缝隙连接蛋白26基因相关性聋和大前庭水管综合征家庭的产前诊断和生育指导

目的利用基因诊断方法为有再生育要求的耳聋家庭明确分子致病机制，并行产前诊断鉴别胎儿的基因型，为耳聋家庭提供准确的遗传指导与干预。方法共有8个耳聋家庭参加研究。8个家庭均有一个子女为重度-极重度感音神经性聋患儿，其中7个家庭（家庭1—7）父母均听力正常；1个家庭（家庭8）妻子为听力正常个体，丈夫为中度感音神经性聋个体。母亲均怀孕（6—28周）。所有受检患者均采集外周血并提取DNA，进行缝隙连接蛋白26基因（gap junction beta-2，GJB2）、SLC26A4（或称PDS）基因分析和线粒体DNA（mtDNA）1555位点突变检测。明确受检者基因型后，根据母亲的妊娠时间，行适当的产前诊断取材并提取DNA，测定胎儿的基因型。结果家庭1—4先证者均为GJB2纯合或复合突变，父母均为携带者；家庭5—8先证者及家庭8父亲均为SLC26A4复合突变，其余父母均为携带者。产前诊断显示：家庭1、5、8胎儿仅携带一个父系突变，家庭2、3、6胎儿未携带GJB2或SLC26A4突变，这6个家庭胎儿出生后随访听力均正常；家庭4、7胎儿与先证者基因型相同，父母选择终止妊娠。结论耳聋基因诊断结合产前诊断可以有效预防耳聋家庭再次生育聋儿。     

自身免疫性感音神经性聋患者候选基因——凝血因子C同源物突变筛查

目的通过对22例自身免疫性感音神经性聋（autoimmune sensorineural hearing loss,ASNHL）患者进行凝血因子C同源物基因（coagulation factor C homology,COCH）全序列分析,探索自身免疫性感音神经性聋与COCH突变的相关性。方法应用聚合酶链反应（PCR）产物直接测序方法对22例自身免疫性感音神经性聋患者进行COCH全序列分析。结果在22例自身免疫性感音神经性聋病例中未发现COCH突变和多态。结论初步探索了ASNHL与COCH突变的相关性,未发现COCH突变和多态,还需进一步收集临床病例来证实。     

一个中国DFNA9家系的听力学及前庭功能特点

目的 分析携带COCH基因新突变的一个中国DFNA9家系成员的听力学及前庭功能特点.方法 对家系成员进行详尽的听力学及前庭功能检查,包括纯音测听、听性脑干反应、耳蜗电图;视眼动、冷热试验、旋转试验、前庭诱发性肌源性电位,评价有无听力及前庭损害.结果 该家系患者听力学检查表现为以高频下降为主的进行性感音神经性聋;前庭功能检查正常.结论 中国DFNA9家系的所有vWFA2结构域突变携带者一生中均无前庭障碍的症状,详尽的前庭功能检查正常.中国DFNA9家系的临床资料分析表明DFNA9存在基因型和表现型的相关性.     

一个遗传性聋伴前庭功能障碍家系的表型研究与相关基因探讨

目的分析一个遗传性聋伴前庭功能障碍家系的表型特征,并探讨该家系的相关致病基因。方法对门诊发现的1例渐进性聋伴眩晕患者进行家系调查、病史资料采集、常规检查、听力学及前庭功能检查。听力学检查包括纯音测听、声导抗,前庭功能检查为冷热水试验。采集家系成员外周血DNA,采用聚合酶链反应(poly-merase chain reaction,PCR)扩增-直接测序法对POU3F4基因和COCH基因进行全部编码序列突变检测。结果该家系共4代28人,现存3代26人,主诉听力障碍者4人,耳聋患者均为正常女性后代中的男性,表现出隔代交叉遗传特征。耳聋患者出生时听力正常,6~10岁出现听力减退,并同时出现眩晕,走路不稳感。其中2人听力快速恶化,言语能力差,纯音测听为双耳对称的重度-极重度感音神经性听力损失,另外2人表现为高频下降型听力曲线。4名耳聋患者前庭功能低下或丧失。家系成员基因测序结果显示在POU3F4基因和COCH基因中均未检测到突变。结论本研究家系为非综合征型聋并前庭功能异常的家系,符合X-连锁隐性遗传特征规律,遗传方式最终确定有赖于进一步的分子遗传学研究。该家系患者高度一致的表型特征提示为单一基因致病,但筛查目前与这一表型相关的POU3F4基因和COCH基因未发现突变,可能存在其他与这一表型相关的基因。     

