血管内皮生长因子反义寡聚脱氧核苷酸与碘油混合栓塞治疗大鼠肝癌的实验研究

目的　观察血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)反义寡聚脱氧核苷酸 (antisenseoligodeoxynucleotides,asODN)抑制体外培养的Walker 2 5 6瘤细胞VEGF表达的情况 ,评价其与碘油混合行肝动脉栓塞对大鼠肝癌的治疗效果。方法　将反义和正义VEGF寡核苷酸加入无血清培养的Walker 2 5 6瘤细胞的培养液中 ,4 8h后酶联免疫吸附试验 (ELISA)法测定上清VEGF含量 ,并观察上清刺激血管内皮细胞 (ECV 30 4 )生长受抑情况。 30只Walker 2 5 6移植性大鼠肝癌模型数字法随机分成 3组 ,分别经肝动脉注入超液态碘油 (UFLP) 0 2ml(UFLP组 ,n =10 ) ,UFLP 0 2ml+VEGFasODN 3OD混合物 (UFLP +asODN组 ,n =10 ) ,生理盐水 0 2ml (对照组 ,n =10 )。于术前及术后第 7天行MR检查观察肿瘤的体积 ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测瘤内及瘤周VEGFmRNA含量 ,免疫组织化学法检测肿瘤组织VEGF的表达及微血管密度 (microvesseldensity ,MVD)。结果　VEGFasODN可以明显抑制培养的Walker 2 5 6瘤细胞VEGF的表达。动脉栓塞实验中 ,UFLP +asODN组肿瘤生长率明显低于UFLP组和对照组 [分别为 (14 0 1± 33 8) %、(177 9± 6 4 9) %和 (4 0 3 9±6 9 4 ) % ;F =6 0 0 2 ,P <0 0 1]。瘤内及瘤周VEGFmRNA含量     

反义技术及其在医药领域中应用的最新进展

反义技术是基因疗法的一种，它为疾病的治疗提供了一条崭新的途径。现已有六种反义制剂进入了临床实验。作者简述了反义技术的原理、在基础研究及医药领域中的应用及寡聚核苷酸真正付诸于应用所需满足的条件。     

肿瘤核素反义显像技术的研究现状与展望

反义显像具有不引起免疫反应、探针分子小，易进入瘤组织等优点，具有广阔的应用前景，但靶序列的选择，理想寡核苷酸的确定等仍是现阶段制约其发展的重要因素。因此，将反主我显像引入体内研究还有很多问题需要解决，包括如何提高探针的体外稳定性，增加靶细胞的选择性摄取和滞留，降低血清蛋白非特异性结合等。     

γ—^32P标记反义核苷酸对HBV基因表达的封闭效应

人工构建特异性互补于ＨＢＶ基因ｍＲＮＡ ＳＰⅡ增强子区的１５－聚反义代脱氧核苷酸并和γ－＾３２Ｐ进行末端标记，以２μｍｏｌ／Ｌ剂量作用于ＨＢＶ基因转染的ＨｅｐＧ２细胞培养２４ｈ及４８ｈ后检测掺入２．２．１５细胞的１５－Ｓ－ａｓＯＮ分别为６９．４ｎｍｏｌ／Ｌ和７５．８ｎｍｏｌ／Ｌ；对ＨＢｓＡｇ的抑制率分别为５０％和７０％；斑点杂交检测ＨＢＶ ＤＮＡ，结果表明实验组与对照组与对照组无显著性差异。     

γ－32P标记反义核苷酸对HBV基因表达的封闭效应

人工构建特异性互补于ＨＢＶ基因ｍＲＮＡＳＰⅡ增强子区的１５－聚反义硫代脱氧核苷酸（１５Ｓ－ａｓＯＮ）并用ｌ－３２Ｐ进行末端标记，以２μＬｍｏ１／Ｌ剂量作用于ＨＢＶ基因转染的ＨｅｐＧ２细胞（２．２．１５细胞），培养２４ｈ及４８ｈ后检测掺入２．２．１５细胞的１５－Ｓ－ａｓＯＮ分别为６９．４ｎｍｏ１／Ｌ和７５．８ｎｍｏ１／Ｌ；对ＨＢ３ｓＡｇ的抑制率分别为５０％和７０％；斑点杂交检测ＨＢＶＤＮＡ，结果表明实验组与对照组无显著性差异，提示本实验所选用的反义核苷酸对ＨＢＶ基因的封闭环节可能发生在翻译水平。实验组与对照组的细胞形态及细胞计数结果表明：我们设计的反义核酸只特异性抑制ＨＢＶ基因表达，而对宿主细胞无明显毒害作用。     

