腺病毒载体的构建

目的　构建携载人基质金属蛋白酶组织抑制剂 2 (hTIMP 2 )基因的重组腺病毒载体 ,为基因治疗提供实验基础。方法　利用基因重组技术将腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1以及线性化的重组穿梭质粒 pTrack CMV hTIMP 2共转化BJ5 183受体菌并在其中发生同源重组 ,利用重组前后抗性的改变筛选出重组子 ,重组腺病毒质粒AdhTIMP 2经过 2 93细胞的包装 ,扩增和纯化后 ,测定病毒滴度。一步法提取细胞总RNA ,RT PCR检测hTIMP 2的mRNA。收集细胞上清 ,进行Western杂交检测TIMP 2蛋白。结果　得到了携带hTIMP 2基因的重组腺病毒 ,纯化后滴度为 4× 10 11pfu/ml,应用RT PCR和Westernblot方法 ,在转染 2 93细胞后 2 4h即可检测到hTIMP 2的表达。结论　成功地构建了携带hTIMP 2的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗提供了基础。     

miR-195重组腺病毒表达载体构建及在细胞中的表达

目的:利用AdEasy系统构建miR-195的腺病毒表达载体,为研究miR-195的功能提供条件.方法:将miRNA-195前体序列从已构建的pcDNA-miR-195载体中克隆进穿梭载体pAdTrack-CMV,通过与骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中高效同源重组,获得完整的重组腺病毒质粒.利用HEK293细胞包装并扩增重组腺病毒Ad-195.Ad-195感染肺癌细胞A549后,利用miRNA的定量RT-PCR技术检测Ad-195在细胞中表达miR-195情况.随后荧光素酶报告基因实验证明,Ad-195表达的miR-195能够作用于BCL2基因上预测的miR-195靶位点.结果:实时定量PCR检测显示,Ad-195感染肺癌细胞A549后,miR-195表达水平有显著的上调.结论:miR-195的腺病毒表达载体构建成功,能够用于在细胞内过表达具有生物学功能的miR-195.     

腺病毒介导CTLA4Ig及CTLA4双基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的制备CTLA4Ig及CTLA4双基因共表达腺病毒载体,检测重组腺病毒在骨髓间充质干细胞(BMMSCs)中的表达。方法构建大鼠CTLA4Ig融合基因,将CTLA4Ig及CTLA4基因经IRES2连接,通过同源重组获得重组腺病毒表达载体,并在293细胞中进行病毒包装和扩增。检测CTLA4Ig和CTLA4在BMMSCs中的共表达情况及其免疫抑制功能。结果通过同源重组获得携带CTLA4Ig-IRES2-CTLA4的重组腺病毒表达载体,PacⅠ酶切鉴定正确,与脂质体共转染293细胞获得重组腺病毒。用重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达CTLA4Ig及CTLA4,且此类细胞具有明显抑制淋巴细胞反应的功能。结论重组腺病毒感染的BMMSCs可同时表达分泌型CTLA4Ig和膜结合型CTLA4,通过阻断协同刺激通路方式进一步增强BMMSCs的免疫抑制功能。     

双基因重组腺病毒表达载体pAdxsi—GFP-HIF—KGF的构建及表达

目的：构建同时携带低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和角质细胞生长因子（KGF）的腺病毒载体（pAdxsi—GFP—HIF—KGF）,观察其在A549中的表达。方法：从低氧处理A549细胞中PCR扩增HIF—1αDNA,并连接到载体pShuttle—CMV—EGFP上得到重组质粒pShuttle—GFP—HIF,同时将从质粒pIRES2一EGFP—KGF扩增的KGF基因也克隆其上,获得穿梭重组质粒pShuttle—GFP—HIF—KGF。再将其重组到pAdxsi病毒骨架载体上,构建携带HIF-1仅和KGF双基因的重组腺病毒载体。观察重组腺病毒转染3_549细胞后表达情况。结果：证实携带HIF—1α和KGF双基因的重组腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF成功构建。其转染A549细胞后可有效表达HIF一1和KGF蛋白,48h时HIF-1蛋白表达水平为（56．36±4．53）ng／ml,KGF蛋白表达水平为（60．20±2．92）ng／ml。结论：成功构建了双基因腺病毒载体pAdxsi—GFP—HIF—KGF,其可有效转染表达,具有进一步在肺损伤防治应用的前景。     

携带人鞘氨醇激酶及突变体基因重组腺病毒载体的制备及表达

目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPK^wt)及其突变体(SPK^DN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体。方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme线性化后,电转化E.coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac I线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性。结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性。结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础。     

