电针“足三里”对脾虚大鼠心肌细胞AMPK-线粒体通路的影响

目的观察电针"足三里"对脾虚大鼠心肌细胞线粒体能量代谢、线粒体自噬的影响。方法 48只SD大鼠,随机分为正常对照组、模型组、足三里组、非经非穴组,每组12只。采用三因素复合法复制脾虚证模型,持续14 d。足三里组针刺大鼠双侧足三里穴,非经非穴组针刺大鼠双侧髂嵴上非经非穴点,电针治疗10 d。高效液相色谱法检测大鼠心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)以及磷酸腺苷(AMP)的含量;Western blotting法检测大鼠心肌细胞腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、微管相关蛋白1轻链3-I(LC3-I)以及LC3-II蛋白的表达;利用透射电镜观察大鼠心肌细胞线粒体及线粒体自噬体的超微结构。结果与正常对照组相比,模型组、足三里组以及非经非穴组大鼠心肌AMP/ATP、LC3-II/LC3-I均明显上调(P﹤0.01);模型组大鼠心肌p-AMPK/AMPK有所上调(P﹤0.05),足三里组大鼠心肌p-AMPK/AMPK显著上调(P﹤0.01)。与模型组相比,足三里组大鼠心肌LC3-II/LC3-I显著上调(P﹤0.01)。模型组大鼠心肌线粒体损伤明显,足三里组线粒体损伤有所改善,见大量的线粒体自噬体。结论电针"足三里"可能通过激活脾虚大鼠心肌细胞AMPK,调节线粒体能量代谢、提高线粒体自噬水平,对脾虚大鼠起到干预作用。     

黄芪甲苷对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体自噬相关蛋白表达的影响

【目的】探讨黄芪甲苷对高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡及线粒体自噬相关蛋白表达的影响。【方法】将大鼠近端肾小管上皮细胞NRK-52E分为3组:正常对照组、高糖刺激组(给予葡萄糖30 mmol/L,作用48 h)及黄芪甲苷干预组(给予葡萄糖30 mmol/L刺激的同时加用黄芪甲苷100μmol/L,48 h)。采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖能力;采用Westernblot法检测促凋亡蛋白cleaved-caspase-3及同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1(PINK1)/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达。【结果】黄芪甲苷可有效缓解高糖对细胞增殖的抑制作用(P 0.01)。高糖可上调NRK-52E细胞促凋亡蛋白cleaved-caspase-3,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin的表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(均P 0.01);而黄芪甲苷干预可显著下调上述促凋亡蛋白及线粒体自噬相关蛋白的表达(P 0.05或P 0.01)。【结论】黄芪甲苷可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞NRK-52E的凋亡,减轻其由PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。     

阻塞性睡眠呼吸暂停综合征对大鼠海马神经细胞线粒体自噬相关蛋白表达的影响

目的 观察阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（OSAS）大鼠海马细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。方法 将24只成年雄性SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组进行OSAS模型复制，复制成功后继续饲养，按饲养时长分为2周组、4周组和6周组；对照组无特殊处理。每组6只。Western blotting检测大鼠海马细胞线粒体自噬相关蛋白LC3（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）、p62、PINK1及Parkin蛋白相对表达量；用透射电子显微镜观察其线粒体的变化。结果 实验组大鼠模型复制前后最低血氧饱和度和平均血氧饱和度的比较，差异有统计学意义（P <0.05），即OSAS模型复制成功。与对照组比较，2周组、4周组和6周组大鼠海马神经细胞LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于对照组，p62蛋白相对表达量低于对照组（P <0.05）；进一步两两比较，4周组LC3、LC3Ⅱ/LC3ⅠPINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于2周组，p62蛋白相对表达量低于2周组（P <0.05）；6周组LC3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PINK1及Parkin蛋白相对表达量均高于4周组，p62蛋白相对表达量低于4周组（P <0.05）。透射电镜观察，与对照组比较，2周组、4周组和6周组大鼠海马区可见被双层或多层磷脂双分子层包裹的线粒体自噬体。结论 OSAS可致大鼠海马神经细胞发生线粒体自噬，其自噬程度随饲养时间延长而加重。     

