胚脑组织中VLDL受体Ⅱ型的克隆,表达及其对VLDL结合能力的测定

目的探讨极低密度脂蛋白(VLDL)受体亚型变化在胚胎发育中的生物学意义。方法利用RT-PCR技术检测胚胎不同组织中VLDL受体亚型mRNA的分布,然后从人胚胎脑组织中克隆VLDL受体Ⅱ型(VLDLRⅡ)的全长eDNA,构建了VLDLRⅡ型真核表达载体,将其导入1d1-A7细胞,经G418筛选获得稳定表达Ⅱ型受体的1d1-A7细胞。测定这些细胞与荧光染料DiI标记的VLDL结合能力。结果 VLDLRⅡ型与VLDLR Ⅰ型的配体结合能力存在明显差异,Ⅱ型受体的结合能力仅为Ⅰ型受体的50％左右。结论提示VLDLR亚型的功能差异可能在胚脑发育过程中具有独特的生物学意义。     

人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达

目的：克隆人DOC—2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)，并在原核细胞中表达。方法：用RT—PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC—2基因，并克隆到载体pUC—19中；经测序证实后，用Bam3HI／EcoRI双酶切，亚克隆到原核表达载体pGEx—4T—1，并转化E.coli DH5α菌株。取工程菌，用IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS—PAGE鉴定。结果：①经RT—PCR、测序和酶切鉴定，成功地克隆了人nDOC—2基因。②经IPTG诱导的重组质粒pGEX—4T—nDOC—2表达出相对分子质量(Mt)约为5000的融合蛋白，与预期的结果相符。结论：成功克隆到人DOC—2氨基端PID结构域，并在E.coliDH5α中表达出GST-nDOC—2融合蛋白。     

编码人肝脂解激活受体跨膜域和配体结合域的基因cDNA片段的克隆及表达

目的和方法 :研究发现肝细胞膜apoCIII受体在性质、分布及功能上与人肝脂解激活受体 (lipolysisstimulatedreceptor,LSR)极为相似 ,因此我们拟克隆、表达LSR基因cDNA中编码跨膜域与配体结合域的片段 ,以进一步探讨LSR与apoCIII及VLDL的结合特性 ,确定LSR的结构是否与apoCIII受体具有同源性。本研究以大鼠肝脏LSRcDNA序列为基础 ,通过同源性分析寻求到与大鼠肝LSRcDNA序列具最高同源性的人肝mRNA序列XM - 0 2 86 70 ,并以其为模板设计一对引物 (P1:5 '-ATATAAGCT TATGCTGCCCTGTACCTACCAGATG - 3';P2 :5 '-…     

大鼠Fas配体基因的克隆

目的 研究Ｆａｓ配体（Ｆａｓ ｌｉｇａｎｄ,ＦａｓＬ）在移植免疫方面的作用,克隆其编码的全部ｃＤＮＡ序列,并添加Ｋｏｚａｋ序列,以便在直核细胞高效表达大鼠ＦａｓＬ。方法 从大鼠的睾丸组织中提取总ＲＮＡ。下游引物以ＲＴ－ＰＣＲ的方法扩增出－９３１ｂｐ的ＤＮＡ征段,将这一片段重组于ｐＢＲ－ＲＳＶ载体中,酶切鉴定插人片段正确后进行全列分析。结果 证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的大鼠ＦａｓＬ基因,与     

趋化因子配体18重组成熟肽段的表达

目的 构建PET SUMO-CCL18原核表达质粒,并表达、纯化获得重组趋化因子配体18成熟肽段.方法 从人卵巢癌组织中克隆CCL18基因全长,继而扩增表达成熟蛋白质的核酸序列,连接入PET SUMO载体,重组阳性克隆转入感受态细胞BL21(DE3)中IPTG诱导表达,基质辅助激光解吸/电离质谱技术(MALDI-TOF)验证后以SUMO蛋白酶切除载体部分,纯化浓缩,MALDI-TOF鉴定表达结果.结果 测序分析证实,克隆入PET SUMO载体的CCL18序列与Genbank中报道序列完全一致,纯化后蛋白质谱鉴定与天然CCL18成熟蛋白序列一致.结论 成功构建了高表达CCL18蛋白的表达系统,得到重组CCL18成熟肽段,为进一步研究CCL18蛋白在卵巢癌中的作用提供实验基础.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的克隆人Flt3配体（Flt3 LIg and，FL），并在CHO细胞中进行表达。方法从健康人外周血中提取总RNA，通过RT-PCR技术，扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段，经DNA测序证实后，将得到的片段基因插入pcDNA3．0表达载体，构建了pcDNA3．0-FL真核表达载体；将重组质粒pcDNA3．0-FL转染CHO细胞．经G418筛选出阳性细胞克隆，扩大培养，提取细胞总蛋白，用SDS—PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24000处有一显色条带。结果FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3．0中并在CHO细胞中成功表达。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．0-FL并在CHO细胞中成功表达，为FL的相关研究和应用开发奠定了基础。     

