人脐带间充质干细胞研究进展及应用

人脐带间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。随着细胞技术的提高,人们对于脐带间充干细胞的研究越发深入,在医学的各个领域都取得了长足的进步,如脐带间充质干细胞分离技术及脐带间充质干细胞的诱导分化技术。本文就脐带间充质干细胞的生物学特性、诱导分化潜能、免疫原性进行综述,重点讨论其最新的临床应用。     

大鼠骨髓间质干细胞基本生物学特性的研究

目的:研究成年大鼠骨髓间质干细胞(rBMMSCs)的基本生物学特性,并与成人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)作比较。方法:分别采用贴壁法和Ficoll-Paque淋巴细胞分离法分离获得rBMMSCs和hBMMSCs,进行体外传代、扩增、纯化,比较分析不同代数的rBMMSCs和hBMMSCs的增殖能力和克隆形成能力,观察传代次数对rBMMSCs的神经分化能力的影响,流式细胞仪检测rBMMSCs表面抗原表达;采用中期分裂相秋水仙素阻抑法分析rBMMSCs的核型。结果:原代rBMMSCs和hBMMSCs在体外扩增后可分别获得(7-8)×10⁵和(5-6)×10⁵个细胞,体外扩增5代后可分别获得1.7×10⁸和l×10⁸个细胞,体外扩增15代后,可分别获得(4-8)×10¹²和(3-4)×10¹²个细胞,随着传代次数的增加,细胞的增殖能力、克隆形成能力和神经分化能力有所下降,但各代rBMMSCs的增殖能力和克隆形成能力都比hBMMCs较强。流式细胞仪检测结果显示rBMMSCs的CDllb、CD45、CD61、CD71、CD8O、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表达为阴性,而CD29和CD44表达阳性。rBMMSCs为正常大鼠二倍体核型。结论:rBMMSCs具有极强的自我更新能力和神经分化能力,是一种具有正常二倍体核型的间质干细胞,在组织工程中具有广阔的应用前景。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨生长因子在体外能否诱导大鼠骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）向心肌样细胞分化,是否增强其旁分泌作用.方法 取4周龄雄性SD大鼠骨髓,贴壁法培养BM-MSC至第3代时,应用流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、CD31.将细胞随机分为间充质干细胞组（MSC组）和生长因子共培养组（GF-MSC组）.MSC组继续培养传代;GF-MSC组与生长因子[其中包括培养基（IMDM）、2％胎牛血清（FBS）、20 nmol/L地塞米松、100μmo1/L维生素C（VitC）、50 μg/L成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、10 μg/L成骨蛋白2（BMP-2）、2μg/L胰岛素样生长因子1（IGF-1）、青霉素和100 mg/L链霉素]共培养.1周后细胞免疫荧光染色检测两组细胞肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）和结蛋白（Des）表达;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组细胞Tn Ⅰ和Des mRNA的表达;ELISA法检测两组细胞裂解液以及细胞培养上清中的肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白水平.结果 体外培养的BM-MSC表达CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45.免疫荧光染色显示GF-MSC阳性表达TnⅠ和Des.RT-PCR结果显示TnⅠ和Des mRNA在GF-MSC有阳性表达,而MSC为阴性表达.GF-MSC组HGF、VEGF在细胞裂解液和细胞培养上清中的蛋白水平（ng/L）高于MSC组（HGF裂解液32.05±0.41比12.10±0.21,培养上清574.21±4.19比169.16±2.41;VEGF裂解液45.66±2.22比30.37±0.54,培养上清487.78±36.29比44.25±1.31;均P＜0.05）.结论 体外与生长因子共培养,可诱导BM-MSC向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌作用.     

低氧对间充质干细胞生物学特性的影响

机体内间充质干细胞(MSC)处于相对低氧环境(体积分数为1％～7％)与常氧环境(体积分数为20％)时表现出不同的生物学特性.低氧诱导因子1α(HIF-1α)作为低氧环境下的主要转录调控因子,广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、糖酵解及血管生成等方面的调控.近年来发现,HIF-1α在对MSC存活、分化及迁移的调控中起重要作用.MSC处于低氧环境时,通过对HIF-1α及其下游基因的调控,可提高MSC的存活率,促进其成软骨分化,抑制成脂分化,增强迁移能力,但对成骨分化能力的影响仍存在争议.不同组织来源、氧体积分数及诱导培养条件等均会对MSC的生物学特性造成影响.因此不同实验结果的比较应在统一的实验条件基础上进行.拟从低氧对MSC的增殖、凋亡、分化及迁移的影响作一综述.     

