成年兔心耳组织体外培养扩增心肌细胞的生物学特性研究

目的探讨成年兔心耳组织体外培养扩增心肌细胞的生物学特性.方法选新西兰成年兔11只,分别取少量心耳组织,酶解法制成细胞悬液,体外培养.于培养0、12、26、40 d进行细胞计数;培养12、26 d测定细胞染色体含量;培养0、40 d,取部分细胞行免疫组化染色检查,计算心肌细胞百分比;培养26 d,电镜检查细胞的超微结构;培养12 d,取部分细胞置-80℃冷冻保存,8周后快速解冻,体外继续培养观察.结果细胞计数分别为(0.54±0.06)×107、(7.38±0.73)×107、(58.00±16.14)×107、(24.91±11.86)×107;DNA 含量测定S期细胞分别为22.2%、56.5%;免疫组化判定心肌细胞的比例分别为82%±11%、87%±18%;电镜下可见心肌细胞肌原纤维的横纹;冷冻的心肌细胞快速解冻后,体外培养可继续生长扩增.结论成年兔心耳组织来源的心肌细胞,在有限的体外传代培养过程中,数目可扩增,其亚显微结构和成分基本稳定.     

新生大鼠原代心肌细胞的培养与鉴定

目的:探索简单易行、成功率高的心肌细胞培养方法。方法:取新生大鼠心脏心尖部剪成1 mm×1 mm×1 mm大小进行体外组织块贴壁培养。结果:成功培养出原代心肌细胞,并能够传代。心肌细胞台盼蓝染色显示存活率>87%,免疫组化染色鉴定纯度>90%。结论:通过上述方法可获得较高存活率及纯度的心肌细胞,该培养方法简单易行,重复性好,符合实验需求。     

乳小鼠心肌细胞体外培养方法的优化

目的探讨乳小鼠心肌细胞分离和体外培养的方法,并结合实际情况建立一种优化的体外培养乳小鼠心肌细胞的方法。方法胰酶-Ⅱ型胶原酶混合液分次消化乳小鼠心肌组织后行差速贴壁法达到心肌细胞纯化目的,并利用心肌细胞特意表达a-肌动蛋白的特性运用细胞免疫组织化学方法鉴定心肌细胞。结果差速贴壁48h后心肌细胞贴壁完全,并见大部分贴壁细胞出现搏动,但未观察到同簇搏动,经a-肌动蛋白细胞免疫组织化学鉴定,心肌细胞纯度达96.7%。结论本研究优化了原代乳小鼠心肌细胞分离和体外培养方法,为后续细胞实验打下了基础。     

黄芪对体外培养心肌细胞保护作用的实验研究

目的：观察黄芪对体外培养的缺糖缺氧损伤心肌细胞的保护作用。方法：心肌细胞原代单层培养，观察心肌细胞形态学变化、细胞生化数据的改变以及超微结构形态学的变化。结果：药物组与药物对照组的心肌细胞内上述细胞损伤变化均得到明显恢复。结论：黄芪对体外培养的缺糖缺氧心肌细胞具有明显的保护作用。     

腺病毒介导的HSP70基因转染对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究热休克蛋白70(HSP70)基因转染对体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)感染体外心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。利用体外心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,研究HSP70基因转染对心肌细胞的保护作用。结果:原代培养获得高纯度的乳鼠心肌细胞,随着MOI值升高,Ad.EGFP的感染效率和基因表达增强,在MOI值为50时,Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。免疫组化染色法结果显示,表达的HSP70主要分布于心肌细胞的胞质和胞核中;利用体外的缺氧/复氧损伤模拟在体的缺血/再灌注损伤,结果显示Ad.HSP70感染组的细胞活力、MT...     

