噬菌体随机12肽库筛选肝癌患者血清肿瘤标记物的初步研究

目的:从噬菌体随机多肽文库中,筛选出能与肝癌患者血清特异性结合的短肽分子.方法:采用肝癌患者血清作为配基,筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表达的随机12肽文库.按吸附一洗脱一扩增的淘筛过程,经3轮淘筛后,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,评价分析其诊断肝癌的价值.结果:经3轮淘筛后,特异性结合的噬菌体富集增加近100倍.用.ELISA检测第3轮筛选后随机挑取的单个噬菌体克隆,其中特异性最好的3个克隆具有诊断肝癌的潜在价值.结论:噬菌体展示肽库技术,可以有效进行肝癌相关抗原肽的筛选研究,为获得特异性诊断试剂进而为肝癌的诊断提供依据.     

噬菌体肽库在宫颈癌血清肿瘤标志物筛选中的应用

目的:用噬菌体随机12肽库对宫颈癌患者血清进行差异性筛选,筛选出能与宫颈癌患者血清特异性结合的肿瘤标志物。方法:应用噬菌体随机12肽库对宫颈癌患者和正常人血清进行三轮差异性筛选,用ELISA法检测噬菌体克隆对宫颈癌患者血清结合的特异性。结果:经过三轮筛选,噬菌体富集率逐轮提高,提高近100倍。用ELISA法对50例宫颈癌患者血清和50例健康者血清检测验证,其中获得一株与宫颈癌患者血清特异结合较好的噬菌体,对宫颈癌的早期诊断具有潜在价值。结论:筛选出能与早期宫颈癌患者血清高亲和力特异结合的短肽,为研究宫颈癌肿瘤标志物及宫颈癌的早期诊断奠定了基础。     

应用噬菌体随机肽库筛选肿瘤MUC1/Y黏蛋白结合肽

目的：探索用噬菌体随机肽库筛选可用于肿瘤导向治疗的新型小分子载体。方法：以MUC1/Y黏蛋白的胞外段蛋白（MUC1/Yex）为靶分子,用凝胶亲和法和酶联板法分别筛选十二肽噬菌体随机肽库,ELISA鉴定阳性克隆,DNA序列测定后确定MUC1/Yex结合肽的氢基酸序列;免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆及正常及肿瘤细胞的结合能力及特异 性。结果：通过4轮筛选,共获得3种MUC1/Yex的结合肽,分别为HHWHSRSQLSWF,HLKHKNYLPPTP和GNWYRHPHYLQP,其中HXXHS表位可能在与MU1/Yex的结合中起重要作用。阳性噬菌体克隆可与肿瘤细胞系MCF7,OVCA3,而不与正常外周血淋巴细胞结合。结论：筛选获得的MUC1/Yex结合肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,可进一步用于肿瘤导向治疗的研究。     

噬菌体随机肽库中与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性靶向结合短肽的筛选

背景与目的：神经胶质瘤的常规治疗尚难取得令人满意的效果，寻找高效和高特异性杀伤肿瘤细胞的药物已成为提高其治愈率的研究热点。本研究旨在利用噬菌体随机肽库找到与神经胶质瘤细胞系SWO-38特异性结合并内化人细胞的短肽序列。方法：利用噬菌体随机12肽库对肿瘤细胞进行5轮全细胞筛选，分析筛选后单克隆对神经胶质瘤细胞的特异性结合能力并进行免疫荧光分析。提取单克隆DNA，测序，得出短肽序列进行比对分析。结果：通过5轮筛选后的噬菌体库及所挑选的表面及内化部分各13个单克隆均显示对胶质瘤细胞有较高的特异性结合，并测序得到三条重复性高的多肽序列。免疫荧光分析显示噬菌体大量聚集在细胞表面并能够内化进入到细胞内。结论：通过噬菌体随机肽库对肿瘤细胞进行全细胞筛选得到的噬菌体多肽能高特异性与胶质瘤瘤细胞SWO-38结合，可作为肿瘤导向药物研究的载体。     

