变异链球菌、表兄链球菌复合防龋DNA疫苗的研制

目的 构建包含变异链球菌和表兄链球菌两种致龋菌的主要抗原片段的复合防龋DNA疫苗,以期增强DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.方法 PCR获得表兄链球菌OMZ176GTF-1的CAT区,克隆至靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中,构建编码变异链球菌PAc、GLU基因序列和表兄链球菌CAT基因序列的复合防龋DNA疫苗pGJGAC/VAX,转染CHO细胞系检测其表达.重组质粒及对照质粒分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平.重组质粒及对照质粒经鼻腔滴注免疫分别定植了变异链球菌和表兄链球菌的Wistar大鼠,龋齿记分评价防龋疫苗的龋齿保护效能.结果重组质粒pGJGAC/VAX构建成功.免疫小鼠后实验组小鼠血清和唾液抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体水平均显著高于空载体对照组(P<0.01).血清特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为62.13μg/ml和11.43 μg/ml;唾液特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为0.67%和0.80%.大鼠龋齿保护实验结果显示在变异链球菌和表兄链球菌定菌鼠中实验组釉质龋(E),牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于pVAX1免疫组(P<0.05),实验组Ds和Dm均低于pGJA-P/VAX免疫组,但两组间E差异没有统计学意义(P>0.05).结论 复合防龋DNA疫苗构建成功,可在真核细胞中正确表达,动物实验证实能有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,并增强了DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.     

变形链球菌基因疫苗pcDNA3-gtfB鼻黏膜免疫家兔的实验研究

目的 观察变形链球菌防龋基因疫苗pcDNA3-gtfB经鼻腔黏膜免疫日本长耳大白兔后的免疫反应性,初步观察不同剂量质粒pcDNA3-gtfB免疫机体后的抗体效价.方法 实验分两部分,第一部分:30只日本长耳大白兔平均分为5组,每组6只,分别为:200 μg、400 μg 、600 μg pcDNA3-gtfB质粒组,400 μg pcDNA3组,灭活全菌疫苗阳性对照组.质粒组及全菌组以1:1比例添加弗氏佐剂后进行免疫,共免疫两次.第二部分:采用间接ELISA法检测血液、唾液中特异性IgG、S-IgA.结果 ①血液、唾液中抗体高峰时间为初始免疫后8~10周左右;②自免疫后1~2周,各质粒组兔血液、唾液中特异性抗GTF的IgG、S-IgA抗体水平同阴性对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05);③200 μg组与400 μg及600 μg组比较多时点差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ①基因疫苗pcDNA3-gtfB具有免疫反应性;②200 μg 、400 μg、600 μg的基因疫苗对于体重1.5 kg左右的兔都是有效的免疫剂量;③在本研究的条件下,400 μg、600 μg疫苗组效价优于200 μg组.     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

转基因番茄可食防龋疫苗免疫大鼠的实验研究?

目的用表达变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合蛋白的转基因番茄免疫SD大鼠,检测其免疫原性,探索研制安全、有效的可食用防龋疫苗的可能性。方法选择雌性 SD 大鼠18只,建立龋齿模型,随机分成3组(n=6),分别为转基因番茄组(实验组)、变异链球菌灭活全菌免疫组(阳性对照组)、非转基因番茄组(阴性对照组),免疫方式为灌胃免疫,每周免疫1次,连续免疫4周。分别于首次免疫前1 d 和每次免疫1周后采集血液、唾液样品,用酶联免疫吸附实验法检测血清中免疫球蛋白 G(IgG)、唾液中分泌型免疫球蛋白 A(SIgA)抗体水平;鼠龄70 d 时处死动物,并取上下颌骨进行龋齿计分。结果免疫后,实验组和阳性对照组大鼠血清中 IgG、唾液中 SIgA 抗体水平与阴性对照组比较差异有统计学意义(P <0.05);实验组和阴性对照组在 Dx 级外的各级差异有统计学意义(P <0.05)。结论转基因番茄防龋疫苗具有免疫原性,能够诱导实验动物产生有效的免疫应答,降低龋齿的发生。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的：观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射（TSG）两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法：将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果：颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论：DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6 的构建、鉴定及免疫效应评价

