转染hIGF-1基因增强软骨细胞聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原的表达

目的探讨人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-1)基因对软骨细胞分泌聚集蛋白多糖(aggrecan)、Ⅱ型胶原的影响。方法构建并鉴定携带hIGF-1基因的重组腺病毒(Ad/CMV-hIGF-1),采用1、10、100及500感染复数单位(muldplicity of infection,MOD的Ad／CMV-hIGF-1转染软骨细胞,PBS为阴性对照,100μg／L hIGF-1生长因子为阳性对照,转染后4d进行aggrecan、Ⅱ型胶原免疫组化,参照文献分析免疫组化阳性单位。结果在1—100MOI范围内,随着Ad/CMV-hIGF-1滴度增加,aggrecan,Ⅱ型胶原表达递增,500MOI Ad／CMV-hIGF-1转染后,aggrecan表达骤减;Ⅱ型胶原表达下降不明显。结论hIGF-1基因对软骨细胞aggrecan,Ⅱ型胶原的表达有影响;100MOI Ad／CMV-hIGF-1优于100μg/L hIGF-1生长因子的作用。     

SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化

背景：移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应。 目的：探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果。 方法：提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组。转染后第14 天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的mRNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达。 结果与结论：共转染组SOX-9 mRNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P < 0.05);共转染组GDF-5 mRNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05)。共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05)。SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染。     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘对髓核细胞I型、II型胶原的影响

目的:观察腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(Ad/CMV-hTGF-β1)对兔椎间盘髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响。方法:纯种成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只。于实验组兔腰3、4椎间盘髓核内注射Ad/CMV-hTGF-β1(6×106pfu),注射量为20μl,对照组则注射20!μl磷酸盐缓冲液(PBS)。术后3周取出椎间盘,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核细胞中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况,并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果:免疫组织化学染色显示:实验组椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达比对照组低;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组高,差别有统计学意义(P<0.05)。结论:体内转染腺病毒介导的hTGF-β1基因能降低椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达、提高Ⅱ型胶原的表达,提示hTGF-β1可以抑制椎间盘的退变。     

腺病毒介导hTGF-β1基因体内转染兔椎间盘对髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响

目的观察腺病毒载体介导外源性人转化生长因子(Ad/CMV-hTGF-β1)对兔椎间盘髓核细胞Ⅰ型、Ⅱ型胶原的影响.方法纯种成年新西兰大白兔20只,随机分为实验组和对照组,每组10只.于实验组兔腰3、4椎间盘髓核内注射Ad/CMV-hTGF-β1(6×106pfu),注射量为20μl,对照组则注射20μl磷酸盐缓冲液(PBS).术后3周取出椎间盘,免疫组织化学方法观察椎间盘髓核细胞中Ⅰ型、Ⅱ型胶原的表达情况,并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析.结果免疫组织化学染色显示实验组椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达比对照组低;而Ⅱ型胶原的表达则比对照组高,差别有统计学意义(P＜0.05).结论体内转染腺病毒介导的hTGF-β1基因能降低椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原的表达、提高Ⅱ型胶原的表达,提示hTGF-β1可以抑制椎间盘的退变.     

兔脂肪干细胞向髓核样细胞分化的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞（ADSCs）向髓核细胞（NPCs）分化的潜能,证实脂肪干细胞可以作为种子细胞用于组织工程髓核研究.方法 提取兔ADSCs,进行培养传代至第3代,提取培养异体兔NPCs,将第3代ADSCs与NPCs共同培养作为共同培养组,将NPCs单纯培养作为单纯培养组.倒置显微镜进行细胞观察,通过RT-PCR技术测定Ⅱ型胶原mRNA和聚集蛋白多糖mRNA,测定其在共同培养3 d、7 d、14 d、21 d的表达量,两组进行对比分析.结果 共同培养组聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原蛋白mRNA表达量均明显高于单纯培养组.两组聚集蛋白多糖mRNA表达量比较,t=3.436,P〈0.05;两组Ⅱ型胶原蛋白表达量比较,t=2.733,P〈0.05,差异有统计学意义.结论 ADSCs具有向NPCs 分化潜能,在适当的培养条件下与NPCs共同培养可转化为髓核样细胞,同时能够促进NPCs生长.     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。 目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。 方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。 结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

