弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3．1-P30-ROP2真核表达重组质粒，为进一步表达及DNA疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段，重组人puC18克隆载体，然后将pUC18-P30-ROP2中的P30-ROP2外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组中扩增m特异的P30、ROP2片段，克隆成功pUC18-P30-ROP2重组质粒；经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-ROP2重组表达质粒。结论 成功构建了弓形虫puC18P30-ROP2重组克隆质粒，亚克隆成功pcDNA3．1-P30-ROP2直核表达重组质粒，为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫P30抗原基因的体外扩增、克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应，从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养基初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

引形虫P30抗原基因的体外扩增,克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养在初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段,克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１;经亚克隆,筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒,亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒,为下一步研究奠定了基础     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒，为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。方法 用弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，酚／氯仿法抽提弓形虫基因组DNA；用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表而抗原P30、P22的基因片段，分别重组入pMD18T载体中。将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切，定向克隆入pUC18克隆载体中，pUC18-P30-P22中的P30P22片段经酶切、纯化后，亚克隆入pcDNA3．1(-)真核表达载体，用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段；大小均与预测值相符；克隆pUC18-P30P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基冈大小一敛：经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论 成功构建弓形虫pUC8-P30P21重组质粒和pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础。     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫 P30蛋白 ,采用定向克隆的方法 ,自行设计引物通过 PCR扩增得到 P30基因片段 ,用 Eco R 和 Sal 双酶切后 ,连接到同样双酶切的原核表达载体 (p BV2 2 0和 p MAL P2 )上 ,转化大肠杆菌 DH5 α,分别得到含重组质粒 p BV2 2 0 - P30和 p MAL P2 - P30的工程菌。扩菌提取质粒经过酶切分析和 PCR扩增鉴定后 ,证实 P30基因的两个原核表达载体构建成功 ,为其在原核系统中的表达作准备     

弓形虫昆山分离株P30抗原基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中高效表达P30抗原。方法 采用聚合酶链反应（PCR）从弓形虫昆山分离株cDNA文库中扩增得到编码P30抗原的基因,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX-5x-3,然后在大肠杆菌BL21中进行表达,用亲和层析柱纯化表达产物,并以SDS－PAGE和Western blotting进行鉴定。结果 1、在我们比较的783个碱基中,弓形虫昆山分离株与RH株之间只有两个碱基不同;2、得到－分子量为54kDa的融合蛋白,占大肠杆菌总蛋白的38％。结论 1、弓形虫昆山分离株与RH株的P30基因没有大的差异;2、在大肠杆菌中得到了P30融合蛋白的高效表达。     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

含有弓形虫表面抗原P22、P30复合基因的载体构建

目的　选择弓形虫表面抗原P2 2、P30的有效基因片段 ,共同构建在同一克隆载体pUC19和表达载体 pGE MEXTM- 1上 ,并保证其连接方向及开放读码框的正确。方法　根据已发表P30基因序列 ,用PCR技术调取所需基因片段 ,P2 2基因片段来自重组质粒pGEX - 2T -v2 2 ,将两片段定向克隆于克隆载体 pUC19及表达质粒pGEMEXTM- 1上 ,用酶切及测序的方法对重组子进行鉴定。结果　酶切产物经电泳显示条带清晰 ,P2 2、P30基因片段的泳动位置分别在 4 4 6bp和 86 0bp的位置 ,与预计结果一致 ;测序结果表明插入的复合基因片段方向及序列均正确。结论　成功构建的含有P2 2、P30基因片段的质粒重组体 ,保证了两基因连接方向、序列及开放读码框的正确 ,为今后两基因的进一步复合表达研究奠定了基础。     

刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达

目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

弓形虫不同分离株ROP1和P30基因的体外扩增

通过体外扩增弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２、ＧＴ１４个分离株的编码棒状体蛋白（ＲＯＰ１）和主要表膜蛋白（Ｐ３０）抗原的基因片段,比较虫株间差异,为克隆及其ＤＮＡ免疫的研究做准备。特定引物的设计;弓形虫虫株的复苏、接种、收集、纯化;提取弓形虫ＲＨ、ＺＳ１、ＺＳ２及ＧＴ１分离株的基因组ＤＮＡ,并以此为模板进行ＰＣＲ扩增,扩增产物经１％琼脂糖凝胶电泳分析。结果从４个分离株基因组ＤＮＡ中均扩增出编码ＲＯＰ１、Ｐ３０抗原的基因片段,其大小ＲＯＰ１约７５６ｂｐ,Ｐ３０约１０２５ｂｐ,电泳条带未见虫株间的明显差别。研究表明,所扩增４个弓形虫分离株的ＲＯＰ１和Ｐ３０基因片段均与理论预测值相符,并具有高度保守性。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

弓形虫P30抗原基因的PCR扩增及克隆的初步研究

根据已发表的弓形虫主要表面抗原Ｐ３０基因序列，自行设计合成了一对引物，分别在其正义链和反义链的５′末端加上了ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ的酶切位点，利用ＰＣＲ技术获取Ｐ３０抗原基因整个开放阅读框架的碱基序列。ＰＣＲ产物经ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ双酶切后，与经同样两种内切酶切割的质粒载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ连接构成重组质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ－Ｐ３０，转化大肠杆菌ＤＨ５α。通过遗传标记筛选、ＰＣＲ扩增及酶切分析对重组子进行了鉴定，为进一步选择真核系统或原核系统体外表达该抗原打下了必要的基础。     

弓形虫侵入相关分子ROP1在HepG-2细胞中的表达

弓形虫棒状体蛋白 1(ROP1)是与虫体侵入相关的重要分子。将含编码 ROP1蛋白基因的真核表达重组质粒 pc DNA3转染 Hep G- 2细胞 ,为进一步研究做准备。用脂质体介导的真核细胞转染法 ,G418筛选阳性克隆 ,SDS-PAGE及 Western- blot分析鉴定表达产物。结果显示 ,在所筛选的克隆化生长的细胞裂解液样品电泳图谱中 ,有一大小约 35～ 40 k Da的特异电泳条带 ,该条带可被弓形虫免疫兔血清识别。本研究建立了体外稳定表达 ROP1的细胞系 ,证实了表达产物的免疫原性