抗纤益心方通过AMPK/mTOR通路改善扩张型心肌病大鼠心功能的作用机制

目的探讨抗纤益心方通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对扩张型心肌病(DCM)大鼠心肌细胞自噬、心功能的影响及其机制。方法将60只Wistar大鼠随机分为正常组,模型组,抗纤益心方高、低剂量组和卡托普利组,每组各12只。模型组、抗纤益心方组和卡托普利组经呋喃唑酮水溶液诱导扩张型心肌病模型,药物治疗8周。超声心动仪检测各组大鼠心脏左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、缩短分数(FS)、左室射血分数(LVEF)的变化;HE染色观察心肌细胞排列及形态;透射电镜观察线粒体超微结构及自噬;Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、Beclin1、p62与AMPK、mTOR表达及其磷酸化水平。结果与正常组比较,模型组LVESD和LVEDD增加,FS和EF降低;与模型组比较,抗纤益心方高剂量组和卡托普利组LVESD和LVEDD降低,FS和EF增加;模型组心肌细胞线粒体排列紊乱,局部肌丝断裂,线粒体肿胀伴空泡样变化,边界模糊不清,抗纤益心方高剂量治疗后线粒体超微结构的损伤改善;与正常组比较,模型组心肌LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达降低、p62表达升高;与模型组比较,抗纤益心方高剂量组和卡托普利组LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达增加,p62表达降低;与正常组比较,模型组p-AMPK/AMPK降低,p-mTOR/mTOR升高;与模型组相比,抗纤益心方高剂量组和卡托普利组p-AMPK/AMPK升高,p-mTOR/mTOR降低。结论抗纤益心方通过促进扩张型心肌病大鼠心肌细胞自噬,改善心脏功能,其作用机制可能与调控AMPK/mTOR通路有关。     

灵芝提取物对MPP+诱导的Neuro-2a细胞自噬的影响

目的 观察灵芝提取物（Ganoderma lucidum extract,GLE）对1-甲基-4-苯基-吡啶离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP⁺）诱导的Neuro-2a细胞自噬的调节作用。方法 采用蛋白印迹检测自噬标志物LC3的转换（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）以及荧光显微镜检测LC3点状聚集物的形成。同时Western blotting法检测AMPK/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin、NIX/LC3蛋白的表达水平。结果 激光共聚焦采集图像结果显示,MPP⁺处理组细胞LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上,观察到呈点状聚集状态,而GLE干预组细胞点状聚集状态不明显。以LC3的点状聚集阳性细胞占总细胞的百分比评价自噬水平的高低。MPP⁺组呈绿色点状分布的LC3阳性细胞百分比明显升高,GLE组明显降低。Western blotting法检测结果显示GLE组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低。同时,经GLE处理后,可以改善MPP⁺损伤引起的AMPKα/mTOR/ULK1、PINK1/Parkin通路各蛋白异常表达。结论 GLE能抑制MPP⁺诱导的Neuro-2a细胞的自噬反应,调节细胞自噬相关蛋白AMPK/mTOR/ULK1以及PINK1/Parkin的异常表达,表明GLE可能通过调节细胞自噬而发挥神经保护作用。     

脾气虚证大鼠股四头肌线粒体自噬水平及AMPK/ULK1途径变化的研究

目的观察脾气虚证大鼠股四头肌线粒体自噬水平及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/UNC-51-类似自噬激活激酶1(ULK1)途径的变化,从线粒体方面研究"脾气虚四肢不用"的机制。方法运用饮食失节+劳倦法复制脾气虚证大鼠模型,随机分为对照组和脾气虚模型组(模型组),造模成功后取股四头肌,比色法检测三磷酸腺苷(ATP)含量;JC-1法检测线粒体膜电位(MMP);免疫荧光及印迹法(Western blot)法检测微管相关蛋白1轻链3-B (LC3 B)、选择性自噬接头蛋白(p62)表达水平及与线粒体共定位的量;Western blot法检测AMPKα及ULK1蛋白表达。结果与对照组比较,模型组股四头肌ATP、MMP下降(P0.05,P0.01);LC3B-II蛋白表达及与线粒体共定位增加(均P0.01)、p62蛋白表达及与线粒体共定位减少(均P0.01);p-AMPKα/AMPKα及p-ULK1/ULK1比值升高(均P0.01)。结论 "脾气虚四肢不用"可能与AMPK/ULK1途径激活所致的线粒体自噬水平提高不足有关。     