甲状腺素对胃腺癌细胞VLDL-R选择性剪接的影响

目的探讨甲状腺素对低分化胃腺癌细胞MKN45细胞中极低密度脂蛋白受体(VLDL-R)选择性剪接的影响。方法在体外,用一定浓度的甲状腺素与MKN45细胞温育不同时间后,采用RT-PCR和Western印迹技术检测两型VLDL-R mRNA和蛋白质的表达水平,以两型受体的比值间接反映甲状腺素对VLDL-R选择性剪接的影响。结果甲状腺素可明显上调两型VLDL-R的表达,Ⅱ型受体与Ⅰ型受体mRNA的比值随时间延长逐渐增大。结论甲状腺素可显著增强VLDL-R的选择性剪接,表现为Ⅱ型受体表达的增高幅度明显大于Ⅰ型受体。     

增殖诱导配体基因的克隆、表达及生物学活性分析

目的克隆人增殖诱导配体(APRIL)基因,分析APRIL蛋白的生物学活性。方法采用RT2PCR技术,从肿瘤细胞株总RNA中克隆了APRIL全长编码基因;构建了APRIL胞外可溶性片段(sAPRIL)的原核表达载体,对表达的蛋白初步纯化后进行生物学活性检测;构建了APRIL编码区的真核表达载体,经脂质体转染转化细胞株,流式细胞仪和MTT法分析表达产物对细胞周期及细胞生长的影响。结果sAPRIL原核表达载体经IPTG诱导后,发现在相对分子质量(Mr)20×103处有一明显的表达条带,纯化蛋白进行初步活性测定显示其可以剂量依赖方式促进细胞的生长;细胞转染实验证实APRIL能促进多种转化细胞的增殖,但对细胞周期无明显影响。结论成功克隆了人APRIL基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌进行了表达;构建了APRIL真核表达载体,初步分析了APRIL的生物学活性,提示APRIL在肿瘤细胞增殖过程中可能起了重要作用,为进一步进行APRIL基因的功能研究及其临床应用奠定了实验基础。     

牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

目的:利用原核细胞表达牛口蹄疫病毒受体通用亚基整联蛋白αv的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:以含有牛整联蛋白全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到位于αv成熟肽氨基端的LBD基因片段,经酶切消化处理后,与同样酶切处理的原核表达载体pPRoEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRo/αvLBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达αvLBD蛋白。通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:成功构建了pPRo/αvLBD原核表达载体,实现了重组αvLBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其Mr约为40000,主要以包涵体形式存在于菌体中。制备的兔多克隆抗体效价达1∶25600以上。以Western blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。结论:实现了牛口蹄疫病毒受体通用亚基αvLBD的高效表达和高效价多克隆抗体的制备,为深入研究整联蛋白αv在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础。     

EphB2配体结合域基因片段的高效表达

目的;对酷氨酸蛋白激酶受体ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因进行表达研究。方法：编码ＥｐｈＢ２胞外的配体结合区基因片段克隆于ｐＢｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（－）质粒中,经全自动序列分析仪测正确后,再克隆重组人表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１,构高效表达克隆ｐＨＴ。转化大肠杆菌ＤＨ５α表达。结果：经ＩＰＴＧ诱导５ｈ,蛋白表达即达高峰,ＳＤＳ ＰＡＧＥ及凝胶密度扫描分析,表达出约４１ＫＤ大小的蛋白,占菌体总蛋白的３５％     

人P选择素lectin基因片段的克隆及表达

应用PCR技术扩增P选择素lectin基因 ,克隆入pET42b (+)载体 ,测序验证后在大肠杆菌BL2 1中表达了lectinC端融合 6×His蛋白 ,表达产物经Ni2 + NTAsuperflow亲和柱纯化 ,纯度可达 90 %以上 ,得率为 0 9mg/ 10 0ml,其表达量达到总菌体蛋白的 15 %。SDS PAGE和Western印迹试验显示 ,表达产物相对分子质量为 130 0 0。     