月见草油对培养心肌细胞肥大的抑制作用

目的 探讨宁夏产月见草油对体外培养大鼠心肌细胞肥大的抑制作用.方法 将培养的SD大鼠乳鼠的心肌细胞随机分为三组：空白对照组、胰岛素样生长因子-I（IGF-I）组和IGF-I ＋月见草油组.选择最佳剂量进行实验,观察各组心肌细胞存活率、形态,细胞DNA、RNA含量及细胞面积变化,并观察超微结构的改变.结果 实验各组细胞死亡百分率均＜5%;月见草油可使由IGF-I致肥大心肌细胞的DNA、RNA含量减低,细胞面积缩小（均P＜0.05）;超微结构显示月见草油可使由IGF-I致肥大心肌细胞肌丝的增粗减弱.结论 月见草油对IGF-I致体外培养的心肌细胞肥大有抑制作用.     

新生小鼠心脏细胞体外共培养体系的建立及其在心肌细胞增殖研究中的应用

目的 建立新生C57乳鼠心肌细胞和成纤维细胞体外原代培养和共培养体系,探讨不同日龄乳鼠心脏细胞的体外增殖特征.方法 分离不同日龄C57新生小鼠的心肌细胞和成纤维细胞,分别进行原代培养和共培养,观察细胞的形态和活力变化,测定CyclinD1、CDK4、GATA4、Nkx2.5以及FGF1的表达.结果 差速贴壁90 min后成纤维细胞先贴壁,培养12h后心肌细胞几乎全部贴壁;共培养心肌细胞多以细胞团的形式贴壁生长.出生5d以内的乳鼠心肌细胞数量明显增加,共培养的心肌细胞活力更大、增殖速度快;出生5d以后乳鼠的心肌细胞数量变化并不明显.出生5d内乳鼠心肌细胞中CyclinD1和CDK4的表达量较高,且共培养的心肌细胞表达量要高于单独培养的心肌细胞表达量.GATA4、Nkx2.5和FGF1的表达随日龄增大而增加.结论 成功建立了新生小鼠心肌细胞和成纤维细胞的体外共培养体系;出生5d内的乳鼠心肌细胞体外培养时具有较强的增殖能力,且成纤维细胞能促进心肌细胞的增殖,GATA4、Nkx2.5和FGF1有阻止心肌细胞增殖作用.出生5d后乳鼠的心肌细胞增殖能力减弱甚至消失.     

尾加压素Ⅱ诱导体外培养的乳鼠心肌细胞肥大的研究

目的 研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)能否诱导体外培养的乳鼠心肌细胞肥大。方法 心肌细胞体外培养40h后，换无血清DMEM继续培养24h，应用流式细胞仪和3H-亮氨酸(^3H-Leu)掺入法观察不同浓度UⅡ作用24h后对心肌细胞大小和蛋白掺入率的影响。结果 10^-7mol／L的UⅡ心肌细胞的大小(P=0．021)和^3H-Leu掺入率(P=-0．015)。结论 UⅡ能诱导体外培养的乳鼠心肌细胞肥大。     

体外培养心肌细胞的形态学及其电位的初步观察

自 Cavanough(1955)首次用胰蛋白酶(trypsin)消化鸡胚心脏组织碎片,分离出单个心肌细胞以来~1,近三十年内体外培养心肌细胞的方法及其在医学中的应用研究发展很快,对体外培养心肌细胞的生物学、形态学、分子药理学、电生理学和分子心脏病学等达到了细胞和分子水平~(2-4)。最近 Mohamed(1983)用无小牛血清的培养基培养了新生大白鼠心肌细胞~5,为研究激素对培养心肌细     

乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养

目的:探讨一种简便、可靠的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞培养方法。方法:以组织块酶消化法分离细胞,通过差速贴壁分离法收集、培养乳鼠心肌细胞和成纤维细胞。普通光学显微镜观察心肌细胞和成纤维细胞的基本特征及生长特性的变化。结果:心肌细胞12 h基本贴壁、1~3天形成细胞簇并出现同步搏动,心肌细胞纯度为93%;心肌成纤维细胞第3~6代细胞生长良好,纯度达98%以上。结论:建立的乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞体外培养方法是成熟、可靠的。     