不同频率电针介导PINK1/Parkin通路治疗STC大鼠的实验研究

摘要 目的：探讨线粒体自噬相关蛋白（PINK1）/帕金蛋白（Parkin）通路对慢传输型便秘（STC）大鼠模型结肠Cajal间质细胞（ICC）线粒体自噬的影响及不同梯度电针的干预效应。方法：取34只8周龄雄性健康SD大鼠,采用随机数字表分为正常对照组（7只）和建模组（27只）。建模组采用洛哌丁胺混悬液灌胃法制备STC大鼠模型,并于验证建模成功后采用随机数字表分为模型对照组、低频电针组、高频电针组、假电针组。低频电针组予以电子针疗仪频率2Hz、强度10mA刺激“后三里”,高频电针组予以电子针疗仪频率50Hz、强度10mA刺激“后三里”,假电针组针刺“后三里”但不通电,模型对照组和正常对照组仅固定处理,每天30min,1次/d,持续14d。碳素墨汁灌胃法检测肠道推进率;苏木素-伊红（HE）染色观察结肠组织病理改变;免疫荧光共聚焦显微镜观察ICC形态、透射电镜观察超微结构;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测结肠组织C-Kit、PINK1、Parkin、自噬效应蛋白1（Beclin1）、p62、自噬相关蛋白3（LC3）信使核糖核酸（mRNA）的表达;免疫组化及蛋白质免疫印迹（WB）法检测结肠组织C-kit、PINK1、Parkin、Beclin1、p62、LC3蛋白表达。结果：STC大鼠模型构建成功且干预期间均无死亡;与正常对照组比较,其余4组肠道推进率,ICC数量、免疫荧光积分光密度（IOD）值,C-kit、p62 mRNA及蛋白表达均下降（P＜0.05）;与模型对照组和假电针组比较,低频电针组、高频电针组肠道推进率,ICC数量、免疫荧光IOD值,C-kit、p62 mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）;与低频电针组比较,高频电针组肠道推进率,ICC数量、免疫荧光IOD值,C-kit、p62 mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）;与正常对照组比较,其余4组PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达均升高（P＜0.05）;与模型对照组和假电针组比较,低频电针组和高频电针组PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达均下降（P＜0.05）;与低频电针组比较,高频电针组PINK1、Parkin、Beclin1、LC3 mRNA及蛋白表达均下降（P＜0.05）;正常对照组大鼠结肠组织、ICC形态及超微结构均正常,模型对照组和假电针组均呈显著改变,低频电针组和高频电针组均改善,且高频电针组基本接近正常对照组。结论：电针“后三里”能够减轻STC大鼠结肠模型病理改变和ICC形态学改变,减少ICC线粒体自噬,推测与下调PINK1、Parkin、Beclin1、LC3表达,上调C-kit、p62表达有关。     

顺式阿曲库铵加重机械通气大鼠膈肌萎缩的研究

  目的   研究神经肌肉阻断剂顺式阿曲库铵在机械通气SD大鼠膈肌萎缩中的作用及可能的机制。   方法   将30只成年雄性SD大鼠随机分为5组:①对照组（CON组,n=6）,禁食30 h;②机械通气组（MV组,n=6）,禁食6 h后机械通气24 h,同时持续泵入戊巴比妥钠+0.9%氯化钠;③机械通气+顺式阿曲库铵组（MVC组,n=6）,禁食6 h后机械通气24 h,同时持续泵入戊巴比妥钠+顺式阿曲库铵;④机械通气+氯喹（chloroquine, CQ）组（QMV组,n=6）,机械通气前24 h和前30 min腹腔注射自噬抑制剂CQ 30 mg/kg,其余操作同MV组;⑤机械通气+顺式阿曲库铵+CQ组（QMVC组,n=6）,机械通气前24 h和前30 min腹腔注射自噬抑制剂CQ 30 mg/kg,其余操作同MVC组。各组大鼠于30 h后处死,取肋膈肌标本。HE染色观察膈肌纤维横截面积（cross-sectional area, CSA）,免疫荧光染色观察线粒体外膜转移酶蛋白-20（TOM20）和微管相关蛋白1-轻链3（LC3）的共定位,Western blot检测肋膈肌中肌肉萎缩相关蛋白MAFbx、MURF-1,线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、P62、LC3的表达水平。   结果   MV组和CON组相比,MVC组和MV组相比,CSA减小（P<0.05）,MURF-1、MAFbx蛋白的表达量增加（P<0.05）,TOM20和LC3的共表达的线粒体数量增加,LC3表达增加（P<0.05）,PINK1、Parkin、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达量增加（P<0.05）,P62蛋白的表达量下降（P<0.05）;QMV组和MV组相比、QMVC组和MVC组相比,CSA增大（P<0.05）,MURF-1、MAFbx蛋白的表达量减少（P<0.05）,TOM20和LC3的共表达的线粒体数量减少,LC3表达减少（P<0.05）,PINK1、Parkin、LCⅡ/Ⅰ蛋白的表达量减少（P<0.05）,P62蛋白的表达量增加（P<0.05）。   结论   机械通气24 h,引起SD大鼠膈肌萎缩;顺式阿曲库铵通过自噬-溶酶体（autophagy-lysosome, AL）途径加重机械通气大鼠的膈肌萎缩,此过程可能与PINK1-Parkin介导的线粒体自噬途径有关;氯喹通过阻断AL途径可改善顺式阿曲库铵引起的机械通气大鼠膈肌萎缩。      