低密度及氧化低密度脂蛋白对内皮细胞表达血栓调节蛋白的影响

目的观察低密度及氧化低密度脂蛋白对细胞表达血栓调节蛋白的影响.方法用低密度和氧化低密度脂蛋白处理培养的ECV-304细胞,24h后分别收集培养液及细胞,用ELISA方法检测上层培养液中的可溶性血栓调节蛋白(sTM)及细胞总TM含量.结果两者均呈剂量依赖方式促进TM的表达和sTM的分泌,氧化低密度脂蛋白的作用明显强于低密度脂蛋白,而氧化低密度脂蛋白对低密度脂蛋白有氧化修饰作用.结论 TM表达及sTM分泌增加可能是脂蛋白损伤细胞的结果,但具体作用有待于进一步研究.     

Lipoprotein size distributions from the analytical ultracentrifugation of serum and lipoprotein samples

A FORTRAN computer program is presented for the reduction to a lipoprotein size distribution of data from the analytical ultracentrifugal analysis of total low density lipoproteins at a density of 1·0.63 g/ml. It is a simple but versatile program using schlieren photographs reduced to x and y co-ordinates as the input. The program accommodates different rotor speeds, temperatures and background solution viscosities, and will accept up to five photographs taken at any time before or after the rotor has reached full speed. Output consists of a lipoprotein diameter distribution and a graph with log (S_f+5) as x-axis. Lipoprotein concentrations are also calculated.     

SARS冠状病毒受体结合域在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的为了研究SARS冠状病毒感染与免疫和跨种属传播机制，从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒spike蛋白基因中，克隆病毒受体结合域（receptor binding domain，RBD）基因片段，在大肠杆菌中进行表达。方法用PCR方法扩增RBD基因，先经T-A连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序鉴定，双酶切后进一步亚克隆至质粒pGEX-6p-3，构建原核表达重组质粒，通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达，并用SDS-PAGE和Western-blotting方法检测表达情况。结果扩增了RBD的编码基因并成功构建了其原核表达载体pGEX-6p-3-hsRBD和pGEX-6p-3-csRBD，RBD能够在大肠杆菌中获得良好的表达，表达的融合蛋白相对分子质量约为47000。结论本工作利用基因工程技术表达了两物种来源的SARS冠状病毒的RBD，两者具有高度的同源性，因此我们可通过配基受体结合实验，为进一步研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。     

氧化低密度脂蛋白新基因OLRG-1的克隆及组织分布

用改进的差异显示反转录－ＰＣＲ技术，从血管内皮细胞中获得了一个氧化低密度脂蛋白诱导差异表达的ｃＤＮＡ片段。以此片段为探针，从人主动脉ｃＤＮＡ文库中筛选了一个新的全长ｃＤＮＡ。其核苷酸总长４１３７ｂｐ，编码６４２个氨基酸的蛋白质。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证实氧化低密度脂蛋白诱导内皮细胞后，该基因表达减低了３倍，基因定名为ＯＬＲＧ－１。ＯＬＲＧ－１为一多组织表达的基因，与人ＮＳ１－ＢＰ基因高度同源，氧     

自身核抗原U1SnRNP70kD多肽分子中U1RNA结合功能区的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身核抗原Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽分子中Ｕ１ＲＮＡ结合功能区（Ｕ１ＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，Ｕ１ＢＤ）的ｃＤＮＡ，经ＤＮＡ测序证实以后定向插入原核表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，进而导入大肠杆菌中表达重组蛋白。免疫印迹法研究表明：９６％（４８／５０）的抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清能够识别该重组蛋白，证实Ｕ１ＢＤ重组蛋白具有Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗原性，而且Ｕ１ＢＤ是Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽上主要抗原表位区域，能够被大多数抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清识别。这为今后对Ｕ１ＢＤ抗原表位精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性以及制备重组抗原用于临床检测等研究奠定基础。     

新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化

目的 构建新型人内毒素结合肽(a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP_(25))及其突变体(mutant of EBP_(25),mEBP_(25))的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用PCR法,扩增EBP_(25)基因,构建pET-30-EBP_(25)融合表达载体并转化E.coli DH5α扩增.重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP_(25)第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将二者转化至E.coli BL_(21)(DE_3)PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His-Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化. 结果 两次测序结果 显示人EBP_(25)和mEBP_(25)重组序列和理论设计序列完全一致后,经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳、Western 印迹证实蛋白表达的特异性,并对蛋白进行纯化,获得EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白. 结论 构建、表达纯化了EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素/脂多糖活性奠定了基础.     

