大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的 原核表达大鼠γ-干扰素诱导蛋白-10,并对其进行鉴定。方法 从大鼠脾细胞中提取RNA,用RT-PCR方法得到IP-10cDNA,双酶切将其插入pET-32a（＋）载体中。重组质粒pET-32a（＋）-IP-10经酶切、PCR及测序鉴定后转化大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。结果 所获得的大鼠IP-10克隆,经测序与GenBank报道的完全一致。所表达的产物经SDS-PAGE和Westem blot分析获得证实。结论 已成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-IP-10,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。     

SUMO表达系统高效、可溶性表达重组鼠源IL-1β

目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。     

人白细胞介素-21 cDNA克隆及其在大肠杆菌系统的表达

目的：克隆人细胞因子IL-2l全长cDNA及其在大肠杆菌中表达，并进一步检测其表达产物的功能。方法：抽取外周血，分离淋巴细胞；抗CD3抗体刺激后，提取总RNA，通过RT-PCR获得两个部分重叠的IL-21 cDNA片段(分别为5′端242bp，3′端425bp)，重组PCR扩增出IL-21全长cDNA：DNA测序正确后，将成熟IL-21 cDNA的编码框序列构建到原核表达载体pET28a( )中。卡那霉素平板筛选及PCR鉴定，挑出阳性克隆进行扩增、转化大肠杆菌进行IPTG诱导表达：SDS—PAGE、Western blotting鉴定，亲和层析分离纯化得到M，为18600的带有组氨酸标签重组人IL-21融合蛋白。透析法重折叠复性，MTT法测定其对T细胞增殖活性。结果：成功获得人IL-21全长cDNA，并以包涵体形式表达于大肠杆菌中。重折叠后的rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。     

人IL-24基因的克隆、 表达、 纯化及体外诱导肿瘤细胞凋亡的研究

目的:克隆人白细胞介素-24(IL-24)基因,在大肠杆菌中融合表达,纯化复性,研究此融合蛋白的抗肿瘤活性。方法:分离人外周血单个核细胞,ConA刺激培养,提取细胞总RNA,RT-PCR技术克隆人IL-24基因。将IL-24插入到pET32a( )中,构建重组表达载体IL-24/pET32a,IPTG诱导在E.coli表达。Edman法N端测序,将鉴定正确的蛋白亲合层析纯化。MTT比色法体外分析杀伤肿瘤细胞的活性。结果:获得人IL-24基因,序列分析与GenBank公布一致。表达载体用双酶切和PCR鉴定正确。重组工程菌经IPTG诱导后表达相对分子质量(Mr)约为35000的融合蛋白。N端测序正确,鉴定该蛋白以包涵体形式表达。包涵体经洗涤、溶解后,亲合纯化得到纯度大于95%的融合蛋白。复性后表达产物能显著诱导MCF-7乳腺癌细胞凋亡(P<0.05)。结论:IL-24融合蛋白在原核细胞中高效表达,并获得高纯度、在体外明显诱导乳腺癌细胞凋亡的重组蛋白,为后续的研究提供实验基础。     

人PD-L2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人PD-L2基因并构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌中进行表达。方法 以RT-PCR方法从活化的人外周血单个核细胞总RNA中克隆PD-L2基因的cDNA，构建PD-L2胞外区的原核表达载体，在大肠杆菌BL21(ED3)中进行表达并鉴定。结果 克隆到PD-L2基因cDNA编码区全长序列，经DNA测序证明其与已报道的序列一致。进而构建了PD-L2胞外区的原核表达载体，并在大肠杆菌表达，免疫印迹分析表明在IPTG诱导后表达PD-L2胞外区蛋白，相对分子质量Mr为22000，与理论值大小相符。结论 成功克隆PD-L2基因，其胞外区蛋白在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究PD-L2功能提供了条件。     

中国旱獭IL-10分子的克隆和序列分析

目的克隆旱獭白细胞介素-10(IL-10)全长cDNA序列进行序列分析,为IL-10分子的表达和在土拨鼠肝炎病毒(woodchuckhepatitisvirus,WHV)感染中的应用奠定基础。方法根据Genbank的土拨鼠IL-10cDNA序列,在5′非编码区和3′非编码区设计特异性引物,提取旱獭脾组织总RNA作为模板,RT-PCR扩增旱獭IL-10cDNA。PCR产物纯化后连接至T载体(pMD18-T),构建重组质粒pMD18-T-cmIL-10。对重组质粒进行酶切鉴定,选择阳性克隆测序。对所获得的序列应用分析软件进行分析。结果RT-PCR扩增产物为685bp。重组质粒pMD18-T-cmIL-10经EcoRⅠ与PstⅠ双酶切提示含目的基因片段。序列分析提示旱獭IL-10的编码序列为537bp,与土拨鼠IL-10的同源性为100%。结论成功克隆旱獭IL-10分子,并构建重组质粒pMD18-T-cmIL-10。     