冻存人脐带间充质干细胞的成软骨分化

目的:研究从冻存人脐带组织中分离培养的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的成软骨分化能力。方法:从冻存人脐带组织中分离培养的hUC-MSCs分为诱导组与对照组,分别采用成软骨诱导分化完全培养基和常规培养基培养7 d。采用实时荧光定量(qRT)-PCR法检测干细胞中成软骨标志物ColⅡa1、ColⅩa1和蛋白聚糖mRNA的表达,免疫印迹及免疫荧光染色检测干细胞Ⅱ型胶原蛋白的表达,阿尔新蓝染色检测干细胞中氨基聚糖含量。结果:hUC-MSCs成软骨诱导分化7 d后,与对照组比较,干细胞中ColⅡa1、ColⅩa1和蛋白聚糖mRNA的表达均上升,Ⅱ型胶原蛋白的表达上升,氨基聚糖含量升高(均 P<0.05)。 结论:从冻存人脐带组织中分离培养的hUC-MSCs采用成软骨诱导分化完全培养基培养7 d后可分化为成软骨细胞,可用于软骨疾病的实验研究和临床治疗。     

动静态不同牵张条件下大鼠骨髓间充质干细胞的增殖与分化

背景：在体外和体内关于细胞对于不同的机械牵张反应的大量研究表明,牵张能够刺激成骨。然而鲜有文献报道不同的牵张方式对于同种细胞的影响有何不同。 目的：比较不同机械牵张方式对大鼠骨髓间充质干细胞的影响。 方法：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用自行研制的牵张装置对骨髓间充质干细胞分别施加动态、静态和模拟临床的混合牵张牵张刺激,分别检测3种刺激方式下骨髓间充质干细胞的增殖能力、碱性磷酸酶活性及Runx2基因的mRNA表达,并测量细胞骨钙素的分泌情况。 结果与结论：静态牵张组与对照组相比,细胞增殖能力提高18.67%,碱性磷酸酶活性、Runx2表达及骨钙素分泌无明显差异;动态牵张组相对于对照组,细胞碱性磷酸酶活性提高60.33%, Runx2表达上升49.67%,细胞外骨钙素的分泌提高了48%,然而细胞增殖则受到了抑制;混合牵张组相对于对照组,细胞增殖能力稍有上升但无统计学差异,其对碱性磷酸酶活性、Runx2表达以及骨钙素的分泌有一定的促进作用,但没有动态牵张组明显。结果提示,静态牵张能够显著刺激骨髓间充质干细胞的增殖,而动态牵张对于刺激骨髓间充质干细胞成骨向分化作用更为明显,混合牵张方式对于细胞增殖及成骨分化均有一定的促进作用。     

梗死心肌组织裂解液对鼠骨髓间充质干细胞诱导分化作用的体外研究

 目的 探讨梗死心肌组织裂解液对骨髓间充质干细胞（MSC）向心肌细胞分化的诱导作用。 方法 取 SD 大鼠梗死区心肌组织及其周围区域正常心肌组织分别制备梗死心肌组织裂解液和正常心肌组织裂解液；用 Balb/c 小鼠骨髓细胞进行 MSC 培养，取生长较好的第 2 代 MSC 制备 MSC 贴片，分别用 DMEM 培养基（空白对照组）、加入正常心肌组织裂解液的 DMEM 培养基（正常心肌组织裂解液组）和加入梗死心肌组织裂解液的 DMEM 培养基（梗死心肌组织裂解液组）培养。取各组培养 14 d 的 MSC，透射电镜下观察细胞超微结构；并进行免疫细胞化学染色，观察 α-肌动蛋白（actin）、心肌特异性转录因子 4（GATA-4）、心肌特异性肌球蛋白重链（MHC）、心肌特异性肌钙蛋白 T（cTnT）、心肌特异性肌钙蛋白 I（cTnI）、心肌增强因子 2（MEF-2）、连接蛋白（Cx）43 和 Cx45 的表达情况。 结果 超微结构观察显示空白对照组细胞器结构正常；正常心肌组织裂解液组细胞内未见明显的肌丝样结构；而梗死心肌组织裂解液组部分细胞内可见细小的肌丝样结构。免疫细胞化学染色分析显示，空白对照组 MSC 不表达心肌细胞特异性蛋白；正常心肌组织裂解液组 MSC 仅表达 α-actin；而梗死心肌组织裂解液组 MSC 表达 α-actin、GATA-4、MHC、cTnT、cTnI 和 MEF-2 等心肌特异性标志蛋白，但不表达 Cx43 和 Cx45。 结论 梗死心肌组织裂解液可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