反义寡脱氧核苷酸技术在分子影像中的应用

反义寡脱氧核苷酸(ASODN)技术是根据核酸杂交原理,设计针对特定靶序列的ASODN,从而抑制特定基因的表达。分子影像学是一门在细胞与分子水平对活体生物过程进行描述和测量的新兴交叉学科。ASODN技术以分子影像为技术平台,通过图像达到无创、实时、活体、特异、精细地直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程。该文主要阐述ASODN的作用机制、ASODN的化学修饰、ASODN技术的进展及其在分子影像领域的应用。     

反义寡脱氧核苷酸技术在分子影像中的应用

反义寡脱氧核苷酸(ASODN)技术是根据核酸杂交原理,设计针对特定靶序列的ASODN,从而抑制特定基因的表达.分子影像学是一门在细胞与分子水平对活体生物过程进行描述和测量的新兴交叉学科.ASODN技术以分子影像为技术平台,通过图像达到无创、实时、活体、特异、精细地直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程.该文主要阐述ASODN的作用机制、ASODN的化学修饰、ASODN技术的进展及其在分子影像领域的应用.     

反义寡脱氧核苷酸技术在分子影像中的应用

反义寡脱氧核苷酸(ASODN)技术是根据核酸杂交原理,设计针对特定靶序列的ASODN,从而抑制特定基因的表达.分子影像学是一门在细胞与分子水平对活体生物过程进行描述和测量的新兴交叉学科.ASODN技术以分子影像为技术平台,通过图像达到无创、实时、活体、特异、精细地直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程.该文主要阐述ASODN的作用机制、ASODN的化学修饰、ASODN技术的进展及其在分子影像领域的应用.     

反义寡脱氧核苷酸技术在分子影像中的应用

反义寡脱氧核苷酸(ASODN)技术是根据核酸杂交原理,设计针对特定靶序列的ASODN,从而抑制特定基因的表达.分子影像学是一门在细胞与分子水平对活体生物过程进行描述和测量的新兴交叉学科.ASODN技术以分子影像为技术平台,通过图像达到无创、实时、活体、特异、精细地直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程.该文主要阐述ASODN的作用机制、ASODN的化学修饰、ASODN技术的进展及其在分子影像领域的应用.     

反义寡脱氧核苷酸技术在分子影像中的应用

反义寡脱氧核苷酸(ASODN)技术是根据核酸杂交原理,设计针对特定靶序列的ASODN,从而抑制特定基因的表达.分子影像学是一门在细胞与分子水平对活体生物过程进行描述和测量的新兴交叉学科.ASODN技术以分子影像为技术平台,通过图像达到无创、实时、活体、特异、精细地直接显示细胞或分子水平的生理和病理过程.该文主要阐述ASODN的作用机制、ASODN的化学修饰、ASODN技术的进展及其在分子影像领域的应用.     

MAPK反义寡核苷酸对乙醛活化HSC增殖和JNK信号通路的影响

目的:探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)反义寡核苷酸(ASO)对乙醛活化肝星状细胞(HSC)增殖和MAPK中的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路的影响。方法:用脂质体转染法将MAPKASO导入乙醛活化HSC中,通过MTT法检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测MAPK-JNK表达。结果:MAPK ASO可明显抑制细胞增殖及抑制JNK信号通路的表达,其抑制率分别为40.81%、60.6%。与对照组比较有显著差异(P<0.05)。结论:MAPKASO能够抑制HSC的增殖,阻断JNK信号通路,这可能成为治疗肝纤维化的一个有效途径。     

反义MAPK寡核苷酸对精氨酸加压素诱导下心肌成纤维细胞一氧化氮合成增加的抑制作用

目的：探讨反义丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase）寡核苷酸对精氨酸加压素（AVP）诱导下心肌成纤维细胞（CFs）一氧化氮（NO）合成增加的抑制作用。方法：分离培养SD仔鼠CFs，采用分光光度法和硝酸还原酶法测定CFs一氧化氮合酶（NOS）活性和NO含量。结果：AVP显著提高CFs NOS活性和NO含量；反义MAPK寡核苷酸剂量依赖性地抑制AVP诱导下CFs NOS活性增高和NO含量增加，其中0．2μmol／L和0．3μmol／L反义MAPK寡核苷酸可将AVP诱导下CFs NOS活性和NO含量抑制到与对照组近似水平。结论：MAPK参与了AVP诱导下CFs NOS活性增高和NO含量增加，MAPK激酶有可能成为阻断或逆转心肌纤维化新的作用靶点。     

