人乳头瘤病毒16 E7基因的原核表达及表达条件的优化

目的:构建pET-28a(+)-HPV16 E7原核表达质粒,并对其表达条件进行优化,为进一步研究HPV16E7致病机制及HPV疫苗提供相应的技术平台。方法:应用基因重组技术,构建pET-28a(+)与HPV16 E7(标准株和湖北株)的原核表达重组质粒,用PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测对重组质粒DNA进行鉴定,将其转入宿主菌E.coliBL21(DE 3)进行诱导以表达蛋白;SDS-PAGE及Western blot检测鉴定表达蛋白的分子量及特异性。优化诱导表达的条件,如温度、IPTG浓度、适用的培养基,探讨不同温度下蛋白的表达形式;纯化回收HPV16 E7蛋白。结果:PCR、限制性内切酶酶切和核酸序列检测证实重组质粒中插入的目的基因,其DNA大小、方向、插入位点和阅读框架均正确;HPV16 E7(标准株)蛋白得到高效原核表达,最佳表达条件:表达HPV16 E7的工程菌BL21(DE 3)的最佳诱导温度是37℃,诱导剂IPTG的浓度为0.3-0.4 mmol/L,最佳培养基为1.5倍LB。结论:pET-28a(+)-HPV16 E7标准株和湖北株重组载体构建成功,人乳头瘤病毒16 E7标准株获得高效原核表达。     

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPVl6感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamHⅠ和HindIⅡ双酶切后插入相同酶切的pET32a（＋）载体,转染JMl09感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Wlescem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切pET32（＋）,E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1（＋）空质粒,构建pcDNA3．1（＋）m5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT．PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1mmol／LPTG、28℃诱导条件下BL21（DE3）菌体中HPVl6E5．TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/mlG418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和pcDNA3．1（＋）／E5真核表达质粒,HPV16 E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达．这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。     

人乳头瘤病毒16型E7基因的原核克隆与表达

目的:研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus HPV)16型E7在原核表达系统中的表达情况和活性,为制备HPV16型E7蛋白疫苗奠定实验基础.方法:通过聚合酶联反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从HPV16 DNA阳性的宫颈癌组织中扩增HPV16 E7全长基因,进一步将其克隆入原核表达载体pET32a( ),并构建重组质粒pET32a( )/HPV16 E7,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达的融合蛋白,用镍螯合亲和层析胶体(Ni-NTA Agarose)纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹法(Western blot,WB)分析鉴定.结果:测序证明成功构建重组质粒pET32a/HPV16E7,IPTG诱导下HPV16E7融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的16%,蛋白质印迹鉴定重组E7蛋白与表达载体的标签蛋白形成相对分子质量约30×103的可溶性融合蛋白.结论:重组质粒pET32a/HPV16E7在大肠杆菌BL21中高效表达目的蛋白.     

鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达

目的：利用 DNA 重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因。方法根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白-YopD 蛋白。利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中进行表达。根据云南玉龙菌株（D106004）全基因组序列设计引物,PCR 扩增目的基因片段。采用 pET-32a（＋）作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒。IPTG 诱导,使重组质粒在其宿主菌 E ．coli BL21（DE3）中表达。结果在大肠杆菌中成功获得了融合表达蛋白,即重组 YopD 蛋白。结论以质粒 pET-32a（＋）作为表达载体,鼠疫菌重要功能蛋白 YopD 能够在大肠杆菌 E ．coli BL21（DE3）中稳定高效地表达,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定

目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a（＋）载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21（DE3）菌株中高效表达,在1mmol／L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30％左右。结论pET32／E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