GJB2基因p.V37I突变的临床听力学特点

GJB2基因是导致常染色体隐性遗传非综合征型聋最常见的致病基因。该基因p.V37I突变在我国听力损失人群中的检出率较正常人群高。该突变主要与轻至中度、迟发性和渐进性听力损失有关,且外显率较低,在中国汉族人群中约为17%。本文主要围绕GJB2基因p.V37I突变的临床听力学特点进行文献综述,旨在为临床耳聋基因诊断和遗传咨询提供依据。     

人凝血因子C同源物基因全长cDNA克隆

目的 通过克隆凝血因子C同源物基因(Coagulation factor C homology,COCH)全长cDNA,为COCH编码蛋白cochlin的功能研究打下基础.方法 从听力正常人新鲜外周静脉血中提取总RNA,应用一步法RT-PCR试剂盒进行COCH反转录,转录产物进行浓缩、酶切、连接.结果 反转录COCH cDNA全长与标准基因序列比较,结果完全相符,得到完整的COCH cDNA全长序列.结论 本研究成功克隆了COCH cDNA全长序列,为COCH编码蛋白cochlin的功能研究打下了良好的基础.     

WFS1基因在听神经病家系中的突变筛查

目的在一个中国听神经病家系中进行WFS1基因的突变检测,分析WFS1基因突变与该家系表型的关系。方法针对WFS1基因的全部编码序列设计14对引物,进行WFS1基因的PCR扩增,对PCR产物进行双向直接测序,检测WFS1基因突变。结果在WFS1基因的8个外显子中,检测到位于第8个外显子上的6种序列改变方式,其中突变2766A/G杂合为听神经病家系特有,并且可以引起氨基酸的改变(866D/N);其他突变未引起氨基酸的改变。结论在发现的6个序列改变方式中,2766A/G可以引起氨基酸的改变(866D/N),为听神经病家系特有,可能和听神经病有关。     

大前庭水管综合征患者的听力学及前庭诱发肌源性电位检测的特点

目的:探讨大前庭水管综合征(LVAS)患者的听力学、前庭诱发肌源性电位(VEMP)检测的特点及诊断意义。方法:对30例(60耳)LVAS患者行纯音测听、声导抗、ABR、畸变产物耳声发射(DPOAE)、VEMP及冷热实验检测,分析其诊断意义。结果:30例(60耳)LVAS患者均呈进行性、波动性听力下降,16例在听力波动性下降时伴眩晕。纯音测听主要呈感音神经性聋,但47耳(94.0%)在中耳功能正常的情况下于低频250、500Hz分别出现(43±17)dBHL及(33±18)dBHL骨气导差,呈混合性聋。ABR检测18耳(64.3%)于(3.06±0.52)ms引出声诱发短潜伏期负反应。42耳VEMP振幅均值为(147.10±107.55)μV,19耳反应阈为75dBnHL,7耳反应阈为65dBnHL。结论:根据进行性波动性听力减退、感音神经性聋在中耳功能正常的情况下出现低频骨气导差,ABR测试引出声诱发短潜伏期负反应及VEMP呈现高振幅低阈值的特征性提示,有助于临床医生得出LVAS的初步印象,可进一步行影像学检查以确诊。     

Wolfram 综合征I型基因异质性突变引起低频非综合征型聋

目的分析常染色体显性遗传的低频非综合征感音神经性聋与Wolfram 综合征Ⅰ型(wolfram syndrome 1, WFS1)基因WFS1的关系以及WFS1基因突变特性,从分子遗传学水平探讨其致病机理.方法收集 6个低频非综合征感音神经性聋家系中28例成员以及140例健康对照个体的外周血DNA样本;采用聚合酶链反应,直接序列分析和限制性片断长度多态性分析方法,进行WFS1基因编码区的筛查.结果发现2个家系6例耳聋成员测序结果异常.1个家系发现所有耳聋患者WFS1基因的编码区2379位碱基G杂合性改变成A,导致错义突变;另1家系先证者WFS1基因的编码区2016位碱基G杂合性改变成T,先证者之妹2776位碱基G杂合性改变成A,导致错义突变;先证者之母为一Wolfram综合征伴有心理障碍患者,发现其为2016位2776位碱基复合型错义突变.这2个家系听力正常者及健康对照者中无此突变.结论 WFS1基因异质性突变引起低频非综合征感音神经性聋,主要突变为错义突变,遗传咨询和基因检测对该类型耳聋诊治具有指导意义.     