P38 MAPK信号通路参与BMP-13诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化

 目的 探讨P38MAPK对BMP-13诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化的影响。方法 实验4个部分分组如下：1.BMP-13腺病毒（Ad-BMP-13）对P38MAPK的作用：Ad-BMP-13转染组、Ad-GFP转染组和C3H10空白组。Western blot检测磷酸化P38MAPK（p-P38MAPK）和总P38MAPK（t-P38MAPK）的表达变化,免疫荧光技术定位p-P38MAPK;2.P38MAPK干扰腺病毒（Ad-si-P38）对P38MAPK的作用：si-P38干扰组、si-NC干扰对照组和C3H10空白组。Western blot检测t-P38MAPK的表达;3.Ad-si-P38阻断P38MAPK后对BMP-13诱导分化的影响：si-P38+Ad-BMP-13转染组、si-NC+Ad-BMP-13转染组、si-NC+Ad-GFP转染组和C3H10空白组。Western blot检测cTnT和Cx43的表达,荧光定量PCR检测GATA-4和MEF-2C的mRNA表达;4.SB203580阻断P38MAPK后对BMP-13诱导分化的影响： DMSO+Ad-BMP-13转染组、SB203580(2、5和10μmol/L)+Ad-BMP-13转染组 。荧光定量PCR检测GATA-4和MEF-2C的mRNA表达。结果 BMP-13促进P38MAPK的磷酸化。Ad-si-P38可以有效降低P38MAPK表达水平。Ad-si-P38阻断P38MAPK后BMP-13诱导组cTnT、Cx43表达有明显降低（P<0.05）,GATA-4和MEF-2C的表达也有显著降低（P<0.05）。随P38MAPK特异性抑制剂SB203580浓度增加,BMP-13诱导组GATA-4和MEF-2C的表达降低（P<0.05）。结论 Ad-BMP-13可以通过激活P38MAPK信号通路来调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。     

低强度脉冲超声通过PI3K/Akt通路促进人退变髓核细胞合成细胞外基质

目的 探讨低强度脉冲超声(LIPUS)对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响及机制.方法 取人腰椎退变髓核组织,进行髓核细胞的分离、培养、鉴定,取P3代细胞转至藻酸钙凝珠培养.实验分组如下:LIPUS组:超声刺激1周,20 min/d;对照组:不予超声刺激同条件培养1周;LY294002组:超声刺激并加入LY294002共培养1周.应用ELISA法检测上清中髓核细胞分泌的aggrcan和Ⅱ型胶原(Col2α1);RT-PCR法检测细胞中aggrecan和Col2α1在mRNA水平的表达差异;Western blot法检测细胞中aggrecan、Col2α1、Akt及p-Akt的表达差异.结果 予以LIPUS刺激后,上清中的aggrecan和Col2α1浓度较对照组升高(P＜0.05),细胞内aggrecan和Col2α1在mRNA及蛋白水平的表达与对照组比较均有增高(P＜0.05),Akt的表达无明显变化(P＞0.05),p-Akt的表达增高(P＜0.05),加入特异性抑制剂LY294002后,aggrecan和Col2α1的合成明显降低(P＜0.05).结论 低强度脉冲超声能通过PI3 K/Akt信号通路促进藻酸钙凝珠立体培养的人退变髓核细胞合成细胞外基质.     

bFGF对人退变椎间盘髓核细胞影响的临床研究

目的:探讨bFGF对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响,观察退变髓核细胞基因表达量高于正常髓核细胞的生长刺激因子对退变髓核细胞的影响。方法:分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变椎间盘髓核细胞分为5组。A组:加入100μg/L bFGF;B组:加入200μg/L bFGF;C组:500μg/L bFGF;D组:1 000μg/LbFGF,E组:对照组,不加干扰因素。通过对试验组和对照组髓核细胞测定细胞II型胶原和糖胺多糖的mRNA表达;检测细胞外基质II型胶原和糖胺多糖表达水平。结果:bFGF刺激退变髓核细胞,II型胶原、糖胺多糖mRNA,细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在第7天较对照组增加明显(P<0.05)。14 d、21 d II型胶原、糖胺多糖mRNA明显低于对照组(P<0.05)。但细胞外液Ⅱ型胶原和糖胺多糖含量在14 d、21 d两个时间点仍高于正常组(P<0.05)。结论:根据本研究结果结合文献调研,bFGF在椎间盘髓核细胞中存在着双重效应(促进或改善椎间盘退变)。     

