豚草花粉过敏原的分析、鉴定与纯化

目的：对豚草花粉变应原蛋白进行分析、鉴定与纯化。 方法：提取豚草花粉粗提液,SDS-PAGE分离其蛋白组份并测定分子量,Western-blotting鉴定其变应原组份,通过离子交换层析对花粉变应原进行初步纯化和免疫印迹鉴定。 结果：豚草花粉有30条蛋白带,其中主要条带有9条,70kDa、40kDa为其特异性变应原。经离子交换层析纯化出豚草花粉相对分子量为40 kDa的变应原主要分布在Ⅰ峰。 结论：豚草花粉粗提液中主要变应原为 70 kDa、40kDa蛋白组份。     

短穗鱼尾葵及长穗鱼尾葵花粉过敏原的分析、鉴定与纯化

目的对长穗鱼尾葵和短穗鱼尾葵花粉变应原蛋白进行分析、鉴定与纯化。方法提取这两种花粉的粗提液,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白质组分并测定其分子量。收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对花粉变应原进行初步纯化和免疫印迹鉴定。结果长穗鱼尾葵花粉有30余条蛋白带,其中主要条带有18条,12000和14000 Mr为长穗鱼尾葵花粉特异性变应原;短穗鱼尾葵花粉有30余条蛋白带,其中主要条带有9条,26000、12000和14000 Mr为短穗鱼尾葵花粉特异性变应原,其中14000 Mr为主要变应原;通过离子交换层析方法纯化出长穗鱼尾葵花粉相对分子质量为12000和14000的变应原主要分布在Ⅱ峰中,短穗鱼尾葵花粉相对分子质量为14000的主要变应原分布在Ⅴ峰和Ⅵ峰中。结论对长穗和短穗鱼尾葵花粉变应原进行了初步的分离、鉴定和纯化,为临床鱼尾葵花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

儿童家蚕过敏反应过敏原图谱的研究

目的分析家蚕过敏的儿童血清IgE与蚕蛹过敏原反应的图谱。方法提取蚕蛹的蛋白质成分,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对粗提液的蛋白质组分进行分析;用免疫印迹法(Western blotting)对蚕蛹过敏原成分进行鉴定;用离子交换层析对其过敏原进行初步纯化并进行免疫印迹鉴定。结果蚕蛹有20余种不同的蛋白质条带,其中最多的蛋白质主带集中在30、28、14、12ku。免疫印迹结果显示,1条18ku的条带为反应频率最高的过敏原(5/11)。经过离子交换层析,发现反应的主要过敏原在离子交换层析的第3个洗脱峰。结论儿童家蚕过敏患者血清IgE的反应图谱与成人有所不同,可为家蚕过敏诊断及治疗提供理论依据。 更多还原     

白花鬼针草花粉过敏原的分离鉴定与纯化

目的提取和分离纯化白花鬼针草花粉主要过敏原,并鉴定主要过敏原的致敏性。方法提取白花鬼针草花粉蛋白粗提液,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离粗提液蛋白组分并测定其分子质量,经离子交换层析法分离纯化几类主要的蛋白,Western blotting分别检测其与花粉过敏患者血清IgE结合情况及10位正常人阴性混合血清结合情况,对比鉴定每种主要蛋白质致敏原的致敏性。结果 SDS-PAGE结果示:在12.5~120ku之间广泛分布了20余条蛋白条带,其中主带7条,分子质量在35~70ku和10~15ku的区带蛋白含量最为丰富,余下的范围内还有约10余条次带。Westen-blotting检测示:白花鬼针草花粉变应原的致敏性强,与花粉过敏患者血清特异性IgE结合大。离子交换层析出6类主要变应原蛋白,其分子质量分别为70、65、54、49、39及33ku;阴性对照组Westen-blotting在70ku处有弱显色。结论白花鬼针草花粉的主要过敏原为70、65、54、49、39及33ku;70ku变应原致敏性最强。     