河南两地区聋儿教育机构患者大前庭水管相关SLC26A4基因热点突变筛查分析

目的　分析河南郑州和南阳地区聋儿教育机构儿童感音神经性聋患者中SLC26A4基因热点突变IVS7-2A＞G和2168A＞G发生频率,初步探讨大前庭水管相关的SLC26A4基因热点突变在河南地区聋病残疾人群中的分子诊断意义,为地区聋病防治工作的有效开展奠定理论基础。方法　收集南阳聋校、郑州聋儿康复中心的感音神经性聋患者76例,进行聋病病因问卷调查、听力学测试,抽取患者血样提取基因组DNA,运用直接测序法对SLC26A4基因的热点突变IVS7-2A＞G和2168A＞G进行检测,对突变阳性者行颞骨CT检查,并对其发生频率进行分析。结果　热点突变基因检测显示,在76例聋病患者中,携带SLC26A4基因IVS7-2A＞G和2168A＞G突变的例数共计21例,总阳性检出率为27.63%（21/76）。IVS7-2A>G纯合突变5例,IVS7-2A>G杂合突变12例,2168A>G杂合突变2例,2168A>G/IVS7-2A>G复合杂合突变2例。研究对象中SLC 26A4基因2168A＞G/IVS7-2A＞G双等位基因的突变率为9.21%（7/76）,IVS7-2A＞G突变率为25.00%（19/76）,2168A>G突变率为5.26%（4/76）,对所有检测到突变的患者行颞骨CT检查,17例存在前庭导水管扩大,前庭导水管扩大率为80.95%（17/21）。结论　河南地区聋儿教育机构的不明原因感音神经性聋患者中存在较高的IVS7-2A＞G、2168A>G遗传性聋发生率;IVS7-2A＞G和2168A＞突变检测阳性对患儿父母的婚配、生育具有一定的指导意义。     

相同表型不同基因型耳聋夫妇家庭的遗传咨询与指导

目的利用基因诊断方法分析夫妻同为聋人的耳聋家庭的分子致病机制，为耳聋夫妇提供准确的遗传咨询和指导。方法2005年7月至2006年6月期问共有4个耳聋家庭参加研究，4对夫妇均为重度到极重度聋患者。所有受检患者均采集外周血并提取DNA，进行GJB2、SLC26A4（PDS）基因分析和线粒体DNA（mtDNA）1555位点突变检测。结果家庭1丈夫未携带GJB2、SLC26A4基因和mtDNA A1555G突变，妻子为SLC26A4 IVS7-2A〉G和2168A〉G复合突变，预测后代不论性别100％的可能为SLC26A4基因突变携带者；家庭2丈夫与妻子均未携带GJB2、SLC26A4基因和mtDNA A1555G突变，基本排除了后代因mtDNA A1555G突变、GJB2基因突变和SLC26A4基因突变所致遗传性聋的可能性；家庭3丈夫为GJB2 235delC纯合突变及SLC26A4 IVS7—2A〉G杂合突变；妻子确诊为大前庭水管综合征，但仅检测到SLC26A4 IVS15＋5G〉A一个突变，由于SLC26A4基因突变与大前庭水管综合征和耳蜗畸形有非常密切的关系，按理论推断还应有另一突变位点，预测后代不论性别均有50％可能为大前庭水管患者，50％可能为SLC26A4基因突变携带者，同时肯定为GJB2基因突变携带者；家庭4丈夫为mtDNA A1555G突变携带者，妻子未携带GJB2、SLC26A4基因和mtDNA A1555G突变，预测后代因线粒体基因A1555G突变、GJB2基因突变和SLC26A4基因突变所致遗传性聋的可能性基本被排除。结论耳聋基因诊断可以为耳聋夫妇的遗传咨询和指导提供更加科学准确的理论依据。     

