大鼠肝纤维化相关基因的差异表达分析

目的 寻找大鼠正常肝组织与纤维化肝组织间的差异表达基因，从基因水平阐明肝纤维化的发生机制。方法 采用mRNA差异显示法(mRNA differential display PCR，DD-PCR)，分别提取正常肝组织及纤维化肝组织的总RNA，进行逆转录PCR，PCR产物于6％变性聚丙烯酰胺凝胶(PAG)上电泳，放射自显影后寻找两者间的差异片段，回收差异片段进行2次PCR，对2次PCR产物采用反向RNA印迹法(Northern杂交)鉴定，以排除假阳性，将有差异的PCR产物克隆到质粒载体上，测序并进行同源性比较。结果 从凝胶中共选出16条差异带，12条获得再扩增。对其中4个差异带进行克隆和反向Northern杂交鉴定，获得2条有显著性差异的cDNA片段(N2、F1)。同源性分析显示，N2与小家鼠载脂蛋白aH5(apoa5)基因序列94％同源，未发现与F1片段相同的基因序列。结论 应用mRNA差异显示技术获得1条与肝纤维化相关的特异表达基因，对寻找肝纤维化的防治方法具有重要意义。     

高氡暴露地区居民肺癌组织已知基因和相关基因分析研究

目的研究高氡暴露地区居民肺癌组织中部分与肿瘤相关的基因突变规律和分离与肿瘤相关的新基因,旨在探讨肺癌发生的机制.方法采用PCR扩增、PCR-SSCP电泳、mRNA差异显示和序列分析等方法.结果5例标本p53 PCR-SSCP电泳呈阳性结果,其中3例经克隆测序发现有碱基置换.7条差异片段经克隆测序后发现,其中NA7与Genbank EST中的A1208667序列同源性达95%以上;NG2与5条基因序列同源性高达98%;CA1可能是一个新的差异基因片段.结论室内氡浓度在200～338 Bq·m-3·a-1范围内的7例肺癌病例中有5例发生p53基因突变,p53基因突变还可能与肺癌患者的年龄及吸烟史有关.从高氡暴露地区居民肺癌和正常肺组织中获得3条与肿瘤相关的基因片段.     

南京某小学一起流感样暴发疫情实验室检测及流感病毒HA1基因特性分析

目的 了解2015年1月南京市某小学一起流感暴发疫情致病流感病毒HA1基因的序列特征和变异特点,分析现有的流感疫苗株对人体的保护情况。 方法 对此次疫情采集的咽拭子标本采用荧光定量PCR对所提核酸进行甲型/乙型流感病毒的检测,阳性核酸进一步分型检测。阳性咽拭子使用MDCK细胞进行病毒分离,阳性病毒培养液提取核酸, RT-PCR扩增HA1基因片段并测序。序列分析使用MEGA 5.2软件邻接法构建系统进化树。 结果 经荧光定量PCR鉴定,采集的10例病例咽拭子中,5例为B型 Yamagata系流感病毒阳性。所分离的毒株间HA1的核苷酸同源性为100%;与2015年度国内外疫苗推荐株高度同源,序列相似性达99.5%以上。与国内外疫苗株相比多个位点发生了氨基酸突变, 其中,D196N和R141G位于抗原决定簇; 196位增加了一个糖基化位点。 结论 此次疫情流行的B型Yamagata系流感流行株与同年度国内外疫苗株HA1基因同源性高,疫苗有很好的保护作用,建议在校学生主动接种预防; HA1 区域的氨基酸变异涉及抗原决定簇,需加强监测。     

粪便标本中诺如病毒GⅡ拷贝数定量检测方法的建立和应用

目的 构建诺如病毒GⅡ（Norovirus Genogroup Ⅱ,NoV GⅡ）拷贝数标准质粒及其检测体系。方法 将合成高度保守的NoV GⅡ基因序列片段克隆至pUC57载体上,构建NoV GⅡ标准质粒,采用聚合酶链反应（PCR）进行验证。通过实时荧光定量PCR扩增曲线结果绘制Ct值与病毒拷贝数的标准曲线,求得其相应的标准曲线方程。采用建立的标准质粒及其检测体系对2018年12月昆明市儿童医院4份临床粪便标本进行检测。结果 经PCR验证,NoV GⅡ拷贝数的标准质粒构建正确。采用实时荧光定量PCR的扩增曲线获得Ct值与病毒拷贝数相对应的标准曲线方程为Y=-3.972X+39.03,R²=0.991,4份粪便标本原液NoV GⅡ病毒拷贝数分别为30 443.45、9 468.40、53 176.69、4 493.12 copies/μL。结论 成功建立用于检测粪便标本中NoV GⅡ病毒拷贝数的标准质粒及其检测体系,可为疾病的预防控制和相关试验研究提供有效的定量检测方法。     

新型冠状病毒核酸检测样本DNA污染鉴别方法研究

目的 采用不同实时荧光PCR方法检测各类型DNA污染模拟样本,分析检测方法性能,为在新型冠状病毒(简称新冠病毒)核酸检测中鉴别DNA污染提供依据。 方法 取实验室保存的新冠病毒RNA核酸样本和新冠病毒阳性质控品(含病毒序列的质粒样本),按不同比例混合,并进行梯度稀释,制成模拟样本。分别使用实时荧光RT-PCR、灭活逆转录酶前加样并去除RT步骤的PCR(PCR Set 1)和灭活逆转录酶后加样并去除RT和灭活步骤的PCR(PCR Set 2)三种不同方法,使用同一型号设备对同一批模拟样本进行检测。记录并分析检测结果,确定最佳的DNA污染判断方法。 结果 新冠病毒RNA核酸样本中,相比实时荧光RT-PCR,PCR Set 1下所有样本的Ct值增高2-4个循环,PCR Set 2中除原始样本N基因阳性外,均为阴性。新冠病毒DNA污染样本三种方法检测Ct值无明显差异。含等量DNA污染的混合污染样本和含梯度DNA污染的混合污染样本三种方法检测显示Ct值存在差异。三种方法检测不同新冠病毒基因,变化规律无明显差异。 结论 PCR Set 1和PCR Set 2两种方法均可用于鉴别DNA污染,特别是PCR Set 2方法对各浓度的DNA污染均有较好的区分能力。     