目的构建结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6并探讨其诱导的免疫效应。方法将扩增自结核杆菌基因组的ESAT-6基因
装入pVAX1载体构建pVAX1/ESAT-6重组质粒;经酶切、测序鉴定后,利用阳离子聚合物介导将重组质粒pVAX1/ESAT-6转染
Hela细胞,分别以RT-PCR法检测ESAT-6 mRNA的表达、间接免疫荧光法检测ESAT-6蛋白表达。重组质粒经体内电转染免疫
小鼠后,采用ELISA法测定小鼠血清中IFN-γ及抗ESAT-6 特异性抗体IgG 的水平;流式细胞术检测小鼠淋巴细胞增殖水平;
ELISPOT检测产生IFN-γ的淋巴细胞频数。结果构建的重组质粒pVAX1/ESAT-6经双酶切于3000 bp和300 bp处各见1条带,
测序结果显示插入序列与ESAT-6基因序列无差异。重组质粒转染Hela细胞后,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳于约300 bp处
见目的条带,间接免疫荧光检测显示特异性绿色荧光。重组质粒免疫小鼠后,血清中抗ESAT-6特异性抗体IgG水平较对照组
（空质粒组和生理盐水对照组）明显升高;血清中IFN-γ水平、小鼠脾淋巴细胞增殖水平及产生IFN-γ的淋巴细胞数明显均高于对
照组（空质粒组和生理盐水对照组）。结论成功构建了结核病DNA疫苗pVAX1/ESAT-6,该疫苗可有效诱导小鼠产生特异性细
胞免疫和体液免疫效应。
     

纳米基因防龋疫苗的构建及其免疫大鼠的实验研究

目的:制备pcDNA3.1(+)gbpB壳聚糖纳米基因防龋疫苗,并检测其经鼻免疫大鼠的效果。方法:制备两种pcDNA3.1(+)gbpB壳聚糖纳米颗粒载体系统,经鼻粘膜免疫SD大鼠,用ELISA法检测血清中针对葡聚糖结合蛋白B的特异IgG抗体滴度及唾液中针对葡聚糖结合蛋白B的特异SIgA抗体滴度。与阳性对照组霍乱毒素pcDNA3.1(+)gbpB及未免疫组、空白壳聚糖纳米颗粒组作比较。结果:该载体系统经鼻免疫SD大鼠所产生的血清及唾液中针对GbpB的IgG和SIgA抗体滴度远大于未免疫组和空白壳聚糖纳米颗粒组,而与阳性对照组霍乱毒素pcDNA3.1(+)gbpB组抗体滴度相当。且维持的抗体滴度更稳定和持久。结论:成功构建了以葡聚糖结合蛋白B基因为免疫原的纳米基因防龋疫苗,并获得较好的免疫效果。     

犬传染性肝炎核酸疫苗的构建及免疫效果评价

目的获得犬传染性肝炎保护性抗原Loop重组蛋白及pVAX1-CpG-Loop重组质粒，并评价其诱导特异性免疫应答的水平。方法PCR扩增犬腺病毒Ⅰ型抗原表位Loop基因，构建至原核表达载体pET28a（＋）和真核表达载体pVAX1-CpG（＋）中；pET28a-Loop重组质粒转化BL21（DE3），表达蛋白经SDS-PAGE、免疫印迹分析、亲和层析纯化抗原蛋白，采用肌内注射、电转导方法，prime-boost免疫策略，pVAX1-CpG-Loop重组质粒股四头肌注射免疫小鼠，抗原蛋白加强免疫后进行免疫效果的评价。结果ELISA方法检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生，淋巴细胞增殖实验（MTT和CCK-8）、细胞因子和CD^4＋、CD^8＋分子测定表明DNA疫苗可以诱发TH1型免疫；中和实验表明表达蛋白诱导小鼠产生的抗体具有中和病毒的作用。结论构建的犬传染性肝炎pVAX1-CpG-Loop核酸疫苗具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力。     

双亚型(H5/H7)流感病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性检测

目的：构建双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法： 构建共表达流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA的DNA疫苗,采用间接免疫荧光法(IFA)检测目的蛋白在幼仓鼠肾细胞(BHK cell)中的表达。分为pVAX1-H5-H7、pVAX1-H5、pVAX1-H7和pVAX1空质粒对照组4组（每组15只）进行小鼠免疫实验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,流式细胞术检测小鼠脾T淋巴细胞亚群数量。结果：所构建的双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗在BHK细胞中的表达产物可激发荧光抗体产生绿色免疫荧光,且对照pVAX1空载体转染BHK细胞无免疫荧光产生。使用双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠产生了针对H5和H7抗原的血清特异性抗体,流式细胞术检测免疫组小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量显著高于对照组（P<0.05）。结论： 成功构建的双亚型（H5/H7）流感病毒 DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH的免疫保护作用

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用。方法选取BALB/c小鼠60只,随机分为3组(PBS对照组、空质粒对照组、疫苗免疫组),3组分别用构建成功的重组质粒pcDNA3.0-fimH(为疫苗免疫组),载体质粒(pcDNA3.0)(为空质粒对照组)和PBS液(为PBS对照组),经股四头肌注射免疫小鼠,于第21天和第35天加强免疫。于免疫第0、14、28及42天收集小鼠膀胱冲洗液,检测各组SIgA水平。于免疫第42天采血,检测各组特异性IgG、IgG1、IgG2a水平。结果免疫后,疫苗免疫组小鼠膀胱灌洗液中sIgA水平随时间延长呈上升趋势,且明显高于PBS对照组及空质粒组(F=10.08,P<0.05);疫苗免疫组小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体均明显高于对照组及空质粒组(P<0.05);结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道具有一定的免疫保护作用。     