利用体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性结合肽

目的 筛选人源肝癌组织特异性结合短肽。方法 体外培养人源肝癌细胞株BEL-7402,建立荷瘤裸鼠模型。尾静脉注射噬菌体12肽文库至荷瘤裸鼠体内,循环20min后回收肿瘤组织中噬菌体,同时取正常对照组织进行噬菌体效价测定和免疫绀化观察。将同收的噬菌体扩增、纯化,并以此作为起始物进行下一轮筛选。经过3轮体内筛选,得到与肝癌组织或细胞特异结合的肽段。随机挑选噬菌体单克隆进行测序,分析序列㈣源性后进行体外细胞酶联免嫂吸附试验（ELISA）和体内回输实验,验证噬菌体克隆的导向性。结果 经过3轮体内筛选,瘤组织中噬菌体的回收率逐步提高,回收量随着输入量的增加迅速增加,而每轮筛选肝组织中的噬菌体回收晕始终保持在一个恒定范围,并不随输入量的增加而增加。免疫组化结果硅示,第3轮筛选后,瘤组织中的噬菌体得到高水平富集,同时其他组织的非特异性结合降至最低,肝癌细胞特异性结合最强的是A54号单克降,A67、B2号单克隆次之。B2的导向效果最好,A54次之。通过对噬菌体单克隆的序列分析,初步确定了PSS／FTT基序。结论 利用体内噬菌体展示技术,可以成功筛选到与肝癌细胞或组织特异结合的噬菌体肽。     

肾癌T7噬菌体展示肽库构建的实验研究

目的:构建肾细胞癌T7噬菌体展示肽库,为下一步筛选肾癌早期诊断分子标志群打下基础.方法:用传统Trizol方法分别抽取31例涵盖各种组织类型肾癌组织标本的总RNA,确定完整性后再根据OD值等量混合总RNA,用试剂盒完成mRNA的分离并电泳检测其质量,经反转录、末端平齐、片段长短筛选、加接头、双酶切、去除多余接头和<300 bp的cDNA片段等步骤,再与T7Select10-3b载体连接、体外包装并扩增得到肾癌T7噬菌体展示cDNA文库.通过铺平板测定和PCR技术鉴定所建文库质量.结果:建成原始文库的库容量为5.0×107 pfu/mL,扩增后文库滴度为3.5×1012 pfu/mL,重组率为95%,插入片段为300～2 000 bp.结论:成功用T7噬菌体构建了高质量的肾癌cDNA文库,为筛选可用于临床早期诊断的肾癌特异标志奠定基础.     

噬菌体展示技术与肿瘤

随着噬菌体展示技术应用范围的不断扩大和研究的不断深入,它在肿瘤的研究中也发挥了越来越大的作用.构建噬菌体抗体能为肿瘤免疫诊断和免疫治疗提供理想载体分子;通过此技术体外和体内筛选可发现肿瘤组织特有的分子标识物,从而为肿瘤的靶向治疗打下良好的基础.     

随机十二肽噬菌体展示文库筛选血型B抗原模拟多肽的实验研究

目的:筛选出替代血型B抗原的模拟多肽,用多肽抗原替代糖类抗原.方法:抗血型B抗原的单克隆抗体作为固相筛选靶分子,对随机十二肽噬菌体展示文库进行生物淘选(bio-panning),经包被-结合-洗脱-扩增等循环3轮,对筛选的克隆ELISA鉴定,并通过剂量依赖实验验证其结合特异性.最后提取DNA测序,确定模拟肽氨基酸序列.结果:3轮筛选结束,得到2个亲和力较强的十二肽序列TKNMLSL-PVGPG和HSLKHTQMSYSS.结论:经过生物筛选得到模拟多肽序列,利用噬菌体展示技术筛选糖类抗原的模拟肽具有可行性,为糖类抗原的研究提供一种新思路.     

抗内毒素噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建一个鼠源性的抗内毒素单链噬菌体抗体库,从中筛选出对内毒素具有较高亲和力的单链抗体。方法从小鼠脾细胞中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因（VH,VL）,用Linker将VH,VL交联形成单链抗体可变区片段（ScFv）。经NotⅠ,SfiⅠ双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E载体相连,转化入大肠杆菌TG1以构建鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库。在援救噬菌体抗体库后,用内毒素淘筛特异性的ScFv,富集的噬菌体阳性克隆重新感染TG1。在96孔板分别援救单个含特异性ScFv的TG1菌落,最后随机挑选出190个菌落经ELISA检测抗内毒素ScFv。结果小鼠血清中抗内毒素的效价为1∶12800。提取的总RNA浓度为12.3813μg/ml,纯度较好。扩增出的VH长约340bp,VL约320bp,ScFv约800bp。转化入TG1后有约1.9×107个菌落。淘筛一轮过后即有3×104阳性菌落长出,190个菌落经ELISA检测有2个阳性克隆。结论成功地构建了一个库容量为1.9×107的鼠抗内毒素单链噬菌体抗体库,并从中筛选出了2株抗内毒素ScFv。     