结核分枝杆菌Lsr2蛋白原核重组表达及其多克隆抗体制备

目的 利用原核系统获得重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备抗Lsr2多克隆抗体。 方法 以临床标准株 H37Rv DNA为模板,合成引物PCR扩增Lsr2核酸序列,插入原核表达载体pET28a,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,柱上复性纯化后,重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备并纯化抗Lsr2多克隆抗体,采用间接ELISA和Western-blotting实验对抗体进行验证。 结果 成功构建pET28a-Lsr2表达质粒,重组蛋白Lsr2经SDS-PAGE电泳鉴定分子量为14 kD。亲和层析及柱上复性后,纯化的重组蛋白纯度在95%左右。制备的抗Lsr2多克隆抗体效价在1:5.5×10⁶以上,并能特异性识别纯化的重组蛋白和结核分枝杆菌菌体蛋白。 结论 成功在原核系统内表达并纯化了重组结核分枝杆菌Lsr2蛋白,制备了高效价的抗Lsr2多克隆抗体,为进一步研究Lsr2蛋白的功能,筛选其下游相互作用蛋白以及相关分子机制研究奠定了基础。     

一起因厨师携带副溶血性弧菌引起的食物中毒事件检测与溯源

目的 查明一起食物中毒事件发生原因。 方法 采用传统细菌分离鉴定和实时荧光PCR检测相结合的方法对样本进行鉴定,对分离出的副溶血性弧菌进行常规鉴定、血清分型和脉冲场凝胶电泳分型(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)分析,图谱用BioNumerics软件分析并绘制聚类分析图,对分离菌株进行分子分型和同源性分析。 结果 共分离出3株副溶血性弧菌,两株来自病例,一株来自制作凉菜的厨师,血清型均为O3:K6型,经PFGE聚类分析得到2种带型,两名病例菌株带型完全一致,与厨师的菌株带型存在一个条带的差异,为高度相关株。 结论 推断此次食物中毒是由厨师携带副溶血性弧菌污染凉菜所引起的。     

冠状动脉磁共振成像的扫描技术探讨

目的 分析影响冠状动脉磁共振成像质量的各种因素,对扫描方法进行质量控制和参数优化。方法 利用1.5T超导磁共振和心脏SENSE专用线圈,采用二维屏气,三维导航,全心成像三种方法结合脂肪抑制,T2预脉冲,呼吸导航,心电门控技术,使用三维平衡稳态快速进动成像序列对12例受检者进行冠状动脉磁共振成像。结果 右冠状动脉、左冠主干、左前降支、左回旋支显示良好,长度优于文献报道。全心成像法可以多角度任意方位观察,黑血技术对冠脉内血栓、斑块显示好。结论 定位、线圈、序列、呼吸导航和TD等参数是影响冠状动脉磁共振成像的关键因素。     

正常细胞与镉转化细胞抑制消减cDNA文库构建

目的 构建正常人支气管上皮细胞(16HBE)与氯化镉诱导转化16HBE细胞间差异表达基因的消减cDNA文库.方法 以16HBE为驱动子,氯化镉诱导转化16HBE细胞为检测子,应用抑制性消减杂交(SSH)方法构建cDNA文库,经2次消减杂交和2次PCR后,将巢式PCR产物插入载体,随机挑选克隆进行鉴定.结果 得到纯度高及完整性好的总RNA和mRNA,并扩增出良好的双链cDNA,cDNA与接头的连接效率＞25％,最终使差异表达基因得到富集;经蓝白菌落筛选,获得1 200余个白色阳性克隆;随机挑选50个白色克隆进行PCR扩增,显示96％克隆均有100 ～ 600 bp的插入片段,这些片段可能是差异表达基因cDNA片段,提示用SSH法及T/A克隆技术有效构建了两细胞株间差异表达基因的消减cDNA文库.结论 成功创建正常16HBE细胞与镉转化16HBE细胞差异表达基因消减cDNA文库.     

人防御素-5基因原核表达载体pRSET-A的构建

目的利用分子生物学技术和方法将pRSET—A质粒改建为带有人α-防御素5（HD-5α）基因的新型表达载体pRSET—HD-5α。为大量生产和提纯具有生物活性人防御素5抗菌肽的研究提供实验基础。方法PCR技术，以设计的引物P1／P2从cDNA文库中扩增人α-防御素5基因片段，并将扩增出来的目的基因和pRSET—A质粒用BamHI和EcoRI双酶切后连接构成重组质粒，然后转化大肠杆菌DH-5α，筛选阳性克隆。最后对PCR及酶切鉴定含有目的基因的克隆进行测序和电泳。结果获得α-防御素-5基因片断大小正确，经测序证明其碱基序列为编码目的基因的正确序列；电泳结果证明已将此片段克隆到pRSET—A内。结论成功构建了HD-5α基因的新型表达载体pR—SET—A／HD-5α。