大鼠真皮间充质干细胞的体外长期培养及胶原海绵对其生长的影响

从新生大鼠真皮细胞中分离多能干细胞，体外长期传代培养，观察细胞形态和超微结构的变化。检测细胞增殖和分化能力的改变及胶原基质对细胞生长的影响。揭示体外长期传代培养对大鼠真皮间充质干细胞生物学性状的影响，结果表明；大鼠真皮组织中的间充质干细胞体外培养至180d，传至25代的细胞仍具有干细胞的特征；形态的均一，细胞核结构原始，细胞器不发达；体外增殖迅速，保持了向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能，胶原基质成分可促进细胞的生长，而胶原海绵支架更利于细胞的三维生长。结论是体外长期传代培养后大鼠真皮间充质干细胞仍保持良好的干细胞特性，为真皮间充质干细胞的深入研究与应用提供了实验依据。     

定向诱导骨髓间充质干细胞参与创面修复的研究

目的探讨诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为血管内皮样细胞参与创面修复的可能机制。方法选择正常成人MSCs,经密度梯度离心分离、纯化及体外培养扩增后,定向诱导分化为血管内皮样细胞作为种子细胞,以大于(1～2)×10个/cm密度种植于支架上,扫描电镜观察后,应用溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记技术标记细胞。于兔子背部制作全层皮肤缺损创面,即刻以纤维蛋白胶为载体,将已标记的血管内皮样细胞回植到供体动物创面上。术后2周切取创面组织,行BrdU和凝血因子Ⅷ(FⅧ)免疫组织化学染色。结果 BrdU阳性的MSCs多聚集在创面肉芽组织中的小血管周围,且有个别血管内皮细胞也呈现BrdU阳性。部分MSCs细胞质中亦有FⅧ表达。结论创面愈合过程中,诱导的MSCs与肉芽组织中小血管的形成密切相关。诱导的MSCs可分化为血管内皮样细胞,并参与创面修复。     

胚胎骨髓间质干细胞分离纯化及基本生物学特性

目的　分离纯化胚胎骨髓间质干细胞 (MSCs) ,研究其基本生物学特性。　方法　采用 1 0 73g LFicoll淋巴细胞分离液分离胚胎骨髓MSCs,体外扩增并观察生长特性 ,流式细胞仪检测细胞表面抗原表达和细胞周期 ,染色体技术分析其遗传特性。　结果　胚胎骨髓MSCs培养 3d后呈针尖状的贴壁细胞 ,7～ 10d后细胞融合呈纤维状 ,体外扩增 10代可获得 1× 10 1 2 ～ 5× 10 1 2 个细胞 ;CD13、CD2 9、CD4 4、CD71表达阳性 ,CD3、CD14、CD33、CD34、CD38、CD4 5、HLA DR表达为阴性 ;染色体核型正常 ;G0 G1 期 :84 6 % ,G2 M期 :2 99% ,S期 :12 35 %。　结论　胚胎骨髓MSCs体外具有较好的增殖更新能力 ,在组织工程中可有广阔的应用前景。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 建立人胚骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法，探讨体外培养MSCs的生物学特性．方法 通过密度梯度离心、贴壁法分离培养人胚MSCs，在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化．应用流式细胞术测定细胞周期和CD44、CD34、CD45表达，并研究其增殖及生长特征．结果 原代及传代培养显示，14代以前的MSCs具有活跃的增殖能力，细胞周期分析显示有82％的MSCs处于Gp／Gl期．MSCs阳性表达CD44，阴性表达CD34、CD45．结论 体外培养14代以前的的MSCs生长稳定，增殖较快，可作为组织工程的种子细胞．     