体内噬菌体展示技术筛选人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽及其性质、结合效果研究

目的探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果,为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型,采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序,选取重复率高的序列合成多肽,制备光学分子探针,应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示,随筛选轮次增加,肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加;肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织(肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏),肿瘤组织切片扫描图像的吸光度(A)值均较正常组织高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。ELISA结果显示,随机选取的50个单克隆噬菌体中,22个为阳性(亲合力≥2)。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后,得到4条有重复的氨基酸序列,选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC,化学合成异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示,FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。结论利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC,有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。     

Screening peptides binding specifically to colorectal cancer cells from a phage random peptide library

The aim of this study was to screen for polypeptides binding specifically to LoVo human colorectal cancer cells using a phage-displayed peptide library as a targeting vector for colorectal cancer therapy. Human normal colorectal mucous epithelial cells were applied as absorber cells for subtraction biopanning with a c7c phage display peptide library. Positive phage clones were identified by enzyme-linked immunosorbent assay and immunofluorescence detection; amino acid sequences were deduced by DNA sequencing. After 3 rounds of screening, 5 of 20 phage clones screened positive, showing specific binding to LoVo cells and a conserved RPM motif. Specific peptides against colorectal cancer cells could be obtained from a phage display peptide library and may be used as potential vectors for targeting therapy for colorectal cancer.     

A LIVER-TUMOR ADHESION PEPTIDE FROM RANDOM PHAGE DISPLAY LIBRARY

Objective： To identify and localize the synthesized targeting peptide A54 to liver cancer cell line BEL-7402 in vivo and in vitro for confirming the potential clinical application of peptide A54 in hepatocarcinoma targeting therapy. Methods： Phage A54 was confirmed by ELISA. Biotin and FAM labeled A54 peptides were identified and localized by means of jmmunohistochemistry and immunocytochemistry. Results： A54 peptide could target the liver-rumor tissue in vivo and adhere to several liver-rumor cells in vitro. FAM-labeled A54 peptides were localized on the membrane surface of liver-rumor cells. Conclusion： Synthesized A54 peptide obtained from in vivo phage display technology still kept special abilityto adhere liver-rumor cell in vivo and in vitro. The A54 peptide could be a candidate carrier for hepatocarcinoma targeting therapy.     

用不同方法从大容量噬菌体抗体库中筛选抗完整食管癌细胞的单链抗体

目的:初步探索从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选肿瘤细胞抗体的技术策略.方法:通过两种方法,即2%多聚甲醛固定细胞筛选法(PF)及活细胞直接筛选法(NF),经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛过程,对食管癌KYSE-170细胞进行筛选,得到抗食管癌细胞的噬菌体抗体,完善了噬菌体抗体库筛选完整细胞的特异性抗体的技术策略.并且进一步制备了其可溶性抗体.结果:活细胞NF组的筛选阳性率高于2%多聚甲醛固定PF组,筛选特异性抗体的阳性率分别为25.00%和12.50%,两组的差异具有统计学意义.结论:利用单链大容量抗体库可以采用不同的筛选方法成功制备与肿瘤细胞结合的噬菌体抗体,为今后的研究和应用奠定基础.     

全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建

目的：利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法：从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞（PBMC）,提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链（VH）和轻链（VL）基因,经重叠延伸PCR（SOE-PCR）,在体外将两者连接成单链抗体（scFv）基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果：得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论：本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。     

全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库的构建

目的:利用噬菌体展示技术构建全人源性抗乳腺癌单链抗体库。方法:从临床获取未化疗乳腺癌病人外周血样30份,分离出单个核细胞(PBMC),提取总RNA,用RT-PCR技术逆转录获得cDNA,并扩增出全套人抗体重链(VH)和轻链(VL)基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR),在体外将两者连接成单链抗体(scFv)基因片段,将该片段用Sfi I和Not I酶切后克隆至pCantab5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,收集培养后平板上的菌落,即构建初级噬菌体单链抗体库。结果:得到长度约为360bp和340bp的VH和VL,拼接后得到的scFv长度约为750bp;经PCR初步鉴定插入率约为80%,BstN 1多样性酶切检验,酶切图谱呈多样性。经测序验证,最终获得库容约为2.4×106pfu/ml初级单链抗体库。结论:本研究获得了全人源抗乳腺癌噬菌体单链抗体库,为下一步筛选抗人乳腺癌细胞特异性单链抗体奠定了基础。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体的筛选及特异性鉴定