小鼠sST2基因真核表达及其对LPS活化RAW264.7巨噬细胞的调节作用

目的:克隆并构建含小鼠sST2和人IgG Fc 融合基因的真核表达质粒, 初步探讨其表达产物sST2-Fc融合蛋白对LPS刺激小鼠巨噬细胞生物学活性的影响.方法:借助RT-PCR技术, 从小鼠脾脏总RNA中扩增全长sST2 cDNA, 构建sST2与hIgG Fc段融合基因的真核表达载体(psST2-Fc).应用脂质体将重组质粒psST2-Fc转染CHO细胞, 经G418筛选, 获得稳定表达sST2-Fc融合蛋白的CHO细胞株.细胞培养上清经蛋白A亲和层析纯化后, 采用Western blot进行鉴定, 应用FACS检测sST2-Fc与RAW264.7巨噬细胞表面相应受体结合情况;ELISA法检测sST2-Fc对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6的影响.结果:测序证实克隆和构建的小鼠sST2-Fc cDNA阅读框序列正确, Western blot 证实sST2-Fc融合蛋白的表达, sST2-Fc抑制LPS诱导巨噬细胞分泌的炎性细胞因子TNF-α和IL-6.结论:成功构建sST2-Fc融合基因并获得稳定表达, sST2-Fc通过与其特异性受体结合可抑制巨噬细胞介导的炎性反应.     

小鼠B7-H4基因克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠B7-H4(mB7-H4)基因cDNA全长,构建表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-GFP和表达可溶性mB7-H4-Fc融合蛋白的真核表达载体pmB7-H4-Fc。方法:采用RT-PCR技术从小鼠脾细胞总RNA中逆转录mB7-H4cDNA,将其全长cDNA去掉中止密码克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,并转染293T细胞使其表达跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白;将其胞外功能区cDNA克隆入pcDNA3·1-hFc真核表达载体中,并转染COS-7细胞使其表达可溶性mB7-H4-Fc融合蛋白。结果:序列测定证实克隆的mB7-H4全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实mB7-H4分别正确插入pEGFP-N1和pcDNA3·1-hFc载体中,两种表达载体分别转染293T细胞和COS-7细胞后可分别表达跨膜型mB7-H4-GFP和可溶性mB7-H4-Fc。结论:成功地克隆mB7-H4基因并构建了两个真核表达载体,它们可分别表达跨膜型和可溶性融合蛋白。     

人可溶性B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:钓取人B细胞刺激因子基因,构建其表达的大肠杆菌工程菌,并体外表达、纯化可溶性B细胞刺激因子方法:从人外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA并逆转录得到cDNA,用PCR扩增目的基因,连接到原核生物表达载体pET-30a上。制备质粒后,酶切、进行菌落PCR及DN测序对其进行鉴定。然后转化大肠杆菌BL21(DE3)并表达对纯化的目的蛋白进行肽质量指纹分析、鉴定,并进一步做体外B细胞刺激试验。结果:RT-PCR钓取出可溶性B细胞刺激因子基因片段。DNA测序结果与报道序列完全一致。在IPTG诱导下,目的基因在工程菌中表达。利用镍金属螯合琼脂糖凝胶亲和层析柱分离。纯化目的蛋白的肽质量指纹图经Mascot搜索与B细胞刺激因子吻合。纯化的蛋白在体外可刺激B细胞增殖。结论:成功地克隆可溶性B细胞刺激因子基因,表达的纯化目的蛋白是具有生物学活性的B细胞刺激因子。     

人精子蛋白SP17基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得人精子蛋白SP17基因(hSP17),构建重组表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:获取人睾丸组织,提取总RNA,通过RT-PCR获得hSP17的全长cDNA;将该cDNA克隆入TA载体,并亚克隆进融合蛋白型重组表达载体pGEX-3b;转化大肠杆菌DH5α并诱导表达之。结果:获得了全长hSP17的cDNA,构建了重组表达子hSP17/pGEX-3b,获得了预期大小的融合蛋白hSP17-GST的表达。结论:通过构建重组表达质粒hSP17/pGEX并转化大肠杆菌,获得了融合蛋白hSP17-GST的高效表达。     