腺病毒载体介导EB病毒潜伏期膜蛋白2A基因转染树突状细胞对其功能的影响

目的 探讨腺病毒载体介导EB病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因转染树突状细胞（DC）对其功能的影响。方法 通过同源重组法构建带有EBV－LMP2A基因的重组腺病毒Ad5-LMP2A，用不同感染滴度（MOI）的Ad5-LMP2A转染成熟的DC，用流式细胞术（FACS）检测DC的LPM 2A蛋白表达细胞百分率及用台盼蓝染色计数DC死亡百分率，选择最佳MOI；用最佳MOI的Ad5-LMP2A转染成熟的DC，FACS检测转染前后DC表面分子CD1a、CD83、CD40、CD80及HLA－DR的变化；并用^3H-TdR掺入法检测转染前后DC刺激同种淋巴细胞增殖能力及荧光定量PCR检测表达IL－12 P40 mRNA等功能的改变。结果 MOI 200为Ad5-LMP2A转染DC的最佳滴度，此时约80％的DC表达LMP2S蛋白及92％以上细胞为活细胞。Ad5-LMP2A转染成熟DC前后对细胞表面共刺激分子及特征性表面标志无影响；转染后的DC仍具有较强的刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和表达IL－12 P40 mRNA的功能。结论 腺病毒载体能高效介导EBV LMP2A基因在DC中表达，Ad5-LMP2A转染成熟DC对其功能无明显影响，便于进一步用于EBV相关肿瘤的免疫治疗。     

转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1与髓核细胞诱导脂肪间充质干细胞向髓核样软骨细胞分化的比较

背景:以往研究脂肪间充质干细胞培养方式多为单层培养,诱导方式主要集中于细胞因子的方法,而椎间盘体内微环境,除细胞因子对细胞影响外,在其三维环境中细胞间的相互作用还值得进一步研究。目的:在体外分别通过髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1两种条件诱导,观察脂肪间充质干细胞向髓核细胞分化的差异。方法:分别单层培养兔的脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞,脂肪间充质干细胞培养至3代经鉴定后,按5×106个细胞制成微球,置于Transwell培养板中培养,分别通过髓核细胞微球及转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1诱导;于诱导前、诱导7,14d,观察细胞形态变化,并通过RT-PCR对Ⅱ型胶原、蛋白多糖水平进行测定。结果与结论:在体外诱导7,14d,两组脂肪间充质干细胞微团体积、形态无明显区别。RT-PCR检测结果显示7d两组与髓核诱导组均有Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达,但转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组表达更强;诱导14d髓核诱导组Ⅱ型胶原及蛋白多糖mRNA表达明显增高,优于转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1组。结果表明,在体外髓核细胞和转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1对脂肪间充质干细胞进行诱导均有促进其向髓核细胞分化作用,而转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1为正常髓核细胞分泌重要因子,说明髓核细胞对脂肪间充质干细胞的诱导之间除细胞因子作用外,尚存在相互促进增殖分化作用。     

原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞

背景：髓核细胞在体外培养过程中存在表型丢失问题,包括Ⅱ型胶原、aggrecan、Sox-9等表达的下降,由类软骨细胞向类纤维样细胞转化。 目的：体外原代培养差速贴壁法分离纯化大鼠腰椎间盘髓核细胞。 方法：经胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶先后消化Wistar大鼠椎间盘髓核组织,第1,2代细胞传代时采用差速贴壁法分离纯化髓核细胞。 结果与结论：分离纯化后的第3代髓核细胞呈圆形或多角形,活力强,苏木精-伊红染色细胞核染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性细胞比例为97%;aggrecan免疫组织化学染色阳性细胞比例为95%;扫描电镜可见细胞内有高尔基体、粗面内质网和游离核糖体,未见线粒体,可见少量板层小体;CCK-8生长曲线显示细胞经过2 d的生长潜伏期,3 d的指数生长期,进入生长停滞期。说明原代培养、两次差速贴壁法分离纯化的大鼠髓核细胞代谢旺盛、表型一致。     