紫红笛鲷过敏原的提取、分离及其免疫学特性鉴定

目的对紫红笛鲷过敏原进行提取、分离及免疫学特性鉴定。方法新鲜紫红笛鲷经预处理后用PBS缓冲液制备总蛋白粗浸液,SDS-PAGE分析紫红笛鲷总蛋白的组成,免疫印迹(Western-blotting)分析紫红笛鲷过敏原,通过离子交换层析对总蛋白粗浸液进行分离并鉴定不同组份的免疫学特性。结果紫红笛鲷可溶性蛋白粗提液SDS-PAGE显示有20条蛋白条带,对鱼过敏病人的阳性混合血清能与其中7个条带反应,分子量分别是42000,36000,30000,27000,25000,17000和12000Mr。离子交换层析后分子量为42000、36000、12000Mr的阳性过敏原蛋白具有免疫学活性。结论本实验对紫红笛鲷过敏原进行了提取、分离和免疫学特性鉴定,离子交换层析技术可以用于紫红笛鲷过敏原蛋白的分离纯化,为紫红笛鲷过敏原的进一步研究和鱼类食品过敏的防治奠定了理论基础。     

BSA-ELISA初步检测短穗鱼尾葵花粉特异性IgE

目的 对短穗鱼尾葵花粉粗浸液的主要变应原进行分析、鉴定.方法 通过SDS-PAGE分析短穗鱼尾葵花粉蛋白质组份.采用Westem blotting鉴定主要变应原,以短穗鱼尾葵花粉粗浸液包板,摸索出其包被浓度、血清稀释度和酶结合物浓度.采用BSA-ELISA法对短穗鱼尾葵花粉过敏患者血清进行初步检测,并与皮肤挑刺试验比较.结果 短穗鱼尾葵花粉粗浸液SDS-PAGE显示有30余条蛋白条带,其中主要蛋白条带有10条.Western blotting显示5例短穗鱼尾葵花粉过敏患者的混合血清能与其中3条蛋白条带起反应,分子量分别是26000、14000和12000Mr.BSA-ELISA检测短穗鱼尾葵花粉特异性IgE,最适粗浸液稀释度为1:100,血清稀释倍数为1:5,生物素化抗体为1:1000,辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(strepavidin-HRP)为1:1000.在此条件下BSA-ELISA与浸液皮试比较.检出结果与皮试阳性患者血清符合率为90%,与皮试阴性患者符合率为80%,与健康人对照检测符合率为100%.结论 本实验对短穗鱼尾葵花粉主要变应原进行了分离和鉴定,BSA-ELISA法测定结果与皮肤挑刺试验初步比较符合率较好.     

王棕花粉变应原的分析与鉴定

目的对我国南方常见的棕榈科植物王棕花粉(Roystonea regia pollen)变应原蛋白进行分离、分析与鉴定,为标准化变应原疫苗的研制提供基础。方法取常规方法制备的王棕花粉浸出液,采用SDS-PAGE分离王棕花粉蛋白质组分,测定其相对分子量,同时用10例对王棕花粉过敏的患者血清作Western-blot鉴定其变应原及主要变应原成分。结果SDS-PAGE显示王棕花粉有10条可辨蛋白带,其中主要条带有8条,分别为100000、66000、38000、36000、29000、30000、24000、16000和14000Mr,Western-blot结果表明,10例王棕花粉过敏患者血清全部呈阳性反应,有66000、24000、16000和14000Mr共4条致敏条带,其中分子量在16000和14000Mr的蛋白为主要变应原。结论王棕花粉变应原的分析与鉴定为临床王棕花粉变态反应疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

悬铃木属花粉的纯化及免疫活性分析

目的对悬铃木属花粉变应原进行初步纯化并对其主要成分进行免疫学活性分析。方法悬铃木属花粉变应原粗制浸液经过凝胶过滤层析，收集主要蛋白质，SDS-PAGE检测各段蛋白质分子量，并用免疫印记法分析7例悬铃木属花粉过敏的支气管哮喘患者血清。结果悬铃木属花粉变应原粗制液经层析柱洗脱得两个洗脱峰，第一峰及第二峰升段富含蛋白，而第二峰降段蛋白含量甚微，收集各段进行SDS—PAGE。出现6条蛋白区带，分子量分别为7、50、35、39、22和16kd。第一峰主要含22-71kd蛋白质，峰2升段以14-16kd之蛋白质为主。对7例花粉过敏的支气管哮喘患者血清免疫印记分析可见4条sIgG反应带，蛋白分子量为50、39、22和16kd，病人血清结合百分比分别为100％、28．57％、57．14％和14．29％。结论悬铃木属花粉变应原含有6种主要蛋白成分，第一峰的50、39和22kd的蛋白质为主要致敏组分，第二峰升段的16kd蛋白质为次要致原。     