人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:从海马组织提取中国人神经生长因子基因(NGFβ),分析中国人NGFβ序列,再克隆成熟肽部分,使NGFβ在大肠杆菌中表达。方法:提取组织总RNA进行逆转录,克隆到PCRⅡ载体,得650bpDNA片段,以PCRⅡ/NGFβ载体为模板,扩增C端成熟肽部分,并克隆到PG5中,转化大肠杆菌BL21用异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养。表达产物提纯、复性后,进行活性测定。结果:NGFβ cDNA全序列为1 047 bp,所克隆的蛋白编码部分为636 bp,由212个氨基酸组成,序列分析结果与Genebank完全一致,成熟肽部分表达后,经SDS-PAGE电泳在14kD左右有1条明显的新增蛋白带,与预期的分子量相符,并Western印迹证实,rNGF约占菌体蛋白10%左右。结论:通过序列分析证实,重组NGFβ在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并有免疫活性。     

人瘦素基因在胎盘中的分离鉴定及在大肠杆菌中的融合表达

目的 克隆人瘦素(leptin)基因,构建融合表达载体,实现在大肠杆菌中的高效表达.方法 从人胎盘中提取RNA,利用反转录聚合链式反应(RT-PCR),克隆到人的leptin基因编码序列,对该基因片段进行T载体克隆、酶切和PCR鉴定,并且对其进行序列分析.将leptin基因插入到原核表达载体PET-28a中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,并利用脱氧胆酸钠对表达蛋白进行纯化.结果 DNA序列分析表明,从胎盘中克隆的人leptin序列与文献报道的一致,酶切鉴定证实leptin基因正确地插入到了表达载体中,经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳分析,人leptin基因在大肠杆菌中实现了高效融合表达,表达产物的分子量为20kD,经过纯化,得到了较纯的融合表达蛋白.结论 从人胎盘中成功克隆了leptin基因,构建了原核表达载体,实现了在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究leptin的生物学功能奠定基础.     

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

目的构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。方法提取新生大鼠纹状体总RNA,用RT-PCR方法克隆大鼠GDNFcDNA,PCR产物回收后经H indⅢ和KpnⅠ双酶切,插入pAdTrack-CMV中,用氯化钙法将其转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果大鼠GDNFcDNA被成功克隆,重组载体的PCR检测、酶切鉴定及测序分析表明,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,大鼠GDNFcDNA被定向插入。结论成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。     

人IL-1RⅡ基因的克隆及其表达

克隆人IL 1RⅡ基因 ,构建其逆转录病毒载体 ,以探讨其在IL 1主导疾病中的作用。方法 :用RT PCR法从人外周血单个核细胞 (PBMC)中克隆人的IL 1RⅡ基因。将其克隆到原核表达质粒PET2 2b中 ,构建重组质粒PET2 2b IL 1RⅡ。将该重组质粒依次进行PCR、酶切鉴定及测序后 ,转化BL2 1菌 ,以IPTG诱导表达。表达产物用Westernblot鉴定。另外 ,将以酶切重组质粒PET2 2b IL 1RⅡ所获IL 1RⅡ基因的全长ORF ,克隆到逆转录病毒质粒中并转染 2 93细胞 ,用免疫组化染色法检查IL 1RⅡ基因的表达。结果 :用RT PCR法 ,从人PBMC中扩增出 12 0 3bp的cDNA ,测序证实为人IL 1RⅡ基因。Westernblot表明 ,重组质粒可表达IL 1RⅡ蛋白。免疫组化染色表明 ,IL 1RⅡ重组逆转录质粒可在 2 93细胞中高效表达IL 1RⅡ蛋白。结论 :成功地克隆了人IL 1RⅡ基因 ,构建了其原核表达载体和重组逆转录病毒载体 ,并在BL2 1菌中表达IL 1RⅡ重组蛋白 ,为进一步研究IL 1RⅡ基因在相关疾病中的作用创造了有利条件     

人白细胞介素18的原核表达及多克隆抗体的制备

目的：在原核系统中表达并纯化人白细胞介素18（hIL-18)，制备兔抗人白细胞介素18多克隆抗体，方法：用RT－PCR扩增出hIL-18的cDNA克隆到原核表达载体pJW2中，转化大肠杆菌JM101中诱导表达并纯化。用纯化的人白细胞介素18免疫新西兰兔制备多克隆抗体，结果：克隆得到序列正确的IL-18 cDNA，与载体连接后转化入大肠杆菌JM101中诱导表达并成功纯化，并用纯化的人白细胞介素18成功制备了兔抗人白细胞介素18多克隆抗体。结论：制备的多克隆抗体为下阶段的研究提供了重要的实验材料。     

Cloning of human melanoma antigen MAGE-A9 and its expression in hepatocellular carcinomas