Ad bFGF,Ad SOX9,Ad CTGF和Ad TIMP1基因在体内退变髓核细胞的影响

目的:探讨Ad bFGF、Ad SOX9、Ad CTGF和AdTIMP1基因对体内退变髓核细胞的影响或作用.方法:选择成年新西兰大白兔120只,使用纤维穿刺法进行动物模型手术,注入重组腺病毒转染bFGF、SOX-9、CTGF及TIMP-1,术后行X片、RT-PCR检测以及Ⅱ型胶原检测,结果进行统计学对比.结果:X片检测中椎间盘处理方式对椎间盘高度的改变经统计学分析有统计学意义(P＜0.05),对各节段之间的差异进行方差分析,结果显示对照组和生理盐水组之间的差异经统计学分析有统计学意义(P＜0.05),转染组和生理盐水组之间的差异经统计学分析有统计学意义(P＜0.05).在注射重组腺病毒转染bFGF、SOX-9、CTGF和TIMP-1载体后,bFGF、SOX-9、CTGF及TIMP-1和Ⅱ型胶原mRNA的表达水平均有明显提高(P＜0.05),对照组中bFGF和Ⅱ型胶原mRNA水平表现为不同程度的降低.在重组腺病毒转染bF-GF、SOX-9、CTGF以及TIMP-1中的Ⅱ型胶原的表达检测中,3组的均数方差齐性,差异经统计学分析有统计学意义(P＜0.05),再将3组数据行两两比较,转染组与对照组、对照组与生理盐水组,均数的差异经统计学分析有统计学意义(P＜0.05).结论:bFGF、SOX9、CTGF和TIMP-1基因可以在退变髓核细胞或组织中持续大量表达,这些基因可能均参与到椎间盘退变的发病机制中.     

NF-κB抑制剂减低LPS致兔腰椎间盘髓核细胞锌指蛋白A20表达升高

目的观察脂多糖(LPS)刺激退变兔椎间盘髓核细胞前后,锌指蛋白A20(A20)、NF-κB及相关炎性因子的表达及其相互关系。方法获取正常和退变兔腰椎间盘髓核细胞,分为正常组、退变组、LPS刺激组和NF-κB抑制剂组,HE染色观察椎间盘髓核及纤维环的形态,免疫组化检测椎间盘A20、NF-κB p65蛋白及Ⅱ型胶原(COL-Ⅱ)的表达。Real-time PCR分别检测各组A20、IL-1β、TNF-α、NF-κB和COL-ⅡmRNA的表达。Western blot观察A20、p65和COL-Ⅱ的表达。ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α的表达。结果退变组髓核细胞数量明显减少,髓核细胞聚集成团,COL-Ⅱ表达下降,A20和p65蛋白表达升高;与正常组相比,退变组A20、TNF-α、IL-1β和p65表达在mRNA及蛋白水平均明显升高,COL-Ⅱ表达降低(P0.05);LPS刺激组中A20、TNF-α、IL-1β和p65表达较退变组更显著,COL-Ⅱ降低明显(P0.05);NF-κB抑制剂组较LPS刺激组A20、TNF-α、IL-1β和p65表达回降,COL-Ⅱ表达回升(P0.05)。结论髓核细胞炎性反应与兔椎间盘退变的发生和发展密切相关,其中A20可能发挥了重要作用。     

白藜芦醇通过上调SIRT1促进退变髓核细胞胞外基质合成

目的:研究白藜芦醇(RES)对人退变椎间盘髓核细胞(DNPCs)合成细胞外基质(ECM)的影响.方法:对人退变椎间盘髓核组织进行分离、单层培养细胞鉴定、藻酸盐培养.取原代藻酸盐培养细胞分别用0、12.5、25、50、100、200μmol/L的RES分别刺激DNPCs 12、24、48 h,Western blot法检测沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)、Ⅱ型胶原(Colla2α1)、蛋白聚糖聚合物(aggrecan)蛋白表达,real-time 荧光定量PCR检测SIRTl mRNA表达水平.用SIRT1-siRNA 转染后再与100 μmol/L RES共培养24h,观察Colla2α1、aggrecan的蛋白表达.结果:RES上调SIRTl mRNA和蛋白水平的表达,促进DNPCs合成ECM的表达,与对照组相比具有统计意义(P＜0.05).siRNA靶向沉默SIRT1表达后,再加入RES刺激,观察到Colla2α1与aggrecan的蛋白表达与对照组相比显著下降(P＜0.05).结论:RES可刺激DNPCs ECM的合成,且呈现一定的量效关系,这种调节作用与SIRT1的活性有关.     