人脂肪干细胞的生物学特性及分化研究

目的 研究从人脂肪组织中获取人脂肪干细胞（hADSCs）的方法,并观察其形态特点、生物学特性、多谱系细胞分化的特点及间充质来源细胞表面相关标志的表达,探讨脂肪干细胞作为组织工程种子细胞的临床应用前景。方法 应用Ⅰ型胶原酶消化分离人脂肪组织,分时间段收集细胞并进行体外培养;采用流式细胞仪检测CD29、CD34、CD44、CD45、CD105等间充质来源细胞表面相关标志抗原的表达;利用成脂、成骨及成软骨诱导培养基对hADSCs进行定向分化诱导,观察细胞随诱导时间延长形态的变化,分别于诱导第11、14、21天进行油红O染色、茜素红染色及阿尔新蓝染色;采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）细胞增殖检测试剂盒检测hADSCs的增殖功能。结果 ①原代培养的hADSCs接种48 h后大部分细胞贴壁,为多角形的单层细胞;第3代细胞分裂增殖旺盛,细胞细长且排列规律;第8~9代后细胞形态不规则,胞内颗粒明显增多。②第3代hADSCs的表面抗原标记结果:CD29、CD44、CD105阳性表达,阳性率分别为98.89%、93.73%、86.99%;CD34、CD45阴性表达,阳性率分别为0.16%、0.11%。③hADSCs成脂诱导第11天、成骨诱导第14天、成软骨诱导第21天时细胞分化达到高峰,油红O染色、茜素红染色、阿尔新蓝染色均为阳性;④第4、5、6代（P4、P5、P6）hADSCs随培养时间的延长,均呈增长趋势,细胞平均从第24 h开始进入指数增长期,三代之间细胞增殖功能比较: P4＞P5,P6＞P5,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 本次成功从人脂肪组织中分离、培养出目的细胞,经初步鉴定,证实其为hADSCs,同时成功对hADSCs进行了成脂、成骨及成软骨定向诱导分化。hADSCs的增殖能力可能会随传代次数的增加而有所下降;无血清刺激也可能会影响hADSCs的增殖功能,使其增殖能力有所下降。     

Pressure and Distortion Regulate Human Mesenchymal Stem Cell Gene Expression

While the concept that physical forces such as tension and compression are involved in mature tissue modeling is widely accepted, the role of these specific types of mechanical loading in the differentiation and maturation of uncommitted cell types like human mesenchymal stem cells (hMSCs) is currently unknown. We observed that hMSCs have the fundamental ability to distinguish between dynamic tensile and compressive loading by regulating distinct gene expression patterns and that these differences in gene expression can be related to conformational changes in cell shape and volume. Dynamic tension was found to regulate both fibroblastic and osteogenic associated genes while dynamic compression up-regulated genes associated with chondrogenesis. Identifying genes involved in the mechanotransduction of different modes of physical loading in hMSC may greatly enhance the ability to rationally design tissue regeneration systems to restore proper tissue function.     

用骨髓间充质干细胞建立抗砷细胞模型

目的用低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓间充质干细胞（BMSCs），获得抗砷细胞，探讨机体抗砷机制。方法选取胎儿BMSCs，采用细胞抑制率在5％-10％时的NaAs02浓度（1μmol／L）作为砷诱导浓度，同时设不加砷培养的胎儿BMSCs作为同步对照，用噻唑蓝法（MTT）监测细胞抗砷性是否产生；采用氢化物发生．原子荧光方法检测细胞砷含量，二硫代二硝基苯甲酸直接显色法，比较抗砷细胞与同步对照组胞内GSH，GST等砷代谢指标的变化，验证细胞是否获得抗砷性。结果胎儿BMSCs经过18周NaAsO2诱导后，细胞对急性砷中毒的耐受性明显提高，排砷能力增强，细胞内GSH和GST活性增高。结论胎儿BMSCs在低剂量NaAsO2长期诱导下，能分化为具有抗砷能力的细胞。     

血小板裂解液快速扩增人羊膜来源间充质干细胞

目的:研究人血小板裂解液(HPL)扩增的羊膜来源间充质干细胞(AMMSCs)的细胞生物学特征。方法:分别以含7%HPL和10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养介质扩增人AMMSCs,比较含HPL和FBS介质培养扩增的AMMSCs的形态、扩增效率、免疫表型和多向分化潜能。结果:含HPL和FBS培养介质扩增的AMMSCs形态和免疫表型类似。含HPL培养介质能显著加速间充质干细胞(MSCs)的扩增,扩增的AMMSCs能向成骨、软骨和脂肪细胞分化。结论:含HPL培养介质可促进AMMSCs扩增,可为相关临床治疗提供更多人源化、无伦理争议、临床应用障碍少的MSCs。     