复制缺陷型重组腺病毒rvAdG1VP7免疫学效果的研究

目的对1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究.方法通过灌胃和滴鼻2种途径对BALB/c小鼠进行免疫,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析.结果初次免疫后,2组小鼠均有应答,但血清IgG抗体滴度及阳转率不同.再次免疫后,显示出明显的加强效果.除了血清IgG外,小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA.滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到SIgA,灌胃组仅在肠道检测到SIgA.滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组.对滴鼻组小鼠肺灌洗液IgG/SIgA的阳转率进行了比较,发现IgG的应答水平明显高于SIgA.免疫后小鼠血清中IgG的动态观察表明,抗体可长期持续至少半年以上.结论重组腺病毒载体rvAdG1VP7所取得的良好免疫学效果,为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的进一步研制奠定了基础.     

O157:H7大肠杆菌外膜蛋白对小鼠免疫保护作用的实验研究

目的　研究经不同免疫途径 ,O1 5 7:H7大肠杆菌外膜蛋白 (OMP)对小鼠接受致死剂量该菌攻击后的免疫保护作用。方法　用外膜蛋白分别通过鼻腔、口腔和皮下途径对雌性BALB/c小鼠免疫 3次 ,采用ELISA测定血、阴道冲洗液和粪便内抗体水平 ;用Western 印迹方法分析诱导小鼠产生抗外膜蛋白特异性抗体的抗原 ;用致死剂量O1 5 7:H7大肠杆菌活菌经口腔攻毒 ,观察记录动物的发病与死亡情况 ;观察受染动物器官病理变化。结果　ELISA结果表明 ,经鼻腔与口腔免疫 ,能有效诱导抗外膜蛋白IgA和IgG免疫应答 ,鼻腔免疫更为有效。经皮下免疫仅能诱导血中产生高水平的特异性IgG抗体。攻毒后 ,鼻腔和口腔免疫组小鼠存活率明显高于对照组 (86 7%比 4 0 % ,P <0 0 1和 73 3%比 4 0 % ,P <0 0 5 ) ,鼻腔免疫组更高 (86 7%比 73 3% ,P <0 0 5 )。而皮下免疫组存活率甚至低于对照组 (1 3 3%比 4 0 % ,P <0 0 5 )。结论　O1 5 7:H7大肠杆菌外膜蛋白对实验小鼠的该菌株致死剂量攻击有较强的保护作用。鼻腔免疫途径为O1 5 7:H7大肠杆菌外膜蛋白诱导机体产生免疫保护的最佳途径     

重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（GLS）和小鼠IL-12基因质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫在小鼠体内的分布与表达。方法：将携带绿色荧光蛋白（GFP）基因质粒（pUV15）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻BALB／c小鼠后2周，处死小鼠，观察肺、脾组织中荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布；将携带GLS和IL-12质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌滴鼻免疫BALB／C小鼠3次，第1次免疫后4周，处死小鼠，用免疫组化检测肺、脾组织中GLS表达，用ELISA检测血清IL-12和肺泡灌洗液特异性SIgA的水平。结果：在BALB／c小鼠肺、脾组织中均检测到绿色荧光蛋白和耻垢分枝杆菌的分布，以及GLS的表达，并有血清IL-12水平升高和粘膜特异性SIgA的产生。结论：携带GFP的重组耻垢分枝杆菌可在肺和脾组织分布；携带GLS和IL-12的重组耻垢分枝杆菌经鼻粘膜免疫小鼠后，可引起呼吸道粘膜特异性抗菌免疫，以及GLS和IL-12的体内表达，为新型疫苗的研究奠定了基础.     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测

目的：制备高效价卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）病毒ORF65衣壳蛋白抗体并检测其特异性。方法将人工合成的ORF65蛋白抗原肽经弗氏佐剂乳化,在家兔背部、颌下等皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共4次。末次免疫后1周取兔血清,ELISA法检测兔免疫血清抗体IgG抗体水平。进一步采用免疫荧光、Western blot检测制备的抗血清中与ORF65结合的特异性。结果家兔在全程免疫后产生了高效价的特异性抗体,最高滴度达1∶12800。免疫荧光检测显示,与未经佛波酯（TPA）刺激的BCBL‐1细胞相比,兔抗血清主要结合于BCBL‐1细胞胞质,与ORF65蛋白在细胞内表达位置一致。Western blot结果显示在21 kD处有特异性蛋白条带,其大小与预期的ORF65蛋白大小相符,同时经T PA刺激的BCBL‐1细胞中ORF65蛋白表达量高于对照组,与ORF65蛋白裂解期蛋白的特性相符。结论用ORF65衣壳蛋白抗原肽段免疫家兔,可成功制备高效价的特异性抗血清,该抗体可与KSHV病毒ORF65蛋白特异性结合。     