迷迭香酸激活Parkin介导的线粒体自噬并抑制高糖诱导的心肌细胞肥大

目的 评估迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞线粒体自噬水平以及细胞肥大的影响。方法 体外培养H9c2大鼠心肌母细胞,分为对照组（葡萄糖5.5 mmol/L）、高糖组（葡萄糖25 mmol/L）、高糖+迷迭香酸组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L）、高糖+迷迭香酸+Parkin-siRNA组（葡萄糖25 mmol/L+迷迭香酸50 μmol/L+Parkin-siRNA转染）;Western blot法测定PINK1、Parkin、LC3II/LC3I蛋白表达水平,透射电子显微镜下观察线粒体自噬体形成情况,流式细胞术检测活性氧物质（ROS）与凋亡水平,分光光度法检测细胞线粒体呼吸链复合酶活性,荧光酶标法检测线粒体膜电位水平,3H-亮氨酸标记法检测细胞蛋白质合成速率,光学显微镜下检测心肌细胞表面积。结果 迷迭香酸可提高高糖培养下心肌细胞内PINK1、Parkin、LC3-II/LC3-I蛋白表达水平（P<0.05）,增多线粒体自噬体数量,并抑制高糖诱导的ROS生成、恢复线粒体呼吸链复合酶活性与线粒体膜电位水平（P<0.05）,抑制高糖诱导的细胞凋亡（P<0.05）,并降低心肌细胞表面积与蛋白质合成速率（P<0.05）。利用Parkin-siRNA抑制心肌细胞线粒体自噬,则阻断了迷迭香酸对高糖培养下心肌细胞氧化应激与心肌细胞肥大的保护作用（P<0.05）。结论 迷迭香酸可通过激活Parkin介导的线粒体自噬,对高糖诱导心肌细胞的氧化应激损伤有保护作用,并改善心肌细胞肥大。     

芹菜素通过AMPK/mTOR通路调控肺癌A549细胞自噬

目的 探讨芹菜素（APG）对肺癌A549细胞增殖及自噬的影响及其与AMPK/mTOR通路的关系。方法 体外培养肺癌A549细胞,采用CCK-8法检测不同浓度芹菜素处理A549细胞不同时间后对细胞增殖的影响。后续实验分为空白对照组(0 μmol/L APG),低、中、高浓度实验组和抑制剂组5组,采用MDC染色法检测各组对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测自噬相关蛋白以及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达情况。结果 芹菜素可显著抑制A549细胞增殖,且呈浓度依赖性（P<0.05）;20、40、80 μmol/L芹菜素组随作用时间延长,对A549细胞的增殖抑制率逐渐增加,呈时间依赖关系（P<0.05）。与空白对照组比较,实验组A549细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡数量及IOD值逐渐增加（P<0.05）,芹菜素可浓度依赖性上调LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值（P<0.05）,下调p-mTOR、p62蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值（P<0.05）。与高浓度实验组比较,抑制剂组细胞中含高亮点状荧光的自噬小泡减少,IOD值下降,LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-AMPKα蛋白表达水平及p-AMPKα/AMPKα比值降低,而P62、p-mTOR蛋白表达水平及p-mTOR/mTOR比值升高（P<0.05）。结论 芹菜素能抑制肺癌A549细胞增殖,诱导其自噬,作用机制可能与AMPK/mTOR通路有关     

