国境口岸常见11种蚊虫DNA条形码分子鉴定研究

目的通过研究国境口岸常见11种蚊虫的细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列差异性,并分析其系统进化关系,建立口岸常见蚊种的分子鉴定方法。方法设计l对扩增COI部分编码区的PCR引物,对广东、海南和云南等国境口岸采集的致倦库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊等常见11种成蚊进行PCR扩增和序列测定,依据COI核苷酸序列进行系统进化分析。结果 11种蚊虫的COI基因扩增片断长度均为650 bp左右,A+T含量为66.51%~69.97%。同源性比较表明,同一蚊种间核苷酸序列同源性为94.8%~100.0%;不同蚊种间核苷酸序列同源性为77.7%~91.8%。系统进化关系显示,从种的水平上看,白纹伊蚊、致倦库蚊、中华按蚊等上述所有蚊种均聚集成簇,即同种之间呈明显的聚集,与形态学鉴定结果相一致。在属的水平上,库蚊属、阿蚊属、伊蚊属等均聚集成簇,形成各自的单独一支;各属间,阿蚊属与伊蚊属先聚类,再分别与库蚊属、曼蚊属聚类为库蚊亚科,按蚊属与上述蚊种亲缘关系较远。结论本次研究中的COI基因差异可作为国境口岸常见11种蚊虫分类鉴定的分子标记,为口岸常见蚊种的分子鉴定提供帮助,也可为口岸外来的或新发现的蚊种的鉴别提供分子水平的技术依据。     

广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区（rDNA-ITS2）分子鉴定方法及其系统进化关系。[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性，设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，并与GenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析。[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同，M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp-520bp、432bp-438bp、527bp-586bp、439bp-448bp和644bp。序列分析和系统进化关系显示，尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属，再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科，库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类，分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致。[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

宁夏部分地区不同蚊种细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因序列分析

目的了解宁夏部分地区蚊虫种类组成和不同蚊种细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因特征和蚊虫分子系统进化关系。方法对宁夏银川市、石嘴山市、吴忠市和青铜峡市的三带喙库蚊、里海伊蚊、淡色库蚊和八代按蚊4种蚊种COI基因序列进行扩增、测序,在Gen Bank中对所测序列进行相似性比对,分析基因特征、颠换率、遗传距离,利用Mega 7.0软件构建分子系统树。结果本研究中相似性比对结果,其他蚊虫分别与其同种蚊虫的相似性均达到94%~99%,COI基因序列扩增长度为417 bp左右,GC含量为29.4%~31.5%,种间颠换率为5.80%~13.81%,种间遗传距离为0.121~0.160。结论 COI基因具有种间特异性,可作为不同蚊种分类鉴别的参考依据。     

国境口岸10种重要蚊类分子鉴定及系统发育研究

目的建立国境口岸重要蚊类分子鉴定方法。方法针对口岸10种重要蚊类,包括淡色库蚊(Culex pipiens pallens)、致倦库蚊(Culex pipiens quinquefasciatus)、凶小库蚊(Culex modestus)、三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、背点伊蚊(Aedes dorsalis)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、中华按蚊(Anopheles sinensis)和骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)设计特异性引物或通用引物进行核酸扩增,测序后与Gen Bank中的序列比对分析。结果测定的10种重要蚊类均确认为相应蚊种;利用CO I基因的系统发育分析的结果显示与传统的形态鉴定结果一致。结论分子鉴定能准确进行蚊类鉴定,CO I基因在蚊类鉴定中可以作为有效的分子遗传标记。     

三峡库区沿江口岸主要蚊类分子特征分析

目的对三峡库区沿江口岸的主要蚊类进行分子鉴定,分析各种蚊类的分子特征。方法用二氧化碳诱蚊灯在三峡库区沿江5个口岸采集成蚊,形态学鉴定之后,再提取DNA,扩增细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因并测序。将测序结果与GenBank中其他蚊类的DNA序列比对,并构建系统进化树。结果在宜昌、万州、涪陵、寸滩和泸州捕获三带喙库蚊、致倦库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊共5个蚊种3 000余只,选取其中42只扩增COⅠ基因,获得5个蚊种的COⅠ基因序列,长度为658 bp,A+T含量为67.47%~69.71%。同源性比较表明,同一蚊种间核苷酸遗传距离小于0.0215,不同蚊种间遗传距离为0.0742~0.1594。COⅠ基因核苷酸系统进化关系显示,三带喙库蚊、致倦库蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊和白纹伊蚊均聚集成簇,与形态学鉴定结果相一致。结论应用分子鉴定技术对三峡库区口岸蚊类进行鉴定,可为国境口岸蚊类鉴定提供溯源依据。     

