加味神术散雾化剂抗流感病毒的实验研究

目的探讨加味神术散雾化剂在体外对甲型H1N1流感病毒增殖的影响。方法以甲型H1N1流感病毒感染狗肾传代细胞（MDCK cell）为载体,观察加味神术散雾化剂不同药物浓度对流感病毒引起的细胞病变（CPE）的影响。采用Reed-Muench法计算流感病毒对MDCK细胞的半数细胞感染量(TCID50)。采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）测定光密度（OD）值,计算不同药物对MDCK细胞的破坏率,通过Probit回归计算不同药物对MDCK细胞的最大无毒浓度（TC0）及半数中毒浓度(TC50)。计算不同药物对流感病毒增殖的抑制率,通过Probit回归计算半数抑制浓度(IC50)和治疗指数（TI）。结果甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的TCID50为10-8/0.1mL。加味神术散雾化剂对MDCK细胞的TC50为366.63μg/mL,TC0为31.25μg/mL;利巴韦林对MDCK细胞的TC50为109.85μg/mL,TC0为8.02μg/mL。加味神术散雾化剂对流感病毒直接抑制作用的IC50=9.79μg/mL,TI=37.45;对预防流感病毒感染的IC50=8.72μg/mL,TI=41.04;对治疗流感病毒感染的IC50=17.40μg/mL,TI=21.07。利巴韦林对预防流感病毒感染的IC50=84.30μg/mL,TI=1.30。结论加味神术散雾化剂可明显抑制甲型H1N1流感病毒在MDCK细胞中的增殖,具有抗甲型H1N1流感病毒作用。     

八角茴香及其提取物莽草酸抗甲型流感病毒的体外研究

目的 检测八角茴香及其提取物莽草酸体外抗甲型流感病毒的作用.方法 MTT法测定药物对MDCK细胞的毒性;鸡胚扩增病毒,测定病毒在MDCK细胞上的TCID50;通过观察CPE的情况以及采用MTT法评价药物对病毒在细胞内生长的影响.结果 在MDCK细胞上八角水提物和莽草酸的最大无毒浓度（TC0）分别为10 mg/mL和0.1 mg/mL;病毒的TCID50为10-4/0.1 mL;在细胞模型上八角水提物对病毒有明显的预防和治疗效果,但莽草酸未表现出预防或治疗效果.结论 在体外实验中,八角水提物对H3N2型流感病毒有一定的预防和治疗作用,而其提取物莽草酸无此效果.     

麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的MDCK细胞活性与超微结构的影响

目的 研究麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的MDCK细胞活性与超微结构的影响.方法 (1)运用细胞培养技术和MTT法检测麻杏石甘汤预防给药和治疗给药方式下的流感病毒感染的MDCK细胞活性;(2)用透射电子显微镜观察最大无毒限毒的麻杏石甘汤治疗给药方式下的流感病毒感染的MDCK细胞的超微结构.结果 治疗给药方式中,麻杏石甘汤在浓度为31.25 mg/mL时,MDCK细胞活性的0D值显著高于病毒对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),TI为2.78;预防给药方式中,麻杏石甘汤在浓度为15.63、31.25 mg/mL时,MDCK细胞OD值高于病毒对照组,差异具有统计学意义(P＜0.01),T1为1.71;与病毒对照组比较,麻杏石甘汤治疗给药方式下的MDCK细胞超微结构较完整.结论 麻杏石甘汤在预防给药和治疗给药方式中均能发挥抗流感病毒作用;并能通过抑制病毒增殖的方式而保护流感病毒感染的MDCK细胞活性与超微结构.     