Objective:To express the melanoma associated gene MAGE-A9 recombinant protein, obtain the anti-MAGE-A9 monoclonal antibody and to examine the expression of MAGE-A9 hi hapatocellular carcinoma specimens. Methods:MAGE-A9 cDNA was cloned from human hepatocellular carcinoma tissue by using RT-PCR, and then subcloned into the plasmid pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/g Ⅲ to construct the recombinant expression vector pBAD/g Ⅲ-MAGE-A9, and was transformed into E. coli TOP10. The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose, and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay. Results:The cDNA sequence of the cloned MAGE-A9 gene was consistent with the reported sequence. By affinity column and SDS-PAGE, the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35,000, and subsequently the anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was obtained. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected in 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens. Conclusion:MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens, these patients might be suitable candidates for immune involving antigen, encoded by the MAGE-A9 gene.     

家蝇幼虫抗菌肽Attacin基因的克隆表达及抑菌生物学活性

目的克隆家蝇幼虫Attacin抗菌肽基因,构建原核融合表达载体,建立Attacin体内抗菌活性检测系统,优化表达和纯化Attacin目的蛋白,并初步研究其抗菌生物学功能。方法以pUCm-T/Attacin重组质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Attacin编码区序列,分别克隆至原核表达载体pET30a( )和pGEX-4T-1,构建原核重组质粒,转化大肠埃希菌,表达重组Attacin蛋白,并在大肠埃希菌中体内检测Attacin的抗菌活性。利用亲和层析柱纯化重组融合蛋白Attacin,SDS-PAGE进行纯度分析,琼脂糖平板抑菌试验鉴定其生物活性。结果pET30a(a )/Attacin和pGEX-4T-1/Attacin重组质粒分别转化大肠埃希菌后,以IPTG诱导表达,与未诱导对照相比,含有重组质粒的宿主菌生长受到抑制,从pET30a( )/Attacin重组质粒的表达宿主菌中未能获得His-Attacin融合蛋白,而从pGEX-4T-1/Attacin重组质粒转化菌种获得GST-Attacin融合蛋白。SDS-PAGE分析表明Attacin重组蛋白分子量与预期结果一致,琼脂糖平板抑菌试验显示重组Attacin具有抗菌活性。结论Attacin基因在原核系统中成功表达,并且纯化后具有抑菌活性,为下一步研究Attacin的生物学功能及其应用开发奠定了基础。     

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体穿梭质粒的构建及鉴定

构建含大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)cDNA的重组腺病毒穿梭载体。提取新生大鼠纹状体总RNA,RTPCR克隆大鼠GDNFcDNA,产物回收后经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,插入重组腺病毒穿梭载体pAdTrackCMV中,氯化钙法转染入大肠杆菌DH5α中,酶切、PCR及测序分析对重组质粒做进一步鉴定。结果显示大鼠GDNFcDNA被成功克隆,所克隆的GDNFcDNA与基因库注册的相同,以上结果说明本实验成功构建了GDNFcDNA重组腺病毒载体。     

小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备

目的：原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清.方法：参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签（EST）序列进行拼接,预测mlrp cDNA序列.用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体.以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用Western blot鉴定抗体的特异性.结果：预测的mlrp cDNA的长度为1 905 bp.将克隆获得的1 554 bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mLRP融合蛋白.以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清.结论：mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础.     

小鼠白细胞介素23基因在毕赤酵母中的诱导表达及初步活性研究

目的:克隆小鼠白细胞介素23(mice interlecukin-23,mIL-23)基因,构建高效稳定的毕赤酵母表达菌株,并对得到的蛋白进行生物活性的初步测定。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术从pcDNA3-mIL-23上分别扩增获得IL-23的两亚基p19和p40,并通过重叠PCR(over-lap PCR)技术获得含有连接子的p1940,构建pPICZαA-IL-23重组质粒;采用甲醇诱导毕赤酵母表达重组蛋白,MTT方法检测诱导表达蛋白的促淋巴细胞增殖情况。结果:SDS-PAGE分析显示在诱导24小时和36小时后的上清及24～96小时的沉淀中均可以检测到约70 kD的诱导条带。Western blot印迹法证实了重组蛋白为特异性蛋白。上清和沉淀中表达的重组蛋白IL-23能促进外周血单个核细胞的增殖,OD570 nm分别达到(0.235±0.029)和(0.216±0.035),而未刺激的对照组只有(0.135±0.008)和(0.164±0.017)。结论:成功构建出mIL-23的酵母表达载体,诱导产生的蛋白可以明显地促进外周血单个核细胞的增殖。