广东国境口岸不同蚊种COI序列分析和分子鉴定方法

[目的]建立国境口岸不同蚊种的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）分子和氨基酸鉴定方法并分析其系统进化关系。[方法]设计1对扩增COI部分编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，分析COI核苷酸和氨基酸的系统进化关系。[结果]5种蚊种的COI基因扩增片断长度均为415bp，A＋T含量为68．77％-70．6％。同源性比较表明，不同蚊种间COI片断碱基变异颠换数都明显高于转化数，核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性分别为85．1％-93．7％和92．0％-99.3％。COI核苷酸系统进化关系显示，所有蚊虫的COI分子鉴定与其形态学结果吻合，但骚扰阿蚊位于一单独的分支上，其亲缘关系与其它蚊种最远。COI基因编码的氨基酸系统进化与蚊虫形态学亲缘关系一致，库蚊属、伊蚊属、阿蚊属聚类为库蚊亚科，中华按蚊与其它蚊种的亲缘关系最远。[结论]建立的COI核苷酸和氨基酸鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的属和种的区分，后者更能区分高级分类阶元亚科和正确反映蚊虫的系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，为广东口岸和其它国境口岸范围内外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

云南省东北等地区蚊虫及蚊媒病毒调查研究

目的了解滇东北等地区蚊虫及蚊传虫媒病毒分布特点,为虫媒病毒病防治提供科学依据。方法2009年在滇东北等地区的6个县采集蚊虫标本;蚊虫经分类鉴定后,用细胞培养法分离病毒,对病毒分离物进行分子生物学鉴定。结果共采集到4属（库蚊、按蚊、阿蚊、伊蚊）24种18562只蚊虫,其中三带喙库蚊、中华按蚊为主要蚊种,构成比分别为58．37％和28．45％;从蚊虫标本中分离到15株病毒,经分子生物学鉴定,其中2株（YN0911和YN0967）为基因I型流行性乙型脑炎（乙脑）病毒,均分离自三带喙库蚊;1株（YN0922）为版纳病毒,分离自中华按蚊;12株为淡色库蚊浓核病毒,其中9株分离自三带喙库蚊,3株分离自中华按蚊。结论三带喙库蚊和中华按蚊为调查地区的优势蚊种,并携带乙脯病毒、版纳病毒和淡仁．库蚊浓核病毒：滇东北地区首次分离到乙腩病毒。     

福建口岸三蚊种COI基因序列分析

〔目的〕分析福建口岸白纹伊蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因序列,为建立蚊种分子鉴定方法奠定基础。〔方法〕扩增并测定在福建口岸采集的白纹伊蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊COI基因序列,与GenBank中相应序列进行对比分析。〔结果〕三蚊种COI基因扩增片段长度约500bp,A+T含量为65.61%~68.73%。核苷酸同源性分析结果表明,同一蚊种COI基因同源性为98.1%~100%,三蚊种间基因同源性为84.4%~87.7%;COI部分基因系统进化关系显示,三蚊种COI分子鉴定与形态学鉴定结果一致,阿蚊属与伊蚊属聚类为库蚊亚科,按蚊亚科位于系统进化树另一分支。〔结论〕COI基因核苷酸序列分析可应用于福建国境口岸三蚊种的区分,弥补形态特征信息量不足等传统分类鉴定方法的缺点,为建立外来或新发现蚊种分子鉴定方法奠定基础。     