草鱼过敏原蛋白质的分离及其免疫学特性初步鉴定

对草鱼过敏原蛋白质组分进行分离和分析,对其致敏蛋白质组分进行免疫学特性鉴定。方法 采用超速离心法提取草鱼的总蛋白,双向电泳(2D)分离,银染法分析其总蛋白组成。收集草鱼过敏病人血清,采用免疫印迹(WB)法鉴定其粗提液蛋白质的免疫学特性。结果 双向电泳图谱可分辨出草鱼蛋白质斑点数约388个,蛋白质相对分子质量在15~124kDa范围内,主要分布在15~55kDa之间;等电点约在pH 3~10范围内,主要分布在pH 5~8。免疫印迹结果显示草鱼中与病人血清IgE结合的蛋白质有22个,蛋白质相对分子质量在20~55kDa之间;等电点主要分布在pH 5~9。结论 本研究成功构建了较为完整的草鱼蛋白质双向电泳图谱,为建立草鱼蛋白质组学数据库及其过敏原蛋白质组学数据库奠定了一定的基础,同时也为草鱼过敏的诊断和治疗提供了依据。 更多还原     

蚕、蛹过敏性疾病及其变应原研究进展

蚕分桑蚕(家蚕)和山蚕(野蚕)两大类,两种蚕及其所产生的蚕丝都能引起过敏反应。除蚕丝外,桑蚕在整个生活周期产生的物质,如蚕尿、蚕蛹、蚕蛾鳞屑等也可诱发过敏反应。蚕丝是动物蛋白,主要由丝素(Fibroin)和丝胶(Sericin)组成。前者约占70%,亦有抗原性,但后者是蚕丝的主要变应原成分,引起由IgE作用机制介导的过敏反应。蛹(蚕茧)是幼虫(蚕)和成虫(蚕蛾)的中间阶段,我国养蚕地区有食用蚕蛹的习惯,蚕蛹食入过敏可能为我国特有的情况。蛹变应原主要为82kDa,79kDa及30kDa的蛋白质,其中分子量30kDa是蚕蛹的主要变应原。     

家蚕蚕蛹基因LOC101743840的原核表达、免疫学鉴定及生物信息学分析

目的原核表达家蚕蚕蛹LOC101743840(以下简称LOC)基因,鉴定LOC蛋白的免疫学特性,并进行生物信息学分析。方法将合成的家蚕蚕蛹LOC基因(gi|512917985)连接至克隆载体p MD18-T,用限制性内切酶Xho I和Bam H I分别对p MD18-T-LOC阳性质粒与原核表达载体p ET-28a双酶切,构建重组表达质粒p ET-28a-LOC并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达(经IPTG诱导);用Western blot鉴定重组LOC蛋白的免疫活性;用Clustalw2和MEGA5工具包分析LOC的基因;用Prot Param Tools预测LOC蛋白的理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构。用IEDB、Preprod和DNAStar预测其细胞抗原表位。结果成功表达了家蚕蚕蛹LOC基因,其开放阅读框768 bp,编码255组氨基酸;由E.coli BL21(DE3)原核表达的重组LOC蛋白为可溶性,分子量约33 k D;Western bolt结果显示重组LOC蛋白可特异性结合家蚕蚕蛹过敏患者血清中的特异性Ig E;家蚕蚕蛹LOC与脐橙螟LOC106139919(gi|913330692)蛋白的同源性为69%。系统进化树显示家蚕蚕蛹与美国白蛾亲缘关系比较近。理化性质预测结果显示LOC蛋白质不稳定。蛋白质结构预测结果显示LOC主要的结构为无规则卷曲。T细胞抗原表位预测得到8个肽段(9-17、79-87、93-102、104-115、124-132、152-160、223-231和244-251)。B细胞抗原表位预测得到个5肽段(34-49、59-74、127-142、202-217和213-228)。结论成功表达了家蚕蚕蛹LOC,并证实重组LOC蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究家蚕蚕蛹蛋白的结构成分、免疫学特性及理化性质提供了实验数据。     