CD/5-FC自杀基因系统治疗胰腺癌的实验研究

为探讨自杀基因CD/5-FC系统对胰腺癌的杀伤作用及作用机制,应用细菌内同源重组法构建含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）基因的腺病毒载体,经293细胞包装、扩增,氯化铯密度梯度离心制备纯化CD腺病毒液,体外转染人胰腺癌细胞,并给予前药5-FC,观察其体外杀伤效果;并建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内直接注入CD腺病毒液,随后腹腔内注入5-FC,观察CD基因的原位治疗效应。含CD基因腺病毒载体经酶切鉴定正确,包装纯化后,检测病毒滴度为2×1011pfu/ml,将重组腺病毒转染胰腺癌细胞株后,可见5-FC对转导入CD基因的胰腺癌细胞有明显细胞毒性作用,而对未导入CD基因的人胰腺癌细胞毒性较低,体内实验显示CD基因原位转导对裸鼠胰腺癌疗效较明显。腺病毒介导CD基因,不仅转染效果强,而且加用5-FC后,可直接或通过旁观者效应杀伤胰腺癌细胞或抑制移植瘤的生长,可作为胰腺癌基因治疗的有效方法。     

骨形态发生蛋白4重组腺病毒的构建及其对NIH3T3细胞成骨分化作用的研究

目的:构建骨形态发生蛋白4(BMP4)重组腺病毒,探讨其对NIH3T3成纤维细胞向成骨方向分化的影响。方法:将BMP4基因克隆连接到载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP4重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒。利用BMP4重组腺病毒转染NIH3T3细胞,采用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和western-blot检测BMP4在细胞中的mRNA和蛋白表达。Gomori改良钙钴法检测BMP4重组腺病毒转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达;von kossa染色检测BMP4重组腺病毒转染后NIH3T3细胞的成骨分化情况。结果:获得了BMP4转移质粒pAdTrack-BMP4和BMP4重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒。BMP4在转染后的NIH3T3细胞中得到表达,表达的BMP4蛋白具有生物学活性。转染后的NIH3T3细胞碱性磷酸酶表达增加。BMP4促进了NIH3T3细胞向成骨方向分化,形成钙结节。结论:本实验成功构建了BMP4重组腺病毒;BMP4重组腺病毒可促进NIH3T3细胞向成骨方向分化。     

腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下：利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子（CD11a promoter,CD11Ap）、甲病毒载体元件（nsP）、目的基因（GFP）、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数（100MOI）分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP＋细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP＋细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。     

重组NIS基因腺病毒的制备及在心肌细胞中的特异表达

目的 构建肌凝蛋白轻链-2(MLC-2v)启动子调控的NIS腺病毒载体,探讨外源基因在心肌细胞中的特异性表达和NIS作为报告基因的可行性.方法 将MLC-2v启动子和NIS基因亚克隆至腺病毒穿梭载体,再与含有骨架质粒(pAdEasy-1)的大肠杆菌(BJ5183)同源重组,经人胚肾细胞(HEK293)包装并扩增得到重组腺病毒Ad-MLC-NIS,同时构建巨细胞病毒(CMV)启动子调控的腺病毒Ad-CMV-NIS、仅含有启动子的腺病毒Ad-MLC和仅含有NIS基因片段的腺病毒Ad-NIS作为对照组.腺病毒体外感染心肌细胞和非心肌细胞,通过Western blot检测NIS蛋白的表达,行动态摄碘及NaClO4摄碘抑制实验观察NIS蛋白的功能和特性.通过台盼蓝染色实验检测腺病毒感染及NIS摄碘情况对心肌细胞活力和增殖的影响.结果 成功构建重组NIS腺病毒.Western blot检测示感染Ad-CMV-NIS的心肌细胞和非心肌细胞均呈NIS蛋白高表达;感染Ad-MLC-NIS的非心肌细胞出现微量蛋白表达,而心肌细胞中NIS蛋白高表达.动态摄碘实验示感染Ad-MLC-NIS的H9C2细胞、A549细胞、U87细胞摄碘峰值分别为5844.0、833.6、846.0放射性计数·min-1.H9C2细胞的摄碘被NaClO4抑制.感染复数(MOI)为100的腺病毒感染心肌细胞,感染和摄碘实验对心肌细胞活力和增殖的影响较小.结论 MLC-2v启动子调控的腺病毒载体可使外源基因NIS在心肌细胞内特异性表达,表达的NIS蛋白具有摄碘功能,为NIS在心肌中作为报告基因的研究奠定了基础.     

重组腺病毒和质粒对心肌缺血治疗效果的比较

目的：研究不同载体对基因治疗效果的影响。方法：采用本实验室建立的犬心肌缺血动物模型，通过冠状动脉造影和TTC染色两种方法比较了携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒Ad-HGF和质粒puDKH对心肌缺血的治疗效果；并且在体外采用绿色荧光蛋白报告基因测定了不同载体对原代心肌细胞的转染率。结果：重组腺病毒Ad-HGF对心肌细胞的转染率和心肌缺血的治疗效果均发于重组质粒puDKH.结论：导入系统是影响基因治疗效果的关键因素之一。