Audiological and radiological characteristics of a family with T961G mitochondrial mutation

Abstract

Objective: The aim of this study was to describe audiological and radiological characteristics, and other secondary aspects, in a family carrying a T961G mutation in the 12S rRNA mitochondrial gene. Design: Case report. Study sample: Six members of a family participated in an audiological evaluation that included pure-tone audiometry, immittance tests, auditory brainstem responses (ABR), and otoacoustic emissions (OAE). The radiological evaluation was conducted through temporal bone CT scans using a Toshiba 16 channels Aquilon Spirale. Neuropsychiatric evaluation was also administered. Results: Three participants were diagnosed with severe sensorineural hearing loss of cochlear origin and cochlear malformations visible in CT scans. One participant had a mild mixed-hearing loss and no cochlear malformations. Two participants had normal audiological and radiological findings. Conclusions: We believe our study can provide helpful insight on the clinical findings of a rare mutation, of which few data have been presented in literature.     

磷酸化JNK在庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞凋亡中的表达

目的:观察庆大霉素致豚鼠前庭毛细胞损伤特点,并探讨磷酸化cjun氨基末端激酶(JNK)在前庭毛细胞凋亡过程中的作用机制。方法:健康豚鼠随机分为实验组和对照组各15只,分别行100mg/(kg·d)庆大霉素和生理盐水连续肌肉注射7d,第8天全身麻醉下处死豚鼠,取壶腹嵴为观察对象,左耳铺片,硝酸银染色检测毛细胞损伤;右耳冷冻连续切片,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测毛细胞凋亡,免疫组织化学方法检测细胞中JNK磷酸化。结果:实验组中毛细胞受损,壶腹嵴顶端见凋亡细胞,并在细胞内观察到磷酸化JNK免疫阳性反应;对照组中未见毛细胞损伤及凋亡细胞,未见磷酸化JNK。结论:庆大霉素可以通过诱导凋亡造成内耳前庭毛细胞损伤,同时磷酸化的JNK标志着JNK途径的活化,提示JNK途径在细胞凋亡过程中发挥了一定作用。     

豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性钾电流的钙离子依赖性

目的研究豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)敏感性钾电流对钙离子的依赖性。方法应用全细胞膜片钳技术研究新鲜单离的豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性钾电流在细胞内外钙离子浓度改变时其电流幅值的变化。结果①细胞外ACh激活一缓慢持久的外向性钾电流,其反转电位为(-70±10)mV;②ACh-敏感性钾电流电流对细胞外四乙胺(10mmol/L)敏感,而对细胞外4-氨基吡啶(100μmol/L)不敏感;③ACh-敏感性钾电流的幅值大小依赖于细胞外的钙离子浓度,无钙外液中ACh激活一很小的电流,4mmol/L外钙溶液中ACh-敏感性钾电流的幅值达到最大值,而0·5mmol/L外钙溶液中ACh-敏感性钾电流的幅值抑制至(36·5±6·5)%;④细胞内三磷酸肌醇-钙离子释放过程不参与ACh-敏感性钾电流的激活,细胞内透析肝素8mg/ml后30min,ACh-敏感性钾电流的幅值没有明显改变;⑤ACh敏感性钾电流对钙通道阻断剂Cd2+敏感。结论豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性钾电流的激活依赖于细胞外的钙离子浓度,ACh与豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞胆碱能受体结合后,首先激活膜上钙通道引起细胞外钙离子内流,毛细胞内游离钙离子浓度的升高进一步激活钙依赖性钾电流。     

A Novel mutation in the SLC26A4 gene in a Chinese family with Pendred syndrome

Objective

To investigate the mutations in the SLC26A4 gene in a Chinese patient with Pendred syndrome.

Methods

The diagnosis of Pendred syndrome was confirmed by the family history, pure tone audiogram, perchlorate discharge test (PDT), and computed tomography (CT) of the temporal bone. DNA extraction, PCR and DNA sequencing were performed according to standard procedures. Mutations in the SLC26A4 gene were compared with 100 unrelated subjects to exclude common polymorphism. Splice-site mutation was further confirmed by restriction enzyme length polymorphism (RFLP) with the specifically designed primers.

