刺五加法尼基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶基因启动子CpG岛的预测与功能验证

目的获得刺五加法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鲨烯合酶(SS)、鲨烯环氧酶(SE)基因启动子的CpG岛分布情况和功能活性。方法针对已克隆的FPS、SS、SE基因启动子序列,使用EMBOSS和Li Lab进行CpG岛预测,同时利用GUS基因作为报告基因,p CAMBIA1301质粒作为表达载体,利用根癌农杆菌转化拟南芥进行功能验证。结果发现刺五加FPS、SS启动子含有2个CpG岛,长度分别是520、218 bp和108、103 bp,SE启动子含有3个CpG岛,长度为290、119、149 bp。FPS、SS、SE基因启动子均具有启动活性,但强度不一,SS启动子活性最强。结论研究首次获得刺五加FPS、SS、SE基因启动子区域的CpG岛分布情况,以及其功能活性,为后续进一步FPS、SS、SE甲基化分析及其在刺五加中的表达调控研究奠定了基础。     

山楂鲨烯合酶CpSQS1,CpSQS2的基因克隆及原核表达分析

为认识山楂三萜成分生物合成途径中鲨烯合酶基因结构特征,克隆获得山楂鲨烯合酶基因并进行生物信息学分析和原核表达分析。通过RT-PCR方法从山楂果实中克隆获得2条鲨烯合酶CpSQS1,CpSQS2的基因,其ORF长度分别为1239,1233 bp,分别编码412,410 aa。使用在线工具预测CpSQS1,CpSQS2均为稳定的酸性蛋白,二级结构主要由α-螺旋结构组成,利用同源建模对三级结构进行预测;结构功能域分析表明,CpSQS1和CpSQS2的35~367 aa都具有反式异戊烯基焦磷酸合酶的保守结构域;跨膜结构域分析预测CpSQS1,CpSQS2均具有2个跨膜结构域;序列分析表明山楂、丹参、甘草SQS基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性;系统进化树分析显示CpSQS1,CpSQS2与蔷薇科的苹果MdSQS1,MdSQS2聚为一支,与系统进化规律一致;构建原核表达载体pGEX-4T-1-CpSQS1,pGEX-4T-1-CpSQS2转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行诱导表达,在65 kDa处均能成功表达出目的蛋白;基因表达分析结果显示,CpSQS2的基因表达水平在山楂的3个不同发育时期均明显高于CpSQS1。该研究首次克隆并分析了山楂SQS1,SQS2基因,为进一步研究山楂三萜生物合成途径奠定基础。     

甘草鲨烯合酶基因及cDNA的克隆与序列分析

目的:对甘草鲨烯合酶(SQS)基因的cDNA及DNA进行克隆及序列分析.方法:根据已报道的光果甘草SQS1基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR的方法,提取甘草根的RNA然后反转录成cDNA,以cDNA为模板,扩增出SQS基因的cDNA序列,以甘草总DNA为模板,扩增SQS的DNA序列.结果:序列分析表明,克隆获得的甘草SQS1的cDNA编码区为1242 bp,编码413个氨基酸残基,命名为GuSQS1,登录号为GQ266154,与卢虹玉等报道的甘草的2个SQS(SQS1和SQS2)的氨基酸序列一致性为98.55%,88.62%,对应DNA序列全长为4484 bp,含有13个外显子,12个内含子,登录号为GQ180932.结论:甘草SQS的cDNA及DNA序列的获得为进一步研究甘草酸生物合成机制提供了基础.     

建泽泻鲨烯合酶原核表达、功能验证及其免疫检测研究

泽泻鲨烯合酶(Ao SS)催化法呢基焦磷酸[(farnesyl diphosphate,FPP)]合成鲨烯,是碳源流向原萜烷型三萜生物合成的关键调节酶。为深入研究Ao SS基因的功能及表达,课题组将前期克隆获得的建泽泻鲨烯合酶基因(accession No.JX866770)的开放阅读框(ORF)构建到原核表达载体p Czn1上,并在大肠杆菌BL21(Roseta)中进行诱导表达,诱导表达出的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经纯化获得高纯度的目的蛋白;以此目的蛋白进行体外酶促反应验证其功能,其结果显示该目的蛋白具有催化法呢基焦磷酸生成鲨烯的活性;为进一步研究其表达规律,在此基础上,利用该蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体并纯化,ELISA检测抗体效价大于1∶51 200,Western blotting检测表明其具有较好的特异性;用制备得到的抗体免疫检测建泽泻Ao SS在不同组织中的表达情况,结果显示建泽泻块茎中Ao SS表达最高,其次为叶,根中表达甚微。原核表达载体的成功构建、基因功能的进一步验证及快速免疫检测方法的建立,为进一步开展Ao SS基因功能及其调控的研究奠定基础,为泽泻资源性成分原萜烷型三萜的合成生物学应用提供科学依据。     

竹节参鲨烯环氧酶基因的克隆及生物信息学分析

目的 克隆竹节参Panax japonicus鲨烯环氧酶基因（squalene epoxidase,PjSE）的全长cDNA序列,进行生物信息学分析和原核表达。方法 设计特异性引物,从竹节参中克隆得到PjSE序列;以PjSE基因序列作为输入数据,利用多序列同源比对等生物信息学分析工具进行序列分析;构建重组原核表达载体pCold-PjSE,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;采用实时荧光定量PCR技术分析该基因在竹节参不同组织中的相对表达量。结果 PjSE基因开放阅读框长度为1884 bp,编码627个氨基酸,PjSE蛋白相对分子质量为68 639.49,初步预测其具有跨膜结构域,可能定位在叶绿体上;聚丙烯凝胶电泳结果显示诱导表达蛋白的相对分子质量大小与预期结果一致;该基因在竹节参叶中表达量最高,须根次之,根中表达量最低。结论 PjSE基因的克隆、生信分析及原核表达研究,不仅有助于丰富竹节参中该类功能蛋白的种类和数量,完善竹节参皂苷类成分的生物合成途径,也为后期开展竹节参皂苷的异源合成提供了可供选择的关键基因元件。     

野三七鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达

目的:对野三七中可能参与三萜皂苷合成的关键酶鲨烯环氧酶基因(Pvf SE)进行克隆,并对其进行生物信息学分析和原核表达。方法:采用Trizol法提取野三七根的总RNA并反转录为c DNA第一链,基于野三七的转录组数据,设计Pvf SE基因序列特异性引物,克隆基因全长,利用相关软件对该基因进行生物信息学分析,构建p Mal-c2X-Pvf SE原核表达载体,在大肠埃希菌中诱导表达重组蛋白。结果:Pvf SE开放阅读框为1 887 bp,编码628个氨基酸,蛋白相对分子质量为68. 8 k Da,理论等电点为9. 28,脂肪系数为95. 18,亲水性系数为-0. 060,不稳定指数为40. 36,属于不稳定蛋白。生物信息学分析表明,Pvf SE具有2个跨膜结构域,无信号肽,可能定位在叶绿体或细胞质膜上,具有FAD/NAD(P)结合域和鲨烯环氧酶结构域,属于混合型蛋白。Pvf SE与西葫芦和芒柄花中参与三萜皂苷合成的鲨烯环化酶(Cp SE1,Cp SE3,Os SE1,Os SE2)亲缘关系较近。此外,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功表达Pvf SE的重组蛋白。结论:克隆得到Pvf SE基因,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步研究Pvf SE的功能和解析野三七中三萜皂苷生物合成途径奠定了基础。     

藏药匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸的含量测定

目的:采用HPLC-PDA法测定藏药匙叶翼首草不同生长年限、不同药用部位中的齐墩果酸及熊果酸含量动态变化。方法:采用YMC-ODS C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-0.1%乙酸铵为流动相(85∶15)等度洗脱,流速为1 m L·min~(-1),检测波长为210 nm,柱温为35℃。结果:齐墩果酸在5~150 mg·L~(-1)线性关系良好(r=0.999 5),平均加样回收率为101.17%;熊果酸在20~600 mg·L~(-1)线性关系良好(r=0.999 5),平均加样回收率为100.69%。匙叶翼首草中齐墩果酸和熊果酸的质量分数分别为0.199~0.946、0.737~6.750 mg·g~(-1)。结论:匙叶翼首草中齐墩果酸及熊果酸的含量在时间与空间格局上均具有统计学差异。     

牛樟芝鲨烯环氧酶基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的克隆牛樟芝三萜合成途径中鲨烯环氧酶基因(AcSE),并进行生物信息学和表达差异分析。方法以牛樟芝菌丝体cDNA为模板,利用快速末端扩增(RACE)进行AcSE序列扩增,利用生物信息学分析AcSE基因的理化性质并预测其蛋白二级结构、三级结构及其功能;同时利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)测定不同培养时间的液体牛樟芝菌丝体及子实体中AcSE基因的表达情况。结果 AcSE的cDNA全长1 446 bp(Gen Bank编号:KT070558),编码481个氨基酸,相对分子质量为53 300,等电点为6.36。结构域分析表明AcSE内含3个跨膜的结构域,无卷曲螺旋结构,且疏水区和亲水区交替存在。AcSE的g DNA全长为1 607 bp,含4个外显子和3个内含子。AcSE在液体培养7 d的牛樟芝菌丝体中表达量最高,为子实体的7.89倍,且随着培养时间的延长逐渐下降。结论首次从牛樟芝中克隆了AcSE基因,为进一步阐明该基因在牛樟芝三萜合成途径中的作用奠定基础。     

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达。 方法: 采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达。 结果: PpSQS基因cDNA全长1 498 bp,包含1个1 212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸;PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI 6.83;SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L^-1 IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。 结论: 首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。     

雷公藤单萜合酶基因TwMS的克隆及蛋白表达分析

该研究克隆得到1条雷公藤单萜合酶基因TwMS。其完整开放阅读框为1797bp,编码579个氨基酸,相对分子质量为69.75kDa、理论等电点为5.37。生物信息学分析表明,TwMS具有单萜合酶的特征结构域,属于萜类合酶TPSb亚家族。实时荧光定量PCR检测显示,经茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,TwMS的相对表达量显著上调,并在24 h达到最高。此外,该研究在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达TwMS蛋白,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

白花丹参鲨烯合酶SQS2的克隆与原核表达分析

该研究根据丹参的转录组数据提供的基因片段设计引物,采用逆转录聚合酶链式反应方法,从白花丹参中克隆鲨烯合酶SQS2的全长cDNA序列,命名为SmSQS2,GenBank注册号KM244731.序列长度为1 597 bp,包含1 245 bp的开放阅读框,推测编码414个氨基酸,含有115 bp的5'UTR和237 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出白花丹参SQS2的与紫花丹参SQS2的序列无明显差异.原核表达分析结果表明SmSQS2在大肠杆菌中能表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的吸光度(A600)进行了优化,得出SmSQS2蛋白表达的最佳条件为:IPTG终浓度0.2 mmol· L-1,宿主菌的吸光度(A600)为0.6,温度30℃,诱导时间20 h.这为进一步研究白花丹参鲨烯合酶SQS2在丹参萜类和甾醇类生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

洋常春藤鲨烯合成酶基因HhSS的克隆与表达分析

目的克隆获得洋常春藤Hedera helix鲨烯合成酶基因(HhSS)cDNA全长序列并进行生物信息学分析及表达分析。方法根据洋常春藤转录组数据信息设计引物,通过RACE克隆方法获得HhSS基因序列;采用DNAMAN、PROTPARAM、TMHMM、PSORT、Scan Prosite、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学工具分析序列信息及编码蛋白的理化特性、结构域等特征;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行HhSS基因的检测分析。结果 RACE克隆获得HhSS(Gen Bank登录号KX056078)基因cDNA序列全长1 889 bp,包含一个从248~1 477 bp的完整开放阅读框(ORF)以及247 bp的5’非编码区(5’UTR)和412 bp的3’非编码区(3’UTR)。该基因编码409个氨基酸,相对分子质量为46 800,等电点为5.68。HhSS蛋白具有植物SS蛋白的特征结构域和跨膜区,与刺五加、人参等同科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明洋常春藤叶片中HhSS基因的相对表达量与常春藤皂苷含量存在正相关性。结论洋常春藤HhSS基因的成功克隆及表达分析研究,为阐明HhSS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用及代谢调控研究提供理论依据和技术基础。     

Anti-inflammatory and analgesic effects of ethanol and aqueous extracts of Pterocephalus hookeri (C.B. Clarke) Höeck

Aim of the study

This study evaluates the anti-inflammatory and analgesic activities of the ethanol and aqueous extracts of a Tibetan herb Pterocephalus hookeri (C.B. Clarke) Höeck to provide experimental evidence for its traditional use such as cold, flu and rheumatoid arthritis.

Materials and methods

Investigations on the analgesic effects of P. hookeri (C.B. Clarke) Höeck were carried out, including hot-plate test and acetic acid-induced writhing. The anti-inflammatory activities were observed by utilizing the following models: carrageenin-induced edema of the hind paw of rats, cotton pellet-induced granuloma formation in rats, acetic acid-induced permeability, and xylene-induced ear edema in mice. The effects of the administration of indomethacin were also studied.

Results

It has been shown that the ethanol and aqueous extracts significantly increased the hot-plate pain threshold and reduced acetic acid-induced writhing response in mice. The ethanol and aqueous extracts remarkably inhibited the increase in vascular permeability induced by acetic acid and ear edema induced by xylene. The ethanol extract also significantly decreased the carrageenin-induced rat paw edema perimeter and inhibited the increase of granuloma weight.

Conclusion

The results show that the ethanol and aqueous extracts have both central and peripheral analgesic activities and as anti-inflammatory effects, supporting the traditional application of this herb in treating various diseases associated with inflammation and pain.     

2个丹参鲨烯合酶基因的克隆和鉴定

目的 克隆与鉴定丹参Salvia miltiorrhiza鲨烯合酶基因。方法 基于丹参基因组的基因预测结果设计引物,通过RT-PCR方法,克隆丹参鲨烯合酶基因。利用生物信息软件对基因序列进行了结构分析,对基因编码多肽进行了序列同源性比较和保守结构域分析,利用实时定量RT-PCR方法对基因进行表达模式研究。结果 通过RT-PCR方法扩增得到2个丹参鲨烯合酶基因（SmSQS1和SmSQS2）,它们编码的多肽具有鲨烯合酶相关结构域和保守基序。这2个基因具有不同的外显子/内含子结构特征,具有不同的组织特异性表达模式和时间表达模式。结论 丹参基因组中存在2个鲨烯合酶基因,它们具有不同的基因结构特征和表达模式,可能在丹参甾体类和三萜类化合物生物合成中起不同作用。     

布渣叶查耳酮合酶基因全长cDNA克隆及其表达模式分析

目的克隆布渣叶查耳酮合酶基因(Mp CHS)全长c DNA,并对其在不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式进行分析。方法以布渣叶叶片总RNA逆转录合成c DNA为模板,根据其转录组数据设计特异引物序列,PCR扩增Mp CHS基因全长c DNA,经质粒连接、转化、扩培,挑选阳性克隆测序、分析并构建原核表达载体。同时,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对Mp CHS基因的表达模式进行分析。结果成功克隆得到Mp CHS基因全长c DNA(Gen Bank:KY472608)。生物信息学分析表明其开放阅读框为1 176 bp,编码含391个氨基酸的蛋白,其相对分子质量为42 700,理论等电点6.11,具有CHS家族蛋白3个保守的功能活性位点(165 C、304 H和337 N)和特征多肽标签序列RLMMYQQGCFAGGTVLR和GVLFGFGPGL。系统进化树分析发现Mp CHS与可可、陆地棉等木本植物的亲缘关系比较近。RT-q PCR结果表明,Mp CHS基因在不同部位均有表达,在叶片中的表达量随着生长过程逐步降低。结论首次克隆得到Mp CHS基因,并分析了Mp CHS基因在布渣叶不同部位和不同生长阶段叶片中的表达模式,为Mp CHS基因的原核表达和功能验证奠定了基础,也为进一步解析布渣叶黄酮类生物合成途径提供了参考。     

红花栝楼鲨烯合酶基因的克隆及其序列分析

目的克隆红花栝楼鲨烯合酶(squalene synthase,SS)的基因并进行序列分析,为进一步研究葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析奠定基础。方法根据绞股蓝与罗汉果SS基因c DNA比对分析的结果,设计SS的5’端简并引物,采用3’RACE扩增红花栝楼SS全长c DNA基因。结果获得红花栝楼SS c DNA全长共1 466个核苷酸,其中包括一个含有1 254个核苷酸的开放读码框,编码417个氨基酸残基。通过NCBI的Blast比对,发现红花栝楼SS基因编码的氨基酸序列与已知植物SS基因编码的氨基酸序列同源性为78%~94%,核苷酸的同源性为74%~93%。结论成功克隆了红花栝楼SS的全长c DNA,为进一步研究红花栝楼SS基因结构、基因表达、基因突变提供了基础,并为葫芦科植物三萜合成通路关键酶SS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

丹参转录因子SmbHLH93的克隆及表达模式分析

目的 克隆丹参碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)类转录因子SmbHLH93,并初步探究该基因的功能.方法 采用PCR和RT-PCR技术分别从DNA和cDNA水平克隆得到了SmbHLH93基因,进一步通过BD Walking获得了该基因的5'启动子区.生物信息学分析SmbHLH93蛋白的理化性质、结构特点和系统进化关系.结合启动子区分析软件和qPCR,研究SmbHLH93在丹参不同部位和环境诱导下的表达模式.结果 获得SmbHLH93基因序列954 bp和5'启动子区1 583 bp,其中开放阅读框(ORF)657 bp,有3个内含子和4个外显子,编码218个氨基酸,含有bHLH和ACT_UUR-ACR-like结构域,无跨膜区域,可能定位于细胞核.表达模式分析结果显示该基因的表达量在根中最高,茎中最低,且随着花的形成逐渐降低.光和低温诱导SmbHLH93的高表达,而水杨酸(SA)抑制其表达.结论 克隆得到丹参bHLH类转录因子新成员SmbHLH93,初步预测其参与了丹参花的发育过程和丹参次生代谢途径的调控.     

雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS克隆与表达分析

根据雷公藤悬浮细胞转录组数据设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术克隆雷公藤牻牛儿基焦磷酸合酶基因TwGPPS1,TwGPPS2全长cDNA,并进行生物信息学分析和蛋白表达研究。首次克隆得到TwGPPS1核苷酸的完整开放阅读框长度为1 278 bp,编码425个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.68,相对分子质量为47.189 kDa;TwGPPS2核苷酸的完整开放阅读框长度为1 269 bp,编码422个氨基酸蛋白,预测蛋白等电点为6.71,相对分子质量为46.774 kDa;进一步构建了原核重组表达载体pET-32a-TwGPPS1,pET-32a-TwGPPS2,并成功诱导出TwGPPS1,TwGPPS2重组蛋白,为深入研究此关键酶基因功能和雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。     

卷叶贝母环阿屯醇合成酶基因的克隆及表达分析

目的对卷叶贝母Fritillaria cirrhosa中参与生物碱合成的关键酶环阿屯醇合成酶(cycloartenol synthase,CAS)基因进行克隆,并对其进行生物信息学和表达分析。方法基于转录组测序结果,通过PCR技术克隆卷叶贝母CAS基因(FcCAS)开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,并基于在线工具对cDNA序列进行生物信息学分析。通过荧光定量(q RT-PCR)手段检测FcCAS在野生鳞茎与愈伤组织(通过激素组合刺激获得的组织培养物)中的表达情况并测定总生物碱的含量。结果 FcCAS编码区ORF长为2 271 bp,编码756个氨基酸,并与NCBI上公布的天门冬、芭蕉、油棕等植物CAS蛋白的相似性达80%以上;qRT-PCR与总生物碱含量测定实验表明FcCAS的表达水平与总生物碱含量的变化趋势一致,都是愈伤组织高于野生鳞茎。结论 FcCAS在不同组织状态下表达量差异较大,FcCAS是一个有生物学功能的蛋白质,受激素组合诱导表达,为进一步研究CAS对卷叶贝母生物碱含量的影响和表达调控奠定基础。