江苏口岸常见蚊虫沃尔巴克氏体感染调查研究

目的调查江苏各口岸常见蚊虫中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的感染情况及其系统发育关系,为基于Wolbachia的防控策略奠定基础。方法 2015年6-9月采用诱蚊灯法和二氧化碳诱捕法在江苏省苏州、常州、无锡、南京、南通、扬州、泰州、连云港、徐州和淮安10个口岸地区诱捕蚊虫,提取单只蚊虫的DNA,PCR扩增后检测蚊虫Wolbachia wsp基因,计算感染率;并对所有wsp基因进行测序及系统发育分析。结果共检测江苏省10个口岸地区的5种常见蚊虫,Wolbachia总感染率为26.80%,以尖音库蚊复合组感染率(47.81%)最高,其次为骚扰阿蚊(46.24%)、白纹伊蚊(34.06%)和三带喙库蚊(1.25%),而中华按蚊未见感染。这些蚊虫的Wolbachia wsp基因共享10个单倍型,其遗传距离在0.002~0.263之间。Hap-1、Hap-7、Hap-8、Hap-9和Hap-10为同种蚊虫所独有,而Hap-2、Hap-4和Hap-5在江苏不同口岸蚊虫中出现的频率较高,在2~3种蚊虫间共享。其中Hap-1和Hap-2属A大组Wolbachia,而其余单倍型属B大组Wolbachia。结论江苏各口岸常见蚊虫共携带2种Wolbachia,其在蚊虫种内、种间分布多样,基本掌握了江苏不同口岸蚊虫Wolbachia的感染情况,是将来基于Wolbachia特性对蚊媒及蚊媒病控制的关键。     

河北省部分地区蚊虫种类及蚊传虫媒病毒调查研究

目的 了解河北省部分地区蚊虫种类及蚊媒病毒分布，为该地区虫媒传染病防控提供依据。方法 在自然界使用诱蚊灯采集蚊虫标本，形态学分类鉴定后分装编号，液氮保存，组织培养法进行病毒分离，用分子生物学方法检测蚊虫携带病毒种类。使用生物学信息软件对病毒核苷酸序列进行分子生物学特征分析。结果 2019年9月在河北省平山县、威县、平乡县采集蚊虫3属4种共2 638只，其中淡色库蚊为优势蚊种，占捕获总数的69.6%(1 835/2 638);其次为骚扰阿蚊，占20.5%(541/2 638)。从平乡县油召乡的蚊虫标本获得1株可以稳定传代的病毒分离物，经分子生物学鉴定为浓核病毒，基因型属短浓核病毒属成员。结论 该次河北省调查地区的优势蚊种各不相同，威县和平乡县以淡色库蚊为主，平山县以骚扰阿蚊为主，并在平乡县油召乡淡色库蚊中分离到一株浓核病毒。     

河北省曹妃甸地区蚊类形态学及分子鉴定

目的通过形态学特征与COI基因分析对曹妃甸地区蚊种进行鉴定,了解曹妃甸地区蚊类的种群构成与分布情况。方法 2018年7-9月在曹妃甸地区华北理工大学校园、曹妃甸森林公园、曹妃甸湿地景区周边以及南堡开发区南盐公园4个监测点,采用诱蚊灯法与挥网法采集成蚊。首先进行形态学鉴定,再进行COI基因片段的扩增、测序;使用Mega 6.06进行序列比对分析。结果在4个监测点共捕获成蚊5 500只,形态学鉴定出3属5种,分子鉴定出3属7种。稻富库蚊与里海伊蚊未能经形态学确认。通过序列分析,种内遗传距离在0%～2%之间,种间遗传距离在2.1%～16.2%之间。结论运用形态学和分子鉴定方法 ,明确了曹妃甸地区的蚊种构成,填补了本地区蚊类分子鉴定的空白,为今后蚊类监测以及蚊媒传染病防控提供了数据支持。     

咸阳国际机场口岸病媒蚊虫多样性及防治

目的掌握咸阳国际机场口岸病媒蚊虫的多样性,建立本底调查资料。了解主要病媒蚊虫的生物习性和防治方法。方法在蚊虫活动频繁的地点,采用CO2诱蚊灯法捕捉成蚊,并进行分类鉴定,对2004年和2014年的两次蚊虫监测结果进行统计分析。结果和讨论本调查共捕获蚊虫1170只,经鉴定隶属于双翅目蚊科2亚科3属15种;优势蚊种依次为淡色库蚊、迷走库蚊、致倦库蚊、褐尾库蚊和中华按蚊。同时,结合对检验检疫的重要性,对主要的优势蚊种和重要的病媒蚊种都进行了生物学分析并提出了防治建议。     