Results

The proband presented with typical features of bilateral sensorineural deafness since childhood and goiter development in the early adulthood. Thyroid studies disclosed euthyroidism with elevated thyroglobulin, but negative for PDT. Marked enlargement of bilateral vestibular aqueduct (>1.5 mm) was found by CT of the temporal bone. A novel SLC26A4 splice-site mutation c.1263+1G>A (IVS10+1G>A) was identified in compound heterozygosity with the missense mutation c.1079C>T (p.A360V) in the proband. Both mutations were not found in the 100 unrelated Chinese.

Conclusions

Our results support previous findings that Pendred syndrome can be caused by compound heterozygous mutation in the SLC26A4 gene, in which IVS10+1G>A is a novel pathogenic mutation.     

硫酸链霉素对体外培养大鼠前庭毛细胞的损害作用

目的 探讨硫酸链霉素对离体培养条件下大鼠前庭毛细胞的损害特征.方法 取出生后3～4 d的大鼠球囊斑和椭圆囊斑进行离体前庭器官培养,经培养过夜后再用不同浓度的硫酸链霉素培养液继续培养24 h.应用荧光标记的鬼笔环肽对前庭毛细胞的静纤毛和表皮板进行染色,同时应用Topro-3 DNA探针显示细胞核的形态,在激光共聚焦显微镜下计数和摄像.结果 在离体培养条件下,对照组前庭毛细胞生长良好,随着培养液中硫酸链霉素浓度的增加,毛细胞的密度逐渐降低.培养24 h后,0.25 mmol/L硫酸链霉素可造成大约10%的前庭毛细胞缺损,1 mmol/L硫酸链霉素损害的毛细胞数量在50%左右,3 mmol/L硫酸链霉素破坏的毛细胞数量超过75%.细胞核染色显示硫酸链霉索引起的前庭毛细胞损害伴随着细胞核浓缩或破碎现象.存活毛细胞的数量随着硫酸链霉素浓度的增加而减少,但前庭的支持细胞未发生明显病变.结论 在体外培养条件下,硫酸链霉素可引起剂量依赖性的大鼠前庭毛细胞缺失,其损伤机制可能与凋亡有关.     

鼠尾胶原在毛细胞膜片钳实验中的应用

目的　探讨应用鼠尾胶原在豚鼠前庭毛细胞膜片钳实验中的促进毛细胞贴壁效果。方法　制作鼠尾胶原 ,观察全细胞膜片钳实验中 ,自制的鼠尾胶原对前庭毛细胞的贴壁黏附作用。结果　无鼠尾胶原时 ,前庭毛细胞悬浮于外液 ,不宜封接 ;有鼠尾胶原时 ,前庭毛细胞贴附于培养皿底壁 ,易于封接和长时间 (约 8h)的观察和记录。鼠尾胶原对前庭毛细胞具有良好的贴壁黏附促进作用。结论　鼠尾胶原能促进毛细胞贴壁 ,涂布鼠尾胶原有利于膜片钳实验的长时程记录 ;并且制作简便 ,成本低廉     

KCNN4及KPTN基因在中国DFNA4型耳聋中的突变检测

目的应用位置候选基因法了解中国DFNA4型耳聋家系定位区域内的两个基因KCNN4、KPTN与该家系耳聋表型的相关性。方法对一个6代相传、全基因组扫描连锁分析定位于DFNA4座位的常染色体显性遗传性耳聋中国家系成员,针对候选基因KCNN4、KPTN的全部编码序列设计引物,应用PCR扩增反应、产物纯化后直接测序的方法进行突变或多态性位点的检测与鉴定。结果两种基因的各对引物均有较好的扩增效果,直接测序结果与标准序列比对分析显示在KCNN4基因的所有编码区未检测到突变;在KPTN基因外显子10的编码区鉴定出一处同义突变（2154G／A,P302P）,该突变不与家系的耳聋表型共分离,为已报道的单核苷酸多态性（SNP）位点（rs2293424）。结论该中国DFNA4家系的耳聋表型不是由其定位区域内的KCNN4、KPTN基因编码区的突变所导致,但这两个基因仍是极好的耳聋候选基因,其与遗传性耳聋的相关性有待进一步研究。