麻疹疫苗及加佐剂经滴鼻免疫小鼠的抗体应答

目的：观察麻疹减毒活疫苗和灭活疫苗经滴鼻免疫小鼠后的抗体应答。方法：用活的或灭活麻疹疫苗及分别加明胶、植物血凝素(PHA)的疫苗滴鼻免疫小鼠，于末次免疫后10d取血清、唾液、呼吸道分泌物，用间接ELISA法检测特异性IgG，IgA抗体水平，并与皮下注射组及对照组进行比较。结果：各滴鼻组小鼠血清及呼吸道分泌物中均产生一定水平的特异性IgG及In抗体，皮下注射组小鼠呼吸道分泌物中未产生特异性IgA抗体；加明胶后的免疫效果优于加PHA的。结论：麻疹疫苗滴鼻免疫小鼠后可诱导全身及局部抗体应答，明胶可增强其免疫效果，而麻疹疫苗皮下注射免疫小鼠未能诱导局部抗体应答。     

仙台病毒Tianjin株及其HN／F基因真核表达质粒对人副流感病毒I型的血清中和实验研究

目的：探讨仙台病毒Tianjin株（SeV）及其核酸制备预防人副流感病毒I型（hPIV—1）疫苗的可行性。方法：（1）用sev免疫小鼠3次后取血清,间接ELISA法检测免疫血清抗体效价。（2）将倍比稀释的免疫血清与100TCID~0．1ml的hPIV一1进行中和实验,观察细胞病变（CPE）并计算50％血清中和终点。（3）构建SeV真核表达质粒pVAX1-F、DVAX1-HN,分别单独或联合免疫小鼠,取免疫血清检测对hPIV一1的中和终点。结果：SeV免疫血清抗体的50％中和终点分别为39．8、12．6、16．0、44．7、25．1;质粒免疫血清抗体的中和作用按pVAX1-HN＋pVAX1-F组〉pVAX1-HN组〉DVAX1-F组依次递减。结论：仙台病毒Tianjin株及其HN基因、F基因真核表达质粒能诱导机体产生抗hPIV-1抗体,有可能成为制备预防hPIV-1疫苗的有效毒株。     

Effectiveness of intragastric immunization with protein and oligodeoxynucleotides containing a CpG motif for inducing a gastrointestinal mucosal immune response in mice

PURPOSE: To investigate a new modality of mucosal vaccines, we evaluated the effectiveness of intragastric immunization for inducing a mucosal immune response in the gastrointestinal tract. METHODS: Mice were immunized with beta-galactosidase (beta-gal) and synthesized oligodeoxynucleotides containing a CpG motif (CpG-DNA) by intragastric injection, and the immune response was compared with those induced by 3 other immunization forms: intranasal, oral, and intradermal. RESULTS: Intragastric immunization with beta-gal and CpG-DNA induced significant anti-beta-gal fecal IgA production at 2 weeks; however, at 4 weeks the response was lacking. In contrast, intranasal immunization with beta-gal and CpG-DNA induced the highest anti-beta-gal fecal IgA production at 4 weeks. CONCLUSION: Although intragastric immunization with protein and CpG-DNA induces a mucosal immune response in the gastrointestinal tract, intranasal immunization is the most effective to induce both mucosal and systemic immune responses. This finding may increase the possibility for developing vaccines against mucosal pathogens, especially Helicobacter pylori.     

变形链球菌表面蛋白和葡糖基转移酶基因疫苗对唾液变形链球菌和牙菌斑的影响

目的　了解变形链球菌表面蛋白和葡糖基转移酶基因疫苗单独及联合免疫对定菌鼠唾液变链菌和牙面菌斑的影响。方法　 2 8d龄 Wistar大鼠 3 6只 ,随机分为 pc DNA3 - pac组、pc DNA3 - gtf B组、pc DNA3 - pac联合pc DNA 3 - gtf B组、变形链球菌灭活全菌组、pc DNA3空载体组和 PBS液组 ,进行三次双侧颌下腺腺周注射免疫 ,建立定菌鼠模型 ,作诱龋实验 3个月。唾液变链菌计数和菌斑计分。结果　唾液变链菌菌落计数和牙面菌斑计分在 pc D-NA3与 PBS组最高 ,其次为单基因疫苗免疫组 ,联合基因疫苗和灭活全菌细胞免疫组最低 ,各组间有显著性差异 ( P<0 .0 5 )。结论　 pc DNA3 - gtf B和 pc DNA3 - pac具有明显的免疫抑菌作用 ,联合基因疫苗免疫优于单基因疫苗