风心病心肌细胞培养模型的建立及其胶原合成

目的　建立风心病心肌细胞体外培养方法 ,观察其胶原合成变化 .方法　采用快速贴壁法对正常成人 7例和风心患者 15例左室乳头肌心肌细胞进行原代培养 ,观察培养期间其形态、超微结构、活性及胶原合成的变化 .结果　培养的成人心肌细胞短而粗呈杆状 ,无明显自主收缩 ;48h后杆状细胞率为 ( 87.2± 4.1) % ,细胞存活率为 ( 92 .8± 4.1) % ,两者随培养时间延长而降低 ;透射电镜显示杆状细胞超微结构正常 ;免疫组化染色显示风心病心肌细胞 , 型胶原呈阳性表达 ,正常组呈阴性或弱阳性表达 ;胶原合成测定结果显示风心组[2 ,3- 3H]-脯胺酸摄取量显著高于正常组 .结论　我们建立的成熟心肌细胞分离和培养方法可靠 ,培养心肌细胞保持了在体的杆状形态 ,风心病心肌细胞培养 48h后胶原合成表型仍存在 ,该方法的建立为研究心肌细胞参与风心病心肌纤维化的调控机制提供了一个有效的实验手段     

罗格列酮对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的影响

目的 探讨罗格列酮对体外高糖培养乳鼠心肌细胞凋亡的影响.方法 SD乳鼠进行原代心肌细胞培养48h后,换无血清的DMEM培养基并转移到24孔板上,随机分为3组,分为培养心肌细胞不加入葡萄糖组,加入25mmol/L葡萄糖组,加入25mmol/L葡萄糖以及10μmol/L罗格列酮组.48h后,分别测定各组心肌细胞乳酸脱氢酶含量;四唑盐比色法测定各组心肌细胞的生长情况及增殖活性;流式细胞仪检测各组心肌细胞的凋亡情况.结果 与正常对照组相比较,经过罗格列酮干预后,乳酸脱氢酶含量显著下降;四唑盐比色结果显示心肌细胞存活率增高;流式细胞仪检测发现坏死细胞和凋亡细胞明显减少.结论 罗格列酮能够抑制体外高糖培养的乳鼠心肌的细胞凋亡.     

在心肌细胞/MSCs共培养体系中MSCs出现心肌分化表型

目的:观察MSCs在心肌细胞/MSCs共培养体系中向心肌细胞的分化情况.方法:体外分离培养大鼠心肌细胞,然后将传代后大鼠MSCs与心肌细胞混合培养,建立心肌细胞/MSCs共培养体系,同时以心肌细胞培养上清液及成纤维细胞培养上清液为诱导因素作对照.培养1周后行免疫细胞化学染色,鉴定MSCs中心肌特异性cTnT蛋白的表达.结果:在心肌细胞/MSCs共培养体系中,MSCs与心肌细胞交织成网状,部分MSCs出现cTnT的表达,而对照组MSCs未检出cTnT的表达.结论:体外模拟的心肌环境可以诱导MSCs向心肌细胞分化并表达心肌细胞特异性标志物,诱导MSCs向心肌分化的分子信号可能是心肌细胞膜蛋白.     

乳鼠原代心肌细胞提取方法的改良

目的 改进传统的SD大鼠乳鼠心肌细胞培养方法,探索更简便、高效的心肌细胞培养方法.方法 用两种不同方法提取心肌细胞,比较两种不同提取方法对细胞存活率、搏动能力的影响.结果 与传统法相比用改良法提取的心肌细胞存活率较高,起搏较早,差异有统计学意义(P﹤0.01).结论 用改良法提取心肌细胞,可获得存活率高、纯度高心肌细胞.且操作简便,重复性好,是一种较为理想的提取原代心肌细胞的方法,可建立满意的体外培养心肌细胞模型.     