家蚕近交系遗传纯度的RAPD检测

目的分析家蚕近交系IS-c108A的遗传纯度,为家蚕实验动物化的培育工作提供指导。方法应用经过筛选的20条随机引物对家蚕近交系IS-c108A(F10)的3个蛾区各30个个体和该近交系的亲本系统c108、对照实用化品种871各30个个体的基因组DNA进行RAPD扩增,计算个体间和蛾区间的相似系数及遗传距离。结果家蚕近交系IS-c108A(F10)的3个蛾区内的多态性带频率分别为1.807%、1.841%、1.841%,平均为1.830%;起点亲本c108个体间多态性带频率为7.207%,对照品种871个体间的多态性带频率为7.08%;而近交系IS-c108A与c108之间的多态性带频率为49.20%,c108和871品种之间的多态性带频率为58.33%。家蚕近交系IS-c108A10的3个蛾区内个体之间遗传相似系数的平均值分别为0.99581、0.99555、0.99551,总平均为0.99562。结论家蚕近交系IS-c108A(F10)已具有较高的遗传纯合度,家蚕具有易于获得高纯的有利条件。     

利用家蚕病毒颗粒表达和纯化抗肿瘤药物天冬酰胺酶

目的：通过家蚕病毒颗粒简化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶的生产纯化过程,为抗肿瘤的药物生产提供依据。方法：利用基因重组技术构建pFastdual-polh-da26-asp融合蛋白真核表达载体,利用杆状病毒表达系统在家蚕细胞中表达融合蛋白,奈氏试剂法检测L-天冬酰胺酶活性。结果： 成功构建了重组表达载体,融合蛋白在家蚕细胞中顺利表达,并检测到L-天冬酰胺酶在家蚕细胞中表达,活性为2 113.52 U/mg。结论：重组病毒颗粒成功表达,且L-天冬酰胺酶具有一定的活性;可以利用家蚕颗粒病毒简化纯化抗肿瘤药物L-天冬酰胺酶。     

家蚕作为模式生物在现代生物学中的应用

家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表和理想的生物学模型对动物科学的发展起到了巨大的推动作用,其特殊突变已经成为现代遗传工程研究的优良材料。随着家蚕全基因组框架图和精细图制作的完成,家蚕将成为后基因组时代生命科学研究领域较为理想的模式生物。本文综述了家蚕对现代遗传学的贡献,分析了家蚕作为模式生物在发育生物学、生物反应器和基因组分子平台建设等研究领域的现状,论述了家蚕作为模式生物的在现代生物学领域的应用前景。     

采用Western blotting的方法分析蚕蛹致敏原成份

目的应用Western blotting的方法检测蚕蛹(silkworm chrysalis)浸出液中致敏原的成份,为蚕蛹致敏原的研究和临床诊断提供依据.方法取蚕蛹浸出液,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离,再转印到PVDF膜上,封闭后将血清与膜条共同孵育,后与辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体反应,显色底物用对氨基联苯胺.结果SDS-PAGE显示蚕蛹可辨条带有12条,分子量在14～94 kD之间,其中主带有8条,分子量依次为80 kD、68 kD、62kD、50 kD、29 kD、28 kD、18 kD、16 kD.Western blotting结果表明,22例蚕蛹过敏患者血清全部呈阳性反应,浸出液中共有6条致敏条带,其中分子量68 kD和29 kD是主要致敏组份,阳性反应率均为100%.结论蚕蛹分子量68 kD和29 kD的组份为主要致敏组份,结果可为开发适合我国特色的蚕蛹变应原提供依据.     