环孢素A对百草枯中毒大鼠线粒体自噬导致的肺纤维化作用研究

【摘要】 目的 建立百草枯（PQ）中毒大鼠模型,探讨环孢素A(CsA)对PQ中毒大鼠肺线粒体自噬的作用及机制。方法 成年雄性SD大鼠54只,随机分为正常对照组（n=12）、PQ组（n=24）,CsA大、中、小剂量组（n=18）。PQ组下设1天、3天、7天和14天4个时间点,每个时间点每个剂量组各6只大鼠。使用20%PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃建立大鼠PQ中毒模型,并以自噬发生明显的时间点作为CsA干预时间点。各CsA干预组在给予20%PQ溶液灌胃的前3天开始分别予环孢素5 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)、15 mg/(kg·d)灌胃。通过Masson染色观察PQ中毒后肺组织病理损害,JC 1染色检测肺组织线粒体膜电位变化,Western blot检测调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin的水平变化。结果 与正常对照组相比,随着PQ中毒时间的延长,PQ中毒大鼠肺纤维化病理评分升高,肺组织JC 1红绿荧光比降低,PINK1及Parkin蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P＜001)。与PQ组比较,环孢素A组大鼠肺组织肺纤维化病理评分、PINK1及Parkin蛋白均下降,差异有统计学意义(P＜0.05),JC 1红绿荧光比升高,差异有统计学意义(P＜005)。结论 环孢素A可通过影响PINK1/Parkin蛋白,减轻百草枯中毒引起的线粒体自噬,改善肺纤维化。     

不同月龄APP/PS1双转基因AD小鼠海马神经元线粒体的动态变化

目的:检测不同月龄APP/PS1双转基因阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型小鼠海马神经元中线粒体自噬的动态变化,并探讨其意义.方法:选取20只雄性APP/PS1双转基因AD小鼠为研究对象,分为3月龄组、6月龄组、9月龄组和12月龄组,以C57小鼠为对照组.获取海马组织,通过电镜观察海马区神经元中线粒体的形态变化,用Western blot检测自噬相关蛋白LC3和P62的表达水平;线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin和Miro1的表达水平;线粒体外膜蛋白Tom20的表达水平.结果:电镜观察结果显示:随着月龄增大,APP/PS1双转基因AD小鼠海马区神经元中线粒体损伤的病理变化呈逐渐加重的过程,即线粒体明显水肿、透明,嵴排列不规则,断裂,甚至消失.Western blot结果显示,与野生小鼠组比较,LC3、P62、PINK1和Parkin蛋白表达水平在6月龄组、9月龄组和12月龄组小鼠中明显增高(P＜0.05),而Miro1蛋白却明显降低(P＜0.05),Tom20的表达水平无明显差异(P＞0.05).结论:随着APP/PS1双转基因AD小鼠月龄的增加,其海马区神经元线粒体病理改变呈动态,线粒体自噬呈动态增强但伴随线粒体清除障碍.     

线粒体自噬相关蛋白与脑缺血再灌注损伤的相关性研究进展

急性缺血性脑卒中溶栓后的脑缺血再灌注损伤是目前治疗中等待解决的关键问题。受损线粒体会被自噬系统降解(线粒体自噬)。近年来研究发现,线粒体自噬与脑缺血再灌注损伤关系密切,作为线粒体自噬中最主要的途径,PINK1/Parkin介导线粒体自噬在脑缺血再灌注损伤中发挥了重要作用。本文通过对线粒体自噬相关蛋白PINK1/Parkin与脑缺血再灌注损伤的相关性进行综述,以期提供新的研究思路。     

线粒体动力学改变对APP/PS1小鼠移植黑色素瘤生长的抑制作用

目的：探讨线粒体动力学的变化对APP/PS1转基因小鼠移植黑色素瘤生长的抑制作用及其机制。方法：将C57BL/6J （C57）和APP/PS1雄性小鼠分为C57移植瘤组（n=7）和APP/PS1移植瘤组（n=7）。观察2组小鼠肿瘤出现时间并计算肿瘤体积,绘制移植瘤生长曲线。光学显微镜观察2组小鼠肿瘤组织形态表现,Western blotting法检测2组小鼠肿瘤组织中线粒体融合蛋白2（Mfn2）、动力相关蛋白1（Drp1）、线粒体分裂蛋白1（Fis1）、泛素化及多泛素化蛋白、LC3、PINK1及Parkin蛋白表达水平。结果：C57移植瘤组和APP/PS1移植瘤组小鼠皮肤下均见肿瘤组织,肿瘤细胞内呈现黑色素颗粒。与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠出瘤时间晚,肿瘤组织体积小（P<0.05）。小鼠肿瘤组织中Mfn2表达水平降低（P<0.05）,Fis1和Drp1表达水平升高（P<0.05）,泛素化及多聚泛素化蛋白、LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论：APP/PS1小鼠移植瘤模型肿瘤生长缓慢,其机制可能与PINK1/Parkin通路参与线粒体自噬有关。     