山西省运城市2012年蚊媒病毒的分离鉴定

目的 了解山西省运城市蚊虫及蚊媒病毒的种类和分布。方法 2012年8月在山西省运城市临猗县和永济市采集蚊虫标本, 经鉴定分类和分批研磨后, 利用细胞(C6/36和BHK21)培养方法分离病毒, 对阳性分离物使用蚊媒病毒种属特异引物进行RT-PCR扩增鉴定。结果 采集4属7种10 455只蚊虫, 临猗县和永济市优势蚊种分别为淡色库蚊(91.96%)和三带喙库蚊(72.85%)。经鉴定分析, 从标本中分离到15株基因Ⅰ型乙型脑炎病毒(JEV)、4株库蚊黄病毒(CxFV)、3株淡色库蚊浓核病毒(CppDNV)和1株盖塔病毒(GETV)。结论 首次从山西省分离GETV和CxFV;三带喙库蚊仍是运城市优势蚊种, 目前当地自然循环的JEV仍以基因Ⅰ型为主。     

云南省德宏州2007年和2010年蚊虫及蚊媒病毒调查

目的 调查云南省德宏州蚊虫和蚊媒病毒分布特点。方法 2007年和2010年的7月在德宏州5个县市利用诱蚊灯采集蚊虫标本,采用C6/36和BHK-21细胞分离病毒,RT-PCR和序列分析方法鉴定病毒分离物。结果 共采集到6属29种43 634只蚊虫,其中三带喙库蚊构成比高达78.69%,中华按蚊构成比为14.77%,其他蚊种数量较少。从蚊虫中分离到6株病毒,经RT-PCR和进化分析表明,其中3株为基因Ⅰ型流行性乙型脑炎病毒 （JEV）,均分离自三带喙库蚊;1株盖塔病毒 （GETV） 分离自三带喙库蚊; 2株淡色库蚊浓核病毒 （CppDNV） 分别分离自三带喙库蚊和迷糊按蚊。结论 三带喙库蚊是德宏州优势蚊种和蚊媒病毒主要传播媒介,当地存在基因Ⅰ型JEV、 GETV和CppDNV的流行,并与以往云南省及我国其他地区的分离株有较近亲缘关系。     

四川省虫媒病毒调查研究

目的通过对四川省虫媒病毒调查,了解乙脑主要流行区蚊虫及其虫媒病毒的分布状况,为防制提供依据。方法 2006-2008年在调查点蚊虫孳生高峰期采集蚊虫标本,进行分类鉴定,并用BHK细胞分离病毒,连续3代观察细胞病变情况;收获细胞病变阳性分离物进行血清学和分子生物学鉴定;采用MEGA3.1生物学软件完成氨基酸序列和病毒进化树分析。结果三带喙库蚊和骚扰阿蚊为乙脑流行区优势种群,分离11株虫媒病毒,其中8株经IFA和RT-PCR鉴定为乙脑病毒(JEV),均属于基因Ⅰ型JEV。E基因区段核苷酸和氨基酸比较发现,8株病毒之间核苷酸和氨基酸同源性分别为98.1%～100.0%和99.7%～100.0%;与2004年四川分离株的核苷酸同源性在97.8%～99.6%,氨基酸同源性在99.3%～100.0%。另外3株病毒在BHK细胞上出现病变时间较JEV快,用20种不同种属的虫媒病毒免疫腹水IFA鉴定和相关的引物进行PCR扩增,结果均为阴性。结论在四川省乙脑流行区有5种蚊虫,其中三带喙库蚊和骚扰阿蚊为优势种群,乙脑病毒由三带喙库蚊携带,其E区核苷酸和氨基酸相对保守,有利于采取针对性防控措施。同时,分离出3株不能鉴定的虫媒病毒,提示为我国不常见种型或尚未发现的新毒种,其生物学特性和对人类的致病性有待进一步研究。     