复方感冒冲剂体外抗流感病毒作用

目的探讨复方感冒冲剂体外对流感病毒（H3N2）的抑制作用,为临床合理用药提供科学依据。方法使用狗肾传代细胞（Madin-Darby canine kidney,MDCK）建立体外病毒感染模型。将病毒与药物通过三种不同给药方式,通过细胞病变法观察复方感冒冲剂对流感病毒的抑制及对被感染细胞的保护作用。结果复方感冒冲剂在感染病毒同时加药方式下对流感病毒（H3N2）感染的MDCK细胞有明显的保护作用;在先给药再感染病毒的方式下对MD-CK细胞的保护作用较弱;在先加病毒后加药的方式下,复方感冒冲剂对病毒感染的MDCK细胞无明显保护作用。结论复方感冒冲剂具有体外抗流感病毒作用,其药效发挥可能依赖机体的代谢并与给药方式有关。     

抗病毒1号中药有效部位体外对流感病毒A3的抑制作用

目的 探讨开发安全有效的抗流感病毒新药。方法 采用细胞培养技术，以病毒唑为阳性对照药，观察抗病毒1号中药有效部位（AD1）在MDCK细胞中对流感病毒A3的抑制作用。结果 AD1半数中毒浓度（TC50）为26.95mg/ml；抗流感病毒A3的半数有效浓度（EC50）为2.4mg/ml；治疗指数（TI）为11.23；染毒后0－8h分别给药均有抗病毒活性，且对流感病毒A3的抑制作用存在明显的量效反应关系。结论 抗病毒1号中药有效部位在MDCK细胞中对流感病毒A3有明显抑制作用。     

银翘散抗甲1型流感病毒作用的实验研究

目的以MDCK细胞及小鼠流感肺炎模型为基础，观察不同浓度银翘散煎剂对流感病毒导致细胞病变的抑制作用和改善小鼠肺炎严重程度的情况，评价古方银翘散对甲1型流感病毒的抑制作用。方法接种甲1型流感病毒于MDCK细胞，观察银翘散体外抗流感病毒作用；以甲1型病毒滴鼻感染小鼠，观察对肺指数、病毒致小鼠死亡率等的影响。结果银翘散的最大无毒浓度为1．13g.L^-1，100TCID50病毒攻击量下，银翘散（在0．52～66g．L^-1浓度下）在MDCK细胞对甲1型流感病毒FM1株均无明显的抑制作用。银翘散对流感病毒致小鼠肺炎的抑制作用，其40、20、101mg．kg^-1三个剂量组的肺指数分别为1．35、1．36、1．52，其中银翘散40、20mg／kg两个剂量组与病毒对照组相比，差异有显著性（P〈0．01）；银翘散100mg．kg^-1与病毒对照组相比，在死亡保护率和平均存活时间均有统计学的差异显著性（P〈0．05）。结论银翘散可改善流感病毒引起的小鼠肺炎症状，延长生命率，对甲1型流感病毒感染小鼠有死亡保护作用，对病毒性感冒显示了较好的疗效。     

清肺饮在狗肾传代细胞中抗流感病毒活性的研究

目的研究清肺饮对A/PR/8/34(H1 N1)(甲型流感病毒)、B/汉防/194/95(乙型流感病毒)的预防、治疗作用.方法运用病毒的组织细胞培养技术,采用细胞病变(CPE)抑制试验、血凝滴度法(HA)、血球吸咐法(HD),研究清肺饮粗提物对流感病毒的直接作用、预防作用和流感病毒感染后的治疗作用.结果(1)对流感病毒的预防作用和直接灭活作用:清肺饮组半数组织培养感染(TCID50)比病毒对照组低2 Log以上,且与药物浓度呈正相关;(2)对狗肾传代细胞(MDCK细胞)感染流感病毒后的治疗作用,其TCID50比病毒对照组低1.5 Log以上.结论清肺饮具有直接抑制A/PR/8/34(H1 N1)、B/汉防/194/95的作用,且呈明显量效关系;对这两型病毒具有显著预防、治疗作用.     