体外培养人退变髓核细胞的生物学性状

背景：椎间盘退行性变后很难自行修复,研究退变髓核细胞的生物学特性可为研究椎间盘退变机制、组织工程椎间盘构建、基因治疗等提供理论基础。 目的：观察体外培养的人退变髓核细胞的生物学特性。 方法：分离培养人退变椎间盘髓核细胞,采用光镜、电镜观察细胞的形态和超微结构,荧光定量PCR技术检测髓核细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖mRNA的表达。ELISA法检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原水平,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖水平。 结果与结论：体外培养的传2代内的退变椎间盘髓核细胞结构与原代细胞相似,传3代后的细胞出现退变及凋亡改变。对体外培养第1代的退变髓核细胞和正常髓核细胞的Ⅱ型胶原和糖胺多糖进行检测发现,退变髓核细胞Ⅱ型胶原、糖胺多糖mRNA水平及细胞外基质中Ⅱ型胶原和糖胺多糖的表达均明显低于正常髓核细胞,呈现去分化趋势。     

不同代次兔髓核细胞的形态学特征和生物学性状

背景：椎间盘退变是个慢性、复杂的过程,然而椎间盘退变其发生机制尚未完全阐明,很难自行修复。近年来研究细胞移植治疗椎间盘退行性变尚处在实验室阶段。研究髓核细胞的生物学性状可为研究椎间盘退变机制、组织工程构建椎间盘、基因治疗等提供理论依据。 目的：研究兔不同代次髓核细胞的生物学特性,旨在找出合适的种子细胞去治疗椎间盘退变性疾病。 方法：从新西兰大耳白兔椎间盘髓核组织中,分离并培养髓核细胞同时进行培养传代,对原代及第3,4代髓核细胞进行苏木精-伊红染色观察细胞形态学变化;甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学法检测髓核细胞内聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达;反转录PCR法测定Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平,观察各代髓核细胞生物学特性的变化。 结果与结论：兔椎间盘髓核细胞可以在体外培养并进行传代,原代髓核细胞一般需7 d左右贴壁,形状呈类圆形或多角形,原代和第3代髓核细胞都呈圆形或多角形,活力较强,苏木精-伊红染色后细胞核被染成均一蓝黑色,胞浆呈现淡粉色;髓核细胞经过甲苯胺蓝染色后,胞浆内呈现天蓝色,通过Ⅱ型胶原免疫组织化学染色后,胞浆内表现为黄褐色沉淀。到第4代细胞出现退变,Ⅱ型胶原和聚合蛋白聚糖mRNA的表达水平较前几代细胞显著下降。前3代的髓核细胞代谢旺盛,表型一致,聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达正常,传第4代后髓核细胞开始出现衰老、退变。     

骨形态发生蛋白2对退变椎间盘组织学和Ⅰ，Ⅱ型胶原的影响

背景：研究表明,退变椎间盘细胞外基质的主要变化是Ⅱ型胶原和蛋白多糖含量的减少和Ⅰ型胶原含量的增加。 目的：观察腺相关病毒介导的骨形态发生蛋白2基因(AAV-BMP-2)对兔退变腰椎间盘内髓核Ⅰ,Ⅱ型胶原的影响。 方法：将12只新西兰大白兔L2-3,L3-4,L4-5,L5-6椎间盘针刺制造退变模型后随机分为3组,每组4只。其中AAV-BMP-2组兔椎间盘注射AAV-BMP-2,AAV组兔椎间盘注射不携带目的基因的空载体,生理盐水组兔椎间盘注射生理盐水,注射后第8周处死动物取其相应的椎间盘常规石蜡包埋,组织切片,以苏木精-伊红染色观察其髓核组织学变化,免疫组织化学法检测髓核组织Ⅰ型、Ⅱ型胶原表达并进行半定量分析。 结果与结论：普通苏木精-伊红染色结果显示AAV-BMP-2组椎间盘内髓核细胞数目较多,呈单个或者簇状分布,髓核结构清晰,无纤维样组织填充。而AAV组和生理盐水组的组织结构相似,髓核内细胞数目少,髓核皱缩干瘪,细胞间为纤维样组织填充且排列紊乱。免疫组织化学染色显示：AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅱ型胶原的表达均高于AAV组和生理盐水组(P < 0.05);AAV-BMP-2组椎间盘髓核内Ⅰ型胶原的表达均低于AAV组和生理盐水组(P < 0.05)。结果说明,体内转染AAV-BMP-2能抑制椎间盘髓核细胞表达Ⅰ型胶原,促进椎间盘髓核细胞表达合成Ⅱ型胶原,提示维持椎间盘内胶原的含量、种类,可维持椎间盘内组织学的结构和形态,稳定髓核细胞生长环境,延缓椎间盘的退变。     