人脐血MSCs的生物学特性及其向神经细胞分化的研究进展

脐血间充质干细胞是从脐带血中分离和培养的一种多潜能成体干细胞,具有自我更新和多向分化潜能,在一定条件下可以分化成为神经细胞。脐血间充质干细胞的这些特性吸引了许多学者用它来治疗神经系统疾病如神经退行性疾病,神经损伤和中风等,并取得了一定进展。本文就脐血间充质干细胞的分离纯化和培养方法、生物学特性以及向神经细胞的分化作一简要综述。     

胎盘来源间充质干细胞研究进展

成人骨髓是临床应用时最常见的间充质干细胞(MSC)的来源。由于MSC在成人骨髓的数量以及分化能力随年龄的增长而减低,不同的胎儿组织被用来研究是否存在MSC。胎盘组织中MSC主要分布在羊膜和绒毛膜等来源于胎儿的组织,其抗原表达、分化潜能与骨髓间充质干细胞特征相似。     

骨髓间充质干细胞静脉移植对扩张型心肌病大鼠毛细血管生成的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（MSCs）经静脉途径移植对阿霉素诱导的扩张型心肌病（DCM）大鼠心功能的影响。方法建立大鼠阿霉素性心肌病模型,随机分为三组：DCM空白组（B组）、静脉移植组（C组）和静脉对照组（D组）,另设正常对照组（A组）。经尾静脉注射在体外扩增并DAPI标记的骨髓间充质干细胞和培养基至C组和D组大鼠,A组和B组大鼠不干预。移植后8周心脏彩超观察左室舒张末径（LVDD）、左室射血分数（LVEF）,多导生理记录仪观察左室最大压力上升速率（＋LVdp/dtmax）、左室最大压力下降速率（-LVdp/dtmax）,并分析组织病理学特征。结果细胞移植后8周,C组LVEF高于B组和D组;LVDD稍低于B组和D组;＋LVdp/dtmax明显高于B组,也显著高于D组;-LVdp/dtmax明显高于B组和D组;C组心肌中可见带有蓝色荧光的DAPI标记的骨髓MSCs,心肌胶原容积百分比低于B组和D组,毛细血管计数高于B组和D组;C组VEGF水平明显高于B组和D组。结论骨髓MSCs静脉移植治疗阿霉素诱导的扩张型心肌病大鼠,提高VEGF水平,促进心肌毛细血管新生,减少胶原纤维,改善心功能。     

Mesenchymal Stem Cells in Cancer

It is becoming increasingly evident that stromal cells such as macrophages, mast cells, adipocytes and mesenchymal cells associated with tumors significantly contribute to tumorigenesis. Some types of cancer indeed profoundly rely on extrinsic signals afforded by infiltrating or neighbouring cells for survival, proliferation and dissemination. Tissue disruption that results from tumor growth further activates tissue repair and inflammatory reactions that significantly shape the nature of the developing tumors. Over the past recent years, several studies have revealed that mesenchymal stem cells (MSCs) are recruited to tumors and play a particularly important role in the regulation of both solid and haematological malignancies. The tumor-homing properties of MSCs have further led to studies investigating their therapeutic use as targeted delivery vehicles of gene products. I hereafter discuss the role of MSCs in cancer.     

犬骨髓间充质干细胞的生长特点和在诱骨条件下的成骨特性

为了研究犬骨髓间充质干细胞（canine mesenchymal stem cells，cMSCs）的生长特点和在诱导条件下的成骨特性。使用密度梯度法分离成年犬骨髓间充质干细胞进行培养，保留贴壁细胞传代，观察，以地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸为成骨诱导剂。利用倒置光学显微镜和透射电镜观察细胞形态特征，四甲基偶氮盐（MTT）比色测定增殖，用碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性及骨钙素（Osteocalcin，OCN）含量来研究细胞分化情况。形态学观察表明，cMSCs贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，透射电镜可见成骨诱导后cMSCs具有分泌型细胞的特征；推测成骨诱导剂可促进骨髓间充质干细胞成骨，表现为ALP活性、OCN含量明显升高。本实验表明所培养的cMSCs保持了未分化状态，并在成骨诱导剂的作用下可向成骨细胞分化。