一种新槲寄生蛋白A链的基因克隆及序列分析

目的克隆槲寄生蛋白具有N-糖苷酶活性的毒性A链。方法利用硫酸铵沉淀、亲和色谱和离子交换色谱法,从吉林产槲寄生[Viscum coloratum(Komar．)Nakai]中提取、分离、纯化其中具有半乳糖结合活性的蛋白质成分。采用SDS-PAGE分析纯化的蛋白样品,蛋白条带转印至PVDF膜后,Edman降解法测定肽链的N端序列。由测序结果设计引物,利用RT-PCR方法克隆一种蛋白A链的基因。结果从槲寄生中纯化出两种高毒性的蛋白质新成分CM-1、CM-2,其中CM-1 A链被克隆并测序,其与白果槲寄生蛋白A链的同源性较高。结论一种新槲寄生蛋白A链的基因被成功克隆。     

The Prediction of Bronchopulmonary Dysplasia in Very Low Birth Weight Infants through Clinical Indicators within 1 Hour of Delivery

BackgroundDespite the advances in neonatology, the incidence of bronchopulmonary dysplasia (BPD) is increasing. It is important to prevent the development of BPD in the first place. The online BPD outcome estimator from National Institute of Children Health and Human Development and Neonatal Research Network is available. However, it is not applicable for Asians. Moreover, limits are set for birth weight and gestational weeks excluding those who may still have BPD. The aim of this study was to develop a prediction model for BPD using first hour perinatal and neonatal factors in Korean very low birth weight infants (VLBWIs).MethodsData were collected for 8,022 VLBWIs with gestational age (GA) ≥ 22 weeks who were born between January 1, 2013 and December 31, 2016, and admitted to the neonatal intensive care units of the KNN. Multiple logistic regression models reanalyzed by stepwise selection with significant clinical indicators for BPD. PROC package was used to calculate the area under curve (AUC) and corresponding 95% confidence intervals. Moreover, it was used to search the best cut-off value. External validation was performed with the 2017 Korean neonatal network (KNN) data.ResultsAfter all missing data were excluded, 4,600 VLBWIs were included in the training dataset of the prediction model. Predictability of presence of BPD was 90.8% and prediction P value cut off was 0.550. Five-minute Apgar score, birth weight, GA, sex, surfactant use were significant indicators. Predictability of severe BPD was 81.5% and prediction P value cut off was 0.160. Five-minute Apgar score, birth weight, maternal PIH, chronic maternal hypertension, GA, sex, respiratory distress syndrome, need of resuscitation at birth were significant indicators. After external validation, sensitivity and specificity did not change significantly.ConclusionFrom this study, high predictability was obtained using clinical parameters obtained within one hour of life. P value for prediction of each grade of BPD and equation for calculation was presented. It can be helpful for the early prediction of BPD in Korean VLBWI. This study will contribute to the prediction of BPD in Asians especially Korean VLBWIs, not currently included in the NICHD BPD online BPD predictor. In addition, the predictive power may be continuously increased with the cumulative data of KNN.     

人胱抑素C基因的克隆和原核表达

目的：研究人胱抑素c（Cycstatin C,cysC）的原核重组表达及纯化。方法：通过RT-PCR扩增得到人CysC的cDNA序列,并将其构建到pET-32a（＋）的表达载体中。通过转化人BL21（DE3）表达宿主茵及表达条件的优化,摸索其最佳表达条件。通过镍柱纯化以及DEAE—sepharoseFF离子交换层析的方法纯化得到重组的人cysC蛋白。结果：通过RT-PCR扩增的方法得到的cDNA序列通过测序证明与预期一致。通过优化表达,CysC的表达水平达到了160mg／L,约占总可溶蛋白的20％,表达产物通过两步纯化后获得了纯度为95％的重组Cys C。结论：成功构建cy8C原核表达系统和蛋白纯化系统,为下一步制备多克隆抗体以及开发Cysc的免疫诊断试剂奠定了基础。