人参皂甙对培养成年大鼠心肌细胞收缩功能影响的研究

目的 观察人参皂甙(Ginsenosides,Gs)对体外培养的成年大鼠心肌细胞收缩功能的影响.方法 采用体外培养的成年大鼠心肌细胞,观察不同浓度的Gs(12.5、25、50、100、200 mg/L)对心肌细胞收缩功能的影响.结果 与正常对照组比较,加入不同浓度的Gs干预的各组,随着Gs浓度升高,心肌细胞收缩功能明显降低(P＜0.01).结论 25 mg/L以上浓度Gs能降低正常成年大鼠心肌细胞的收缩幅度.     

晚期糖基化终产物对心肌细胞细胞周期和凋亡的影响

目的探讨晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养乳鼠心肌细胞细胞周期及凋亡的影响。方法体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞,用含1%或10%胎牛血清的DMEM培养基中继续培养24 h,应用流式细胞仪和原位末端标记技术观察不同浓度AGEs(50、100 μg/ml)对心肌细胞刺激12、24、48 h后细胞周期分布、凋亡率及凋亡小体/凋亡细胞核分布的影响。结果AGEs对心肌细胞细胞周期分布无明显影响;在正常培养液培养时,心肌细胞的凋亡随着培养时间延长而增加,24、48 h与12 h相比,凋亡小体/凋亡细胞核分别增加了0.55、1.23倍;AGEs可以明显增加心肌细胞的凋亡程度,并随着刺激时间、刺激浓度的增加而增加,50、100 μg/ml AGEs组与对照组相比,凋亡小体/凋亡细胞核12、24、48 h分别增加了0.74和1.21、1.15和1.78、0.83和1.19 倍。结论AGEs对心肌细胞细胞周期分布无影响,但可以通过增加心肌细胞凋亡率对心肌细胞造成损伤。     

体外自发性搏动乳鼠原代心肌细胞的分离培养及超微结构

目的：通过对sD乳鼠体外自发性搏动的心肌细胞（CMs）分离培养,并观察其超微结构,以了解心肌干细胞的特性。方法：用体外分离、纯化培养sD乳鼠自发性搏动的心肌细胞,应用倒置显微镜及透射电镜观察其形态结构与超微结构,并进行心肌特异性标志troponinI（cTnI）的免疫细胞化学鉴定。结果：体外分离、纯化培养出心肌细胞,细胞具有自发性搏动特性,表达心肌特异性抗体TropninI。电镜下可见细胞内出现肌丝样结构及z线结构,细胞普遍存在肌小节,细胞间有闰盘连接;部分细胞表面有大量微绒毛,细胞器丰富,可见内质网、线粒体。结论：体外可分离培养扩增出自律性搏动的CMs,这些细胞表现增殖活跃,具有千细胞的增殖旺盛特性。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的:探讨更为简便的新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的数量、存活率和纯度.方法:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化,分离新生大鼠心肌细胞,进行体外培养,观察心肌细胞形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定.结果:心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上.结论:改良的细胞培养技术可获得生长状态良好的心肌细胞.     

HTK液和UW液对大鼠原代心肌细胞冷保存的保护作用

目的 研究HTK液和UW液对体外培养的大鼠原代心肌细胞冷保存中的保护作用。方法 体外培养大鼠原代心肌细胞，分别用生理盐水，UW液和HTK(液在0℃-4℃保存心肌细胞6h、8h、10h、12h。检测保存液的AST和LDH-L，台盼蓝染色法计算心肌细胞的生存率。结果 UW液组和HTK液组的AST和LDH-L均比生理盐水组极显著低下，心肌细胞的生存率则极显著的高于生理盐水组。而在12h时，HTK液组的AST和LDH-L显著低于UW液组，心肌细胞的生存率在8h和10h也明显高于UW液组。结论 HTK液和UW液均对体外培养的大鼠原代心肌细胞的冷保存有明显的保护作用。而HTK液相对于UW液更能延长对心肌细胞的冷保存时间。