HPV18E7重组质粒的构建及在大肠杆菌中的表达优化

目的构建HPV18E7基因重组质粒,并探索其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法以提取的HeLa细胞株中的DNA为模板PCR扩增HPV18E7基因;将HPV18E7基因与载体pET-32a(+)连接为重组质粒pET-32a(+)-HPV18E7;将该重组质粒转入大肠杆菌BL21-DE3-pLysS细胞中,探索优化表达的条件,以获得大量HPV18E7致癌蛋白。结果 PCR扩增的目标基因大小序列与HeLa细胞中的HPV18E7基因的大小序列一致。用LB培养基,IPTG和乳糖诱导表达显示不同浓度、不同温度、不同诱导起始量等表达量均不高,尝试用ZYM-5052自动诱导培养基诱导,HPV18E7融合蛋白的表达量远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的表达量。结论测序正确的HPV18E7重组质粒在自动诱导培养基ZYM-5052中获得远远高于用异丙基-β-D-硫代吡唃半乳糖苷(IPTG)和乳糖诱导表达的HPV18E7融合蛋白。     

登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别.     

结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

人乳头瘤病毒18型E2基因的原核表达载体构建与表达

目的 将人乳头瘤病毒18型(Human papillomavirus 18, HPV18) E2基因插入到原核表达载体pET28a( )T7启动子下游,构建原核表达载体pET28a( )-HPV18E2,原核表达并纯化HPV18E2蛋白,为研究HPV18 E2蛋白相关疫苗奠定实验基础.方法 1)以HPV18型基因组DNA为模板,运用聚合酶链反应扩增E2基因,将其插入到原核表达载体pET28a( )中,构建重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2;2) PCR、限制性内切酶切分析以及核酸序列测定重组质粒pET28a( )-HPV18E2的正确性;3)将重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,经镍螯合亲和层析胶体纯化HPV18E2蛋白;4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定HPV18E2蛋白的正确表达.结果 1) PCR、限制性内切酶切分析和核酸序列分析鉴定证实了重组表达质粒pET28a( )-HPV18E2的成功构建;2) SDS-PAGE电泳分析, HPV18E2蛋白在大肠杆菌BL21中表达量占菌体总蛋白的21%,纯化后的蛋白纯度大于90%;经Western blot鉴定,显示HPV18E2蛋白与标签蛋白(6xHis)形成相对分子质量约42KD的蛋白,与理论预计值相符.结论 1)成功构建了原核表达载体pET28a( )-HPV18E2;2)原核表达获得了HPV18E2蛋白.     

hISO基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的: 构建原核表达载体pET-28a(+)-hISO,探讨其融合蛋白在大肠杆菌中的稳定表达情况,为后续实验研究奠定基础。 方法: 以Caco-2细胞的总RNA为模版,采用RT-PCR方法扩增出大小为1770bp的人异麦芽糖酶(hISO)基因片段,将其插入到pET-28a(+)中,构建重组载体pET-28a(+)-hISO。经PCR、酶切及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE电泳、Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定。 结果: 经PCR、酶切及测序鉴定后,重组质粒pET-28a(+)-hISO构建正确,表达重组蛋白相对分子质量为68860,将融合蛋白进行纯化,经40和60mmol·L^-1咪唑缓冲液洗脱后能够得到浓度和纯度相对较高的蛋白。 结论: 成功地构建了hISO基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中获得了融合蛋白表达。     

FUS1基因原核表达质粒构建与诱导表达

目的 构建FUS1基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta(DE3)2 plys]中高效表达重组蛋白.方法 采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入pET-32a( ),经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2 plys细菌,并用IPTG诱导表达.结果 经过PCR、测序鉴定,克隆了pET32a( )-FUS1重组子;在低浓度IPTG(25μmol/L)诱导3 h,Rosetta DE3可以高效地表达重组蛋白,约占细菌总蛋白的40%.结论 成功地克隆到FUS1基因,并使其在原核系统中高效表达.     