复方莪术油溶液抗H5N1亚型禽流感病毒的作用研究

目的:对复方莪术油溶液在流感病毒的MDCK细胞上和在非免疫鸡内抗禽流感H5N1亚型病毒的作用进行了研究.方法:采用细胞病变效应(CPE)抑制试验和MTT测定法,研究复方莪术油溶液及其有效成分莪术醇和金丝桃素在MDCK细胞上对H5N1病毒的灭活作用,对病毒感染的阻滞作用,对病毒吸附的抑制作用以及对被病毒入侵的细胞的治疗作用;另外,用复方莪术油溶液时14日龄非免疫试验鸡连续经口喂药1周,采用禽流感病毒H5NI攻击鸡群,攻毒的同时开始给药,观察药物对鸡的保护作用.同时与单方莪术油溶液、贯叶连翘水提取液和阳性对照药奥司他韦以及金刚烷胺进行了比较.结果:在体外实验中,复方莪术油溶液及其有效成分莪术醇和金丝桃素通过灭活病毒,阻滞病毒感染,抑制病毒吸附和治疗病毒引起的损伤而发挥抗H5N1亚型禽流感病毒的作用;在体内实验中它们对染毒鸡具有较好的预防保护作用,可延长染毒鸡的平均存活天数,与病毒对照组比较具有显著性差异(P<0.01),奥司他韦与金刚烷也具有相似的抑制病毒的作用.结论:复方给药的效果优于单方,并且主要在预防病毒感染环节发挥抑制作用.     

栀子苷对甲型H1N1流感病毒的抑制作用

为探讨栀子苷对甲型H1N1病毒的抑制效应,进行了相关体内外实验研究。体外实验中采用MTT法判定栀子苷对MDCK细胞的毒性作用。以帕拉米韦为阳性对照药,根据MTT比色值,观察栀子苷对甲型H1N1流感病毒感染的MDCK细胞的细胞病变效应(cytopathic effects,CPE),计算不同给药方式(预防给药、直接灭活及治疗给药)及不同药物剂量干预下,栀子苷对甲型H1N1流感病毒的抑制效率;体内实验以甲型H1N1流感病毒感染ICR小鼠,建立甲型H1N1流感病毒小鼠肺炎模型,比较栀子苷不同剂量干预下,小鼠肺指数、肺组织病理学检查及小鼠存活率。实验结果显示,栀子苷的细胞毒性小,其TD₅₀大于1 040 μmol/L;栀子苷在预防、直接灭活及治疗给药方式下,对甲型H1N1流感病毒感染的MDCK细胞抗病毒EC₅₀分别为91.90、96.25和87.68 μmol/L,对CPE有明显抑制作用;栀子苷可显著降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺指数、减轻肺组织炎症损伤、降低小鼠死亡率、延长生存时间。实验结果表明,栀子苷在体外能有效抑制甲型H1N1流感病毒对MDCK细胞的CPE,在体内能有效保护甲型H1N1流感病毒对小鼠肺部的攻击作用,可能为流感病毒的防治提供一个新的选择。     

黄芩主要成分体外抗甲型流感病毒作用的研究

目的比较黄芩的主要成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素体外抗甲型流感病毒FM1感染的作用,明确黄芩抗流感病毒的主要有效成分。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对狗肾细胞株(MDCK)的最大无毒浓度(TC0)及半数中毒浓度(TC50),通过细胞病变效应(CPE)法观察药物对病毒致细胞病变作用的影响。MTT法检测药物不同浓度的抗病毒有效率,Probit回归法计算黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对病毒感染的半数抑制浓度(IC50)及治疗指数(TI),荧光法检测黄芩苷对病毒神经氨酸酶活力的影响。结果黄芩苷对流感病毒所致的细胞病变作用有明显的抑制作用,当黄芩苷浓度在0.0156～0.1250g/L时,细胞存活率明显高于病毒感染组,其中以0.1250g/L组的细胞存活率最高,抗病毒有效率达94.6%,其IC50为0.0162g/L,TI为21.34;黄芩素对流感病毒所致的细胞病变有一定的抑制作用,当黄芩素浓度在0.0860g/L时,抗病毒有效率达48.72%,其IC50为0.0778g/L,TI为8.89;汉黄芩素对流感病毒所致的细胞病变无抑制作用,其IC50为0.0236g/L,TI为0.051。当黄芩苷浓度?0.0313g/L时,能明显降低病毒神经氨酸酶的活力。结论黄芩主要成分中抗流感病毒的作用为黄芩苷黄芩素汉黄芩素,说明黄芩抗流感病毒的主要有效成分是黄芩苷。     