口岸蚊类监测常用设备的应用及效果评价

目的通过在不同生境、月份使用三种常见诱蚊设备开展成蚊监测,分析评价设备诱蚊效果,为有效开展口岸蚊类监测提供科学依据。方法对莆田口岸2013-2014年蚊类监测采集到的蚊虫进行种属鉴定、数量统计及数据对比分析,评价三种诱蚊设备的监测效果。结果致倦库蚊、白纹伊蚊为调查地域的优势蚊种。紫外灯诱捕库蚊效果明显,灭蚊磁诱捕白纹伊蚊效果明显;CO2诱蚊灯对库蚊和伊蚊的诱捕效果均较明显,既能准确反映蚊虫密度,又能正确反映季节消长。结论 CO2诱蚊灯法可在国境口岸蚊类监测中推广使用,并建议配套完善口岸成蚊控制标准。     

DNA条形码技术用于原木携带蚊种的鉴定

目的对临沂口岸进境原木上截获的蚊种进行DNA条形码研究确定蚊种。方法使用双翅目COI基因国际通用引物对原木携带蚊种COI基因进行PCR扩增和序列测定,序列在NCBI网站上进行Blast,确定蚊种。结果待测蚊种COI序列与GenBank中编号为HQ398903.1的骚扰阿蚊(Armigeres subalbatus)序列相似性为99%。结论基于COI基因的DNA条形码技术可成功地对媒介蚊类进行分类鉴定,该技术可弥补蚊虫形态缺失和形态学鉴定知识不足对蚊类鉴定的影响。     

上海口岸蚊虫与分种检索研究

目的了解上海口岸蚊虫种群和分布。方法灯诱法和捞勺法。结果2005—2007年间上海口岸共捕获蚊虫6属18种,其中按蚊属1种,伊蚊属3种,阿蚊属1种,库蚊属10种,曼蚊属1种,骚扰蚊属2种,背点骚扰蚊在上海首次捕获。广泛分布的有致倦库蚊、淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊和白纹伊蚊。结论致倦库蚊、淡色库蚊、三带喙库蚊、中华按蚊和白纹伊蚊是上海口岸可能骚扰人的常见蚊虫。     

澜沧江中下游地区居民点蚊虫多样性的初步研究

目的探讨澜沧江中下游地区居民点蚊类物种多样性及地理分布格局。方法2007年9—11月用CDC诱蚊灯对澜沧江5个县9个调查点的居民区进行夜间成蚊的调查取样,对所获蚊虫进行分类计数,然后对数据进行统计学分析。结果共捕获蚊虫4682只,分属6属28种（亚种）。结果分析发现,澜沧江中下游地区居民点蚊类的物种多样性与纬度梯度呈负相关（r=-0．3219）,与海拔梯度显示负相关（r=-0．4238）。结论三带喙库蚊是澜沧江中下游地区居民点蚊类的优势种,中华按蚊、环带库蚊、骚扰阿蚊、致倦库蚊、美彩按蚊和棕头库蚊是该区域的常见种。蚊虫多样性与调查点所处的纬度梯度和海拔梯度有一定的联系。     

长江三峡库区成蚊种群构成及密度消长

目的了解三峡库区农村的蚊媒数量变化规律及种群构成情况,为做好蚊媒传染病防治和蚊类危害的预测预报提供参考。方法采用诱蚊灯诱捕成蚊并进行分类鉴定统计。结果全年3类环境共计诱捕成蚊30 160只。经鉴定分类,捕获成蚊隶属1目1科2亚科4属5种。其中库蚊亚科库蚊属有致倦库蚊、三带喙库蚊,伊蚊属有白纹伊蚊,阿蚊属有骚扰阿蚊;按蚊亚科按蚊属有中华按蚊。年均成蚊总密度为134.2只/灯晚。致倦库蚊种群数量最多占46.94%,中华按蚊占26.23%,三带喙库蚊占12.94%。结论诱蚊灯法调查获得的蚊群种群密度消长及其种群构成,对三峡库区蚊媒传染病的防治和蚊虫危害治理有重要意义。