全骨髓贴壁法获取组织工程髓核种子细胞的相关研究*

目的明确兔骨髓间充质干细胞的分化能力及分化条件,以TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞。方法利用全骨髓贴壁法分离获取兔骨髓间充质干细胞,并对细胞进行培养和传代,以特定的环境及细胞诱导液进行诱导,促使其向特定的中胚层细胞分化。再将细胞分为四组,A:空白对照组,B:BMP-7诱导组,C:TGF-β3诱导组,D:TGF-β3与BMP-7共同诱导组,诱导21天后对蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9基因进行realtime-PCR检测。结果全骨髓贴壁法分离获得的原代兔骨髓间充质干细胞生长良好,2周后显微镜下观察细胞间形态较为一致,成纺锤形。细胞传代后生长良好。细胞表面表达CD29、CD105、CD166表面标记物。在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,培养21天后,通过特定染色发现兔骨髓间充质干细胞向预定方向分化生长。以TGF-β3和BMP-7生长因子诱导21天后,蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX9基因表达C组和D组明显高于A组和B组(P0.05),X型胶原表达A组和B组明显高于C组和D组(P0.05),Ⅰ型胶原表达四组之间无明显差异。结论全骨髓贴壁法可以成功分离获得状态良好的兔骨髓间充质干细胞,在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,兔骨髓间充质干细胞可向预定的方向分化且生长良好。TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞后可明显提高其类髓核细胞具有的下游基因表达水平。     

骨形态发生蛋白2基因转染人羊水干细胞复合β-磷酸三钙支架促进骨再生

目的研究重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白2（BMP-2）基因转染人羊水干细胞（hAFSC）的体外成骨分化,评价基因修饰的hAFSC负载于β-磷酸三钙（β-TCP）多孔支架后体内成骨能力。方法收集人工破膜后的中段羊水原代培养hAFSC,免疫磁珠分选CDl17／c-kit阳性的hAFSC,分别转染腺病毒介导的BMP-2或增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因,转染组转染BMP-2和EGFP基因、对照组转染无BMP-2编码序列的EGFP基因,空白组不做病毒转染。48h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达及生长状况,应用流式细胞仪检测转染率。转染第7、14、21、28天采用ELISA检测各组hAFSC培养液中的BMP．2分泌量以确认转染后目的蛋白表达效果。各组hAFSC成骨诱导14d后进行碱性磷酸酶（ALP）染色,28d后进行茜素红染色评价成骨能力;成骨诱导3、7、14d后定量检测各组细胞ALP活性。20只8周龄裸小鼠随机分为Adv-hBMP-2-hAFSC-β-TCP组、Adv-EGFP-hAFSC-β-TCP组、hAFSC-β-TCP组和β-TCP组,每组5只,将细胞载体复合物植入各组裸小鼠股骨,8周后观察异位成骨组织学情况。结果hAFSC生长良好,Adv-hBMP-2或Adv-EGFP基因转染48h后荧光显微镜下见细胞贴壁良好,发出强绿色荧光,无死细胞产生,转染阳性率达（89．00±4．25）％。转染Adv-hBMP-2组hAFSC培养液上清中BMP-2第7、14、21、28天分别为（3．405±0．229）μg／L、（4．575±0．179）μg／L、（3．910±0．175）μg／L、（2．694±0．205）μg/L,第14天蛋白BMP-2分泌已达到高峰且第28天仍有蛋白表达,各时间点均明显高于对照组与空白组（均P〈0．05）。hAFSC成骨诱导14d后细胞相连成片,与对照组及空白组比较,ALP染色转染组染色阳性面积更大、阳性细胞数量更多。成骨诱导28d后茜素红染色见转染组细胞多中心聚集,伴大量红色钙结节形成,结节数量与大小明显优于对照组与空白组。成骨诱?