目的对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性及特异性进行鉴定。方法PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率。先以人成纤维细胞吸附后再以体外培养的肝癌细胞SMMC7721为抗原对所建抗体库进行3轮“吸附洗脱扩增”的亲和筛选。将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法及FCM鉴定其与人肝癌细胞及正常细胞的结合活性。结果ScFv基因插入率为70%。在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍。筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定,均可检测到目的基因。ELISA分析结果显示18个克隆与SMMC7721呈阳性反应,阳性率为90%,15个克隆与成纤维细胞有交叉反应。得到3株肝癌单链抗体。ScFv的FCM鉴定表明,以正常胎肝细胞L02为对照,ScFv与肝癌结合比率为41.3%。特异性鉴定表明,其与肝癌细胞结合活性明显高于正常细胞。结论利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性。     

Analysis of BAC<Subscript>5</Subscript> mcAb-related epitope using random peptide library

Objective To identify epitope relating to BAC₅ mcAb, a kind of monoclonal antibody (mcAb) located on the surface of nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells. Methods Using BAC₅ mcAb as a selected target, the 3 rounds of biopanning to a 12 mer random peptide library (RPL) presented by M13 phages were carried out. The positive M13 phage clones were chosen and confirmed with sandwich ELISA for antibody capture and competitive assay. The exogenous DNA fragments in the positive/negative M13 phages were sequenced to deduce and compare the order of the amino acids of exogenous peptides among the phage clones. Results 77% (35/45) of the phages eluted from the 3rd round of biopnning could be captured by BAC₅ mcAb. The 3 kinds of the peptides were displayed by M13 phages from the 8 positive clones identified with competitive assay. The same character of “-P-V-” structure existed near N-terminus of the 3 different peptides, i. e.-H-Q-S-H-Y-P-Y-P-V-V-S-L- (4/8)-Q-N-Q-A-W-F-S-Q-P-V-R-M-(3/8) and T-Q-A-Y-K-G-F-P-V-L-P-S- (1/8) in comparison with the peptide “-N-H-Q-S-T-F-W-Q-K-W-T-A-” displayed by M13 phages from the negative clones (6/6). Conclusion BAC₅ mcAb can recognize the 3 kinds of the peptides with-P-V-structure near N-terminus. These peptides mimic the structure of the epitope on the surface of NPC cells recognized by BAC₅ mcAb. This project was founded by Health Foundation of Guangdong Province (Grant No. A1999212)     

从随机肽库中筛选血管内皮生长因子的抑制剂

目的：从随机噬菌体肽库中筛选血管内皮生长因子（VEGF165）的抑制剂,研究治疗实体瘤生长的小分子药物。方法：以VEGF165分子的受体KDR为靶分子,筛选随机噬菌体环7肽库,通过竞争性洗脱得到能特异结合KDR的阳性噬菌体,以ELISA、细胞免疫组化、细胞ELISA、鸡胚绒毛膜尿囊膜实验和MTT法,鉴定其结合活性和抑制活性。结果：得到5个能特异结合靶分子的阳性噬菌体克隆,它们均可以与表面有KDR表达的细胞结合,其中噬菌体克隆3和13还能抑制VEGF165诱导鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的活性。但MTT法结果显示,这两种噬菌体小肽对高表达KDR的阳性细胞生长没有明显的抑制活性。结论：从随机噬菌体肽库筛选到了能抑制VEGF165生物活性的克隆,为进一步研究小分子抑瘤药物提供了一定基础。     

噬菌体多肽peptide 20抗胃癌细胞肝转移作用的实验研究

目的:探讨噬菌体多肽peptide 20对胃癌肝高转移潜能细胞XGC9811-L肝转移能力的影响。方法:细胞体外生长实验观察噬菌体多肽peptide 20是否可影响胃癌肝高转移潜能细胞XGC9811-L的生长能力;侵袭、运动实验检测peptide 20对XGC9811-L细胞的侵袭和运动能力的影响;体外黏附试验检测peptide 20是否可抑制XGC9811-L对不同细胞外基质的黏附能力。结果:噬菌体多肽peptide 20对细胞的生长无影响,但可减弱XGC9811-L的侵袭、运动、及对collagen Ⅳ的黏附能力。结论:噬菌体多肽peptide 20可抑制胃癌肝高转移潜能细胞的侵袭、运动和对collagen Ⅳ的黏附能力。