Sanger测序法确证硫代修饰反义脱氧寡核苷酸的序列

目的：建立一种简便、可靠的硫代修饰反义脱氧寡核苷酸序列确证方法，为反义药物的质量控制及新药研究与开发奠定基础。方法：选择含有待测反义脱氧寡核苷酸序列在内的一段靶基因为模板，以待测序的硫代修饰反义脱氧寡核苷酸作为下游引物，同时在其上游设计一条引物，进行PCR扩增，使待测序的反义序列以修饰形式掺入到PCR扩增产物中；以上述掺入反义序列的PCR扩增产物为模板，利用Sanger双脱氧链终止测序法对其进行自动序列分析。结果：该方法可对不同长度硫代修饰的反义序列进行测定，并且可有效地检测出合成过程中产生的突变和缺失序列，与质谱法相比，仪器和试剂更普及，方法易于掌握且测序成本低，用样量少。结论：该方法可用于硫代修饰反义脱氧寡核苷酸药物的序列确证。     

反义核酸抑制放疗诱导的肝癌细胞VEGF高表达

目的：探讨放疗过程中放疗患者血清血管内皮生长因子（VEGF）升高的机理，以及VEGF反义硫代寡核苷酸（Antisense oligodeoxynucleotide,AS-ODNs）对肝癌细胞VEGF表达分泌的抑制作用。方法。动态观察肿瘤患者放疗期间血清VEGF变化，体外培养肿瘤细胞，观察放疗对肿瘤细胞VEGF表达分泌的诱导作用及反义寡核苷酸的抑制效应。结果：肿瘤患者血清VEGF浓度在放疗期开始后逐渐升高，1－2周达到峰值后开始下降，到第6周时基本恢复到正常，肝癌细胞受X射线照射后VEGF的分泌量较对照组明显升高，VEGF反核组癌细胞VEGF蛋白表达水平较单纯照射组显著下降（P＜0．01）。结论：放射可诱导肿瘤细胞中VEGF的表达分泌。放疗患者放疗过程中血清VEGF浓度升高可能是由于癌细胞受照射后VEGF表达，分泌增加所致，VEGF反义寡核苷酸对放疗诱导的VEGF高表达有较好的抑制作用。     

反义寡核苷酸抑制肝癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的：研究血管内皮生长因子(VEGF)反义寡核苷酸(ODN)对人肝癌细胞系VEGF表达的抑制作用，探讨肝癌基因治疗的新方法。方法：人肝癌细胞系SMMC7721能表达VFGF，采用人工合成反义、正义ODN分别作用于SMMC7721细胞，RT—RCR、流式细胞仪比较各处理组VFGF mRNA及其蛋白的表达变化情况。结果：VEGF RT—PCR扩增条带的图像分析平均灰度值显示，反义组为0．4379，正义组为0．7367，对照组为0．7462。流式细胞仪分析VFGF蛋白表达率，反义组为17．2％，正义组为31．8％，对照组为31．2％。结论：反义ODN能够抑制人肝癌细胞的表达，其有望成为抗肝癌的新一代基因治疗药物。     

脂质体介导C-myc基因反义寡核苷酸对人膀胱癌细胞系Biu-87的生物学影响

目的 :探讨应用脂质体 (LR )介导C -myc基因反义寡核苷酸 (ASODN)对人膀胱癌细胞系Biu - 87的生物学影响。方法 :采用细胞计数、MTT比色法评价反义C -myc寡核苷酸对Biu - 87细胞体外增殖的影响 ,应用免疫组化 (SABC)、DAB显色检测C -myc反义寡核苷酸作用癌细胞后C -myc蛋白的表达情况。结果 :脂质体介导C -myc反义寡核苷酸组与对照组相比 ,Biu - 87细胞增殖活性受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ,12h后可抑制C -myc基因蛋白表达。结论 :脂质体介导C -myc反义寡核苷酸可抑制人膀胱癌细胞体外增殖活性。应用反义技术封闭C -myc癌基因表达 ,为膀胱癌的基因治疗提供了新的思路     