磷酸酶及张力蛋白同源物诱导激酶/帕金森病蛋白介导的线粒体自噬对患者心肌损伤产生影响的研究进展

心肌损伤是缺血缺氧性心血管疾病及感染心肌疾病患者常见并发症,会严重影响患者生活质量和预后,也是目前疾病治疗过程中需要重点关注的并发症之一。线粒体作为心肌细胞代谢的重要能量供应者,其自噬激活在心肌损伤的发生发展中扮演重要角色。第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因诱导激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)介导是线粒体自噬的经典途径之一,也是目前研究最清楚的线粒体自噬途径。PINK1/Parkin介导的线粒体自噬激活程度不同会导致其在心肌损伤发生中的作用不同,适度PINK1/Parkin介导的线粒体对心肌损伤具有保护作用,但过度激活会促进心肌损伤发生,或加重心肌损伤。因此,了解PINK1/Parkin介导的线粒体自噬在心肌损伤中具体调控机制,对心肌损伤防治具有重要临床指导价值。     

miR-155调控线粒体自噬对足细胞损伤的机制研究

目的探讨miR-155对足细胞凋亡的影响,并深入研究其机制。方法 MPC5细胞(经H₂O₂预处理)分为miR-155抑表达组、miR-155过表达组、对照(空质粒)组、空白组。分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot法检测线粒体自噬通路相关因子FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin1、p62及凋亡相关因子Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA或蛋白表达;JC-1探针检测线粒体膜电位;ELISA检测细胞内ROS含量;CCK8、流式细胞术检测细胞活性及凋亡。结果相较于对照组,miR-155抑表达组的FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin1和Bcl-2表达明显升高,细胞活性和线粒体膜电位明显增加(P<0.05),p62、Caspase-3和Bax的表达明显降低,ROS含量和细胞凋亡率显著下降(P<0.05);miR-155过表达组的FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin1、Bcl-2的表达明显下调,细胞活性和线粒体膜电位明显降低(P<0....     

基于P53/AMPK通路车前子醇提物对多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞自噬的作用研究

目的 研究车前子醇提物对多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞自噬的作用,并探讨其可能作用机制。方法 选取动情周期规律SD大鼠125只,取24只灌胃羧甲基纤维素钠(CMC-Na)设为对照组,其余101只灌胃来曲唑混悬液构建PCOS大鼠模型。建模成功的96只大鼠分为模型组(n=24)、3MA组(n=24)、低剂量组(n=24)和高剂量组(n=24)。对照组、模型组灌胃0.9%氯化钠溶液,低、高剂量组按10、20mg/(kg·d)灌胃车前子醇提物,3MA组按10mg/(kg·d)灌胃自噬阻断剂3MA,连续14天。酶联免疫吸附(ELISA)法检测大鼠血清促卵泡生成素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)、雌二醇(E₂)水平;苏木精-伊红(HE)染色法观察卵巢组织病变形态;流式细胞仪检测卵巢颗粒细胞自噬率;蛋白质印迹法(Western blot法)检测微管结合蛋白轻链3(LC3)、抑癌基因p53、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的表达情况。结果 与对照组比较,模型组大鼠血清LH、T和FSH水平均升高,E₂水平下降;卵巢组织病变最明显;颗粒细胞自噬率升高;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p-AMPK蛋白表达增加,p53和p-mTOR蛋白表达降低(P＜0.05)。与模型组比较,3MA组、低剂量组、高剂量组LH、T和FSH水平降低,E₂水平升高,卵巢组织病变减轻,颗粒细胞自噬率降低,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和p-AMPK蛋白表达降低,p53和p-mTOR蛋白表达升高(P＜0.05)。各组与模型组比较的指标变化中,3MA组的指标变化高于低剂量组,低于高剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 车前子醇提物可调节PCOS大鼠内分泌代谢,可能与调控p53/AMPK信号通路,抑制颗粒细胞自噬有关。     