板蓝根和鱼腥草抗流感病毒研究

目的研究板蓝根和鱼腥草对甲型流感病毒的预防、治疗作用。方法通过测定半数病毒感染量，研究板蓝根和鱼腥草对甲型流感病毒的直接作用、预防作用和流感病毒感染后的治疗作用。结果板蓝根组半数组织培养感染量在直接作用、预防和治疗作用组分别比病毒对照组低2．3log、3．0log、2．0log，差异有显著性（P〈0．05）；鱼腥草组半数组织培养感染量在直接作用、预防和治疗作用组分别比病毒对照组低1．7log、2．9log、1．4log，差异有显著性（P〈0．05）。结论板蓝根和鱼腥草对流感病毒有直接抑制作用，对流感感染有预防、治疗作用。     

mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究

目的构建小鼠β防御素1和β-防御素3（mBD1,mBD3）融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRI和Xho工双酶切后插入相同酶切的pcDNA3．1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT—PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBDl-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD1—mBD3。RT—PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有-定的抗流感病毒作用。为进-步深入研究mBDI-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。     

中草药提取液对流感病毒诱导细胞凋亡的影响

探讨金银花、黄芩和连翘的提取液对甲3型流感病毒诱导狗肾传代细胞(MDCK细胞)凋亡的影响。方法采用金银花、黄芩和连翘3种中草药的提取液进行抗病毒试验,以细胞病变、姬姆萨染色在光镜下观察细胞形态学变化,Annexin V和PI双染用流式细胞仪测定细胞凋亡率,评价药物对甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡的影响。结果在MDCK细胞上甲3型流感病毒(血凝滴度为1∶64)的TCID50为0.65.100μL-1;实验浓度:金银花为1∶256(1.95g.L-1),黄芩为1∶64(7.81g.L-1),连翘为1∶64(7.81g.L-1)。在光镜下观察甲3型流感病毒对照组的MDCK细胞,可见被感染的MDCK细胞出现了细胞凋亡特有的形态学变化。Annexin V和PI双染经流式细胞仪测定显示3种药物实验组的细胞凋亡率[金银花(28.13±3.30)%、黄芩(13.47±3.04)%、连翘(19.17±6.55)%]均显著低于病毒对照组[(54.10±4.58)%](P<0.001)。结论 7.81g.L-1的黄芩及7.81g.L-1的连翘均能抑制100TCID50的甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡。1.95g.L-1的金银花不能够有效抑制100TCID50的甲3型流感病毒诱导MDCK细胞凋亡。     

The in-vitro Effects of Arbidol Hydrochloride Against 2009 New Influenza Virus A (H1N1)

Objective To detect the in-vitro effects of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1). Methods The activity of arbidol hydrochloride against 2009 new influenza virus A (H1N1) was determined in MDCK cell cultures. Hemagglutination assay, observation of cytopathic effects, RT-PCR and quantitative RT-PCR tests were performed for determination of virus titers. Inhibition concentration 50% and cytotoxic concentration 50% were calculated with Chou's Menu of Dose-Effect Program. Results Arbidol hydrochloride showed low cytotoxicity (cytotoxic concentration 50%>100 μmol/L)and significant anti-2009 new influenza virus A (H1N1) activity in cell cultures. Inhibition concentration 50% were (5.5±0.9), (3.4±0.8), and (1.5±0.2) μmol/L in hemagglutination assay, cytopathic effect test, and quantitative RT-PCR assay, respectively. Conclusion Arbidol has low cytotoxicity and high anti-virus activity and can effectively trigger the activities of interferon and immune response, and therefore can be a valuable anti-influenza virus drug.     

甲型流感病毒H3N2诱导狗肾传代细胞凋亡的研究

目的探讨甲型流感病毒对体外培养的狗肾传代细胞系(MDCK)的凋亡诱导作用.方法用不同血凝单位的甲型流感病毒感染MDCK细胞,经HE染色、琼脂糖凝胶电泳以及流式细胞术等方法检测凋亡情况.结果甲型流感病毒感染MDCK后,在细胞形态上呈现凋亡特有变化;电泳出现典型梯状条带;Annexin-V染色流式细胞仪检测出在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关.结论甲型流感病毒能够诱导体外培养的MD-CK细胞凋亡,且在一定范围内,细胞凋亡率与病毒的浓度呈正相关.     

含多酸