人生长激素基因组DNA在家蚕BmN细胞中的瞬时表达

目的 :探讨内含子对外源基因在真核细胞中表达的作用。 方法 :直接将含有 4个内含子和自身信号肽的 1.5 kb全长人生长激素基因直接克隆至真核表达载体 pc DNA3.0 ,然后利用脂质体转染家蚕 Bm N细胞 ,收取细胞上清 ,PAGE电泳和Western印迹分析鉴定表达产物 ;将全长基因序列、缺失第 1内含子基因序列和 c DNA序列的表达载体 ,分别转染细胞后检测各片段表达产物之间的差异。结果 :测序结果表明人生长激素基因组 DNA在细胞内正确转录、剪接。蛋白质电泳分析和免疫学检测证明转染细胞能够有效合成并分泌蛋白质。 EL ISA检测发现 3种基因片段中 ,全长的基因序列在表达效果上要高于后两者 (P<0 .0 5 ) ,其中缺失第 1内含子的序列表达效率较 c DNA序列明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :在家蚕细胞中能够正确表达带有自身内含子和信号肽的人源蛋白基因 ;推测基因的内含子在成体的外源基因表达过程中起着更为重要的作用     

Resveratrol elongates the lifespan and improves antioxidant activity in the silkworm Bombyx mori

A number of research has shown that the plant polyphenol resveratrol, one of the most prominent small molecules, has beneficial protective effects in multiple organisms, including worms, flies, and killifish. To understand the effects of resveratrol on lifespan, we evaluated its effects in the silkworm Bombyx mori. In this study, we found that lifespan was significantly prolonged in both female and male silkworms treated with resveratrol. Silkworm larval weight was significantly increased from day 3 of the 5th larval instar (L5D3) to day 7 of the 5th larval instar (L5D7). However, the weight of the pupa, cocoon, and total cocoon was not significantly different in female silkworms with resveratrol treatment than that in controls. Meanwhile, resveratrol significantly improved the thermotolerance of the silkworms, which enhanced their survival rate. Moreover, antioxidant activity was increased by resveratrol in both female and male silkworms. Furthermore, an antioxidant-related signalling pathway, SIRT7-FoxO-GST, was activated in silkworms with resveratrol treatment. Collectively, these results help us to understand the molecular pathways underlying resveratrol induced pro-longevity effects and indicate that silkworm is a promising animal model for evaluating the effects of lifespan-extending drugs.     

重组人胰岛素样生长因子-1纯化及其鉴定的研究

目的：利川亲和层析法将家蚕幼虫中高效表达的重组人胰岛素样生长因子(recombinant human insulin—like growth factor-1．rhIGF-1)纯化并鉴定，以得到具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF-1生物制品。方法：蚕血淋巴中rhIGF—1初步提纯去除杂质。采用亲和层析法纯化rhIGF-1。以EUSA法测定纯化产物中rhIGF-1含量。用SDS-PAGE和Western—blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性．4-甲基偶氮唑蓝(tetrazolium salt，MTT)法观察其对MCF-7细胞增殖的影响。结果：纯化后rhIGF-1纯度约为40％，Western blot分析发现，主要纯化产物相对分子质量为7．5ku的成熟hIGF-1．所含非目的产物与hIGF-1无免疫交叉反应。细胞活性刺激实验显示，rhIGF-1纯品对MCF-7细胞有较好的刺激活性．促增殖能力优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品。结论：蚕血淋巴中的rhIGF-1经亲和层析后初步得到纯化，并显示良好的免疫学活性和生物学活性。     

Identification of the major allergen of Macrobrachium rosenbergii (giant freshwater prawn)

Objective

To characterize the major allergens of Macrobrachium rosenbergii (giant freshwater prawn).

Methods

Raw and cooked extracts of the giant freshwater prawn were prepared. The IgE reactivity pattern was identified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting technique with the sera of 20 skin prick test (SPT) positive patients. The major allergen identified was then characterized using the proteomics approach involving a combination of two-dimensional (2-DE) electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics tools.

Results

SDS-PAGE of the raw extract showed 23 protein bands (15–250 kDa) but those ranging from 40 to 100 kDa were not found in the cooked extract. From immunoblotting experiments, raw and cooked extracts demonstrated 11 and 5 IgE-binding proteins, respectively, with a molecular mass ranging from 15 to 155 kDa. A heat-resistant 36 kDa protein was identified as the major allergen of both extracts. In addition, a 42 kDa heat-sensitive protein was shown to be a major allergen of the raw extract. The 2-DE gel fractionated the prawn proteins to more than 50 different protein spots. Of these, 10 spots showed specific IgE reactivity with patients'' sera. Matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) analysis led to identification of 2 important allergens, tropomyosin and arginine kinase.

Conclusions

It can be concluded that the availability of such allergens would help in component-based diagnosis and therapy of prawn allergies.