人类Foxm1b基因的原核表达、抗体制备及其对肝癌细胞中Foxm1b蛋白的识别

 【目的】构建人类Foxm1b基因的原核表达载体，表达并纯化蛋白，制备多克隆抗体，并用此抗体检测肝癌细胞中Foxm1b基因的表达，为进一步研究Foxm1b基因的功能奠定基础。【方法】从GenBank中下载人类Foxm1b基因全长cDNA序列并用Pegene软件分析其可能的抗原表位，设计引物．应用RT—PCR获得含抗原表位的Foxm1b基因片段，重组人原核表达载体pET-28a，在大肠杆菌BL-21（DE31中诱导表达，应用亲和层析法获得纯度较高的原核表达蛋白并免疫大鼠制备多克隆抗体，用ELISA检测抗体滴度并用免疫细胞化学的方法检测此抗体对肝癌细胞中天然Foxm1b蛋白的识别。【结果】成功构建了Foxm1b基因重组表达载体pET-28a—Foxm1b，表达的蛋白经纯化后免疫大鼠得到了高滴度的多克隆抗体．该抗体可以识别肝癌细胞中的天然抗原。【结论】人类Foxm1b基因的原核表达载体的构建、重组蛋白的表达纯化及有诊断价值的抗体的制备为后续的研究提供了基础。     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

肺炎链球菌自溶素基因的克隆、表达及蛋白纯化

 目的 克隆肺炎链球菌自溶素（LytA）基因并在大肠埃希菌中表达及蛋白纯化。方法 用PCR方法从肺炎链球菌基因组中克隆肺炎链球菌自溶素基因,然后将其插入原核表达载体pET32a（+）,构建pET32a(+) - LytA重组质粒,经IPTG诱导使该基因在大肠埃希菌BL21 (DE3)中表达,亲和层析法纯化目的蛋白,将获得的蛋白用Western blot鉴定门结果扩增出的DNA序列与GenBank中的LytA基因序列一致,成功构建了pET32a(+) - LytA重组质粒并在大肠埃希菌中高效表达,所表达的蛋白经Western blot证实为肺炎链球菌自溶素融合蛋白。结论 成功克隆了肺炎链球菌自溶素基因,并将其在大肠埃希菌中表达、纯化,为新型肺炎链球菌疫苗的研制奠定了基础。     

SARS病毒S2蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)S2基因的原核和真核表达质粒,研究该真核表达重组质粒作为DNA疫苗的可行性.方法 采用RT-PCR技术从灭活的SARS冠状病毒RNA扩增得到SARS-CoV-S2基因片段,定向克隆入原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1 中,构建pET-28a-SARS-CoV-S2和pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒.用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导重组质粒pET-28a-SARS-CoV-S2在大肠埃希菌BL21(DE3)plysS中表达融合蛋白;并将重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒免疫BALB/c小鼠,采用ELISA、Western blot的方法检测被免疫小鼠的抗体应答情况.结果 应用RT-PCR技术,从灭活的SARS冠状病毒扩增得到大小约为998 bp SARS-CoV-S2基因片段后,构建了含SARS-CoV-S2基因片段的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2和真核表达质粒pCDNA3.1-SARS-CoV-S2;通过IPTG诱导,重组pET-28a-SARS-CoV-S2质粒在表达菌BL21(DE3)plysS内表达S2融合蛋白;用纯化的重组真核表达质粒经基因枪免疫BALB/c小鼠后,获得了高效价的特异性抗体.结论 成功构建了可表达SARS-CoV-S2融合蛋白的原核表达质粒pET-28a-SARS-CoV-S2.重组pCDNA3.1-SARS-CoV-S2质粒可作为DNA疫苗使被免疫小鼠产生明显的免疫应答.为建立SARS特异性血清学诊断方法和研制SARS DNA疫苗奠定了一定的基础.     

转录因子Oct-4基因的克隆和原核表达

目的克隆转录因子Oct-4基因、构建原核表达载体。方法从人胚胎标本中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增Oct-4基因的cDNA,再通过基因重组技术将该基因片段克隆到原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,纯化后SDS-PAGE分析表达产物。结果电泳证实RT-PCR扩增产物与预期长度一致,测序结果与GenBank公布的Oct-4基因序列一致较好,IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳分析表明,在相对分子质量47KD左右出现目的蛋白表达条带。结论成功构建了pET-Oct-4原核表达载体,表达并纯化出Oct-4蛋白,为进一步研究Oct-4蛋白打下了实验基础。