NMDA、甘氨酸、阿片受体与硫喷妥钠催眠作用的关系

目的探讨硫喷妥钠催眠作用与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、阿片受体和甘氨酸受体的关系。方法120只昆明种小鼠,雌雄不拘,随机分成NMDA组、纳络酮组和士的宁组。实验小鼠均于腹腔注射50mg/kg硫喷妥钠,待翻正反射消失1min后,NMDA组40只小鼠鞘内分别注射人工脑脊液(aCSF)和25、50、75ngNMDA(n=10);纳络酮组40只小鼠腹腔分别注射生理盐水(NS)和1.0、2.0、4.0mg/kg纳络酮(n=10);士的宁组40只小鼠腹腔分别注射NS和0.5、1.0、2.0mg/kg士的宁(n=10),记录小鼠睡眠时间。结果NMDA对硫喷妥钠催眠小鼠的睡眠时间无明显影响(P>0.05);而纳络酮或士的宁均能明显延长其睡眠时间(P<0.01)。结论NMDA受体与硫喷妥钠的催眠作用无明显关系,而甘氨酸受体和阿片受体均介导了硫喷妥钠的催眠作用。     

大鼠μ阿片受体及人咪唑啉-1受体在CHO细胞中的共同稳定表达

目的 :建立共同稳定表达大鼠 μ阿片受体及人咪唑啉 1受体的哺乳动物细胞表达系统。 方法 :采用脂质体介导的方法 ,将编码大鼠 μ阿片受体和人咪唑啉 1受体的基因导入CHO细胞中 ,以放射配体 受体结合试验分析受体的表达水平 ,用cAMP积累试验分析表达受体的功能。结果 :在共同稳定表达大鼠 μ阿片受体及人咪唑啉 1受体的CHO细胞中 ,表达的 μ阿片受体对3 H 二丙诺啡 (diprenorphine)的Kd 和Bmax值分别为 (0 .2 4± 0 .0 2 )nmol/L和 (1.83±0 .13)pmol/mg蛋白 ;表达的咪唑啉 1受体对3 H 可乐定的Kd 和Bmax值分别为 (3.72± 0 .2 5 )nmol/L和 (4 3.5 9± 6 .83)fmol/10 6细胞。表达的 μ阿片受体抑制福司科林 (forskolin)刺激下cAMP的积累 ,表达的咪唑啉 1受体抑制吗啡慢性处理、纳洛酮催促引起的cAMP超射。结论 :首次建立了共同稳定表达 μ阿片受体和咪唑啉 1受体的细胞模型。     

氯胺酮镇痛作用与3种受体的关系

目的 探讨氯胺酮镇痛作用与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体、阿片受体、甘氨酸受体的关系,阐明氯胺酮的镇痛作用靶点.方法 将480只小鼠随机分成3大组(NMDA组、纳络酮组和士的宁组),分别进行扭体法和热板法实验,每组160只小鼠随机分为空白组和氯胺酮组,每组再分为8小组(n=10).NMDA组:空白组鞘内注射人工脑脊液(aCSF)或2.5、5、10ng NMDA(NMDA用aCSF稀释),均10μl,注射时间为10s;氯胺酮组均腹腔注射氯胺酮20mg/kg,5min后分别鞘内注射acsF 10μl或2.5、5、10ng NMDA.纳络酮组和士的宁组:动物分组与用药(纳络酮或士的宁)方法同NMDA组.通过扭体法实验分别观察鞘内注射NMDA、腹腔注射纳络酮和士的宁对腹腔注射0.6%冰醋酸溶液(10ml/kg)的小鼠15min内扭体次数的影响.通过热板法观察小鼠用药前、用药后5、10、15、20、30min的热板法痛阈(HPPT).结果 NMDA对空白组小鼠HPPT及扭体次数均无明显影响(P＞0.05),但可增加氯胺酮组小鼠的扭体次数(P＜0.05),缩短其HPPT(P＜0.01).腹腔注射纳络酮(1、2、4mg/kg)或士的宁(0.25、0.5、0.75μg)对空白组小鼠HPPT、扭体次数和氯胺酮组小鼠的扭体次数均无明显影响(P＞0.05),但可缩短氯胺酮组小鼠的HPPT(P＜0.05,P＜0.01).结论 氯胺酮对热刺激的镇痛作用与NMDA受体、阿片受体、甘氨酸受体有关,对化学刺激的镇痛作用与NMDA受体有关,而与阿片受体、甘氨酸受体关系不大.