葫芦巴碱通过Pink1/Parkin信号通路介导线粒体自噬对OGD/R诱导的神经元凋亡的影响

目的:探究葫芦巴碱通过PTEN诱导性激酶蛋白1(Pink1)/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路介导线粒体自噬对氧-糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的神经元凋亡的影响。方法:原代培养大鼠海马神经元,经下调Pink1或葫芦巴碱预处理后通过OGD/R诱导神经元损伤,实验分组包括对照组、OGD/R组、葫芦巴碱组、pLKO空载体组(转染pLKO空载体)、pLKO-Pink1组(转染连接Pink1 shRNA干扰质粒的pLKO载体)、葫芦巴碱+pLKO-Pink1组。Annexin V-FITC/PI双染法测定神经元凋亡率;JC-1法测定线粒体膜电位(MMP);Calcein-AM法测定线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放程度;透射电镜观察自噬小体数量;Western Blot检测线粒体自噬相关蛋白(微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、Pink1、Parkin)表达。结果:与对照组相比,OGD/R组神经元凋亡率、MPTP开放程度增加,MMP下降,自噬小体数量及LC3-Ⅱ、Pink1、Parkin蛋白表达增加(P<0.05);与OGD/R组相比,葫芦巴碱组神经元凋亡率、MPTP开放程度减少...     

线粒体自噬在百草枯中毒大鼠模型肺纤维化中的作用研究

目的:建立百草枯(paraquat,PQ)中毒大鼠模型,观察不同阶段肺线粒体膜电位(JC-1染色)、调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin及活性氧(reactive oxygen species,ROS)的变化,探讨线粒体自噬是否参与PQ中毒肺纤维化的发生。方法:成年雄性SD大鼠42只,随机分为正常对照组(n=6)、模型组(n=36),模型组下设2 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d共6个时间点,每个时间点各6只大鼠。使用20%PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃大鼠建立PQ中毒模型。通过流式细胞仪检测血红细胞ROS浓度;HE染色和Masson染色观察PQ中毒后肺组织病理损害;JC-1染色检测肺组织线粒体膜电位变化;Western blot检测PINK1、Parkin蛋白变化。结果:与对照组相比,随着PQ中毒时间的延长,肺纤维化病理评分较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);PQ组ROS荧光阳性强度率比值在中毒后2 h显著升高,中毒后12 h达高峰后逐渐下降(P<0.05),中毒后14 d与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);PQ组肺组织JC-1红绿荧光比均较对照组降低,Western blot提示随中毒时间延长,PINK1及Parkin蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P<0.01)。PQ组肺组织JC-1红绿荧光比与PINK1及Parkin、肺纤维化病理评分均呈负相关(r=-0.890,P<0.01;r=-0.845,P<0.01;r=-0.794,P<0.01)。在PQ中毒12 h内,血红细胞ROS荧光强度阳性率与JC-1红绿荧光比呈负相关(r=-0.712,P<0.01),与PINK1及Parkin、肺纤维化病理评分呈正相关(r=0.571,P<0.01;r=0.484,P<0.01;r=0.602,P<0.05)。结论:PQ中毒导致大鼠产生了明显氧化应激,诱发了线粒体自噬。ROS的产生与线粒体自噬的发生密切相关,共同参与了PQ大鼠肺纤维化的发生发展。     

二甲双胍促进AMPK、TFEB表达改善自噬减轻大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:探究二甲双胍(Met)对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制。方法:建立大鼠脑缺血再灌注模型，随机分为假手术组、缺血再灌注组、Met预处理组[造模前3周腹腔注射Met 100 mg/(kg·d)],TTC染色检测各组大鼠脑梗死体积改变，HE染色观察脑组织病理变化；蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织中Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62等自噬相关蛋白以及AMP活化蛋白激酶(AMPK)、p-AMPK(Thr172)、转录因子EB(TFEB)相关通路蛋白含量。结果:与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠脑组织病理损伤严重，脑梗死体积增高(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠脑梗死体积减少(P<0.01),脑组织病理损伤减轻。与假手术组相比，缺血再灌注组大鼠LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白水平表达减少(P<0.05),p62蛋白表达增多(P<0.001);与缺血再灌注组相比，Met预处理组大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达均增多(P<0.05),p62蛋白表达减少(P<0.01);与假手术组相比，缺血再...