小鼠体细胞核移植技术的初步研究

目的 :建立细胞核移植技术 ,为“治疗性克隆”的实验研究和临床应用作准备。方法 :以C5 7鼠的卵丘细胞为核供体细胞 ,去核卵母细胞为核受体进行胚胎的重构。用改良的WAKAYAMA方法 ,分别进行卵丘细胞的分离、分裂中期卵母细胞的去核、供体细胞核的注射、重构胚的电融合以及卵母细胞的活化等研究。结果 :去核卵母细胞的成活率 3 8.4%。成活的小鼠胚胎发育进入二细胞期。盲吸法比半卵法和功能性吸核的效果好。电融合法能够使移植核融入卵母细胞内。结论 :小鼠体细胞核移植技术基本获得成功     

不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响

目的:研究不同核移植方法对小鼠体细胞核移植效率的影响,建立一种简单有效的核移植方法.方法:以小鼠卵丘细胞作为体细胞核移植的供核细胞,采用4种去核方法(盲吸法、蔗糖辅助去核法、化学去核法、荧光染色去核法)研究卵母细胞去核率的差异,并比较胞质内注射法和反向核移植法应用于小鼠体细胞核移植的效果.结果:荧光染色法的去核率(88%)显著高于其他试验组(P<0.05),但囊胚率和囊胚细胞数与蔗糖辅助去核法无明显差异(P>0.05);胞质内注射法构建重构胚的效率与反向核移植法相似(P>0.05),但胞质内注射法的囊胚率和囊胚细胞数较反向核移植高(P<0.05).结论:荧光染色去核法和胞质内注射法构建体细胞核移植胚胎效率较高,可维持胚胎早期发育.     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

【目的】观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育。【方法】昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞。成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入，观察其受精和胚胎发育情况。【结果】卵子去核存活率为75．9％(362／477)，注核存活率为39．8％(143／359)，D1存活率为38．4％(138／359)。39．9％(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核，其卵裂率为80．7％(46／57)。大部分重构胚发育到2-3细胞停滞，其中2个分裂至4细胞，无囊胚形成。【结论】将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中，可以诱导极体排出，形成2原核 1极体的重构胚胎。重构胚胎大部分发育到2-3细胞即发生停滞，最多到达4细胞期，发育潜能差。     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

小鼠电激活孤雌胚胎早期体内外发育能力的比较

目的 探讨小鼠电激活孤雌胚胎的早期体内、外发育能力.方法 利用不同电脉冲参数和激活液对小鼠卵母细胞进行活化,观察激活后的小鼠孤雌胚体外发育状况和移植后的发育能力.结果 非电解质激活液优于电解质液,脉冲强度、脉冲宽度和脉冲次数3个参数各自处于某一范围内时,他们之间存在某种相关性,降低其中1个参数可通过升高另外2个参数得到补偿,经筛选较适宜的电脉冲参数为:1.0 kV/cm、40μs、2p,或者1.5kV/cm、30/μs、2p,分别为74.65％和71.19％,体外囊胚发育率分别为43.40％和47.62％.电激活孤雌胚体外发育时序比正常胚胎慢,但囊胚细胞数与对照组差异不显著.它们经胚胎移植后,其中的一部分能够着床,但着床率仅为3.6％,极显著低于对照组(67％,P＜0.01).结论 电刺激能够较好地模拟正常受精过程激活小鼠卵母细胞,但激活后的多数小鼠孤雌胚胎着床能力较低,不能够顺利着床.     

表达人前列腺干细胞抗原小鼠前列腺癌模型的建立

目的提高小鼠体细胞核移植过程中融合效率。方法使用CRY-3型和CE-450型细胞融合仪对B6D2F1小鼠去核卵母细胞与该品系小鼠胎儿成纤维细胞构成的重构胚进行融合,通过PEG／DMSO对供核细胞的预处理,比较了不同融合液,不同电极形状融合槽和供核细胞代次对融合率的影响。结果（1）以PEG／DMSO对供核细胞预处理5min的融合率显著高于同条件下未处理组（51．11％vs25．64％）（P〈0．05）;（2）融合液中含0．1g／L聚乙烯醇（PVA）组的融合率高于无PVA组;重构胚在甘露醇浓度为0．32mol／L融合液中的融合率（48．21％）高于其他甘露醇浓度组（27．78％,41．67％和30．11％）;（3）使用针状电极融合槽时的融合率（42．31％,43．13％）高于同条件下平行丝状电极融合槽组（30．43％,33．33％）,其中又以在2000V／cm,20μs,2个脉冲时,交流电预处理30S组最高（43．13％）;（4）供核细胞传代一次后融合率随着传代次数的增加而下降。结论通过PEG／DMSO对供核细胞进行预处理,并在融合液中添加PVA时,结合优化的融合条件可以提高小鼠体细胞核移植过程中融合率。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后,将直径为10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活。体外培养72h,对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s;Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核;去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响，寻找最佳电融合参数。方法 将直径10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核一卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者问的融合，并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4～8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动，变动范围分别是电场强度1000-2000kV／cm和脉冲时程40～160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核一卵母细胞复合体的融合率．而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内，供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异，并且融合后重组胚的激活，以及发育至2细胞、4～8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外，脉冲重复次数以1～2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找最佳电融合参数。方法 将直径10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4~8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1000~2000kV/cm和脉冲时程40~160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4~8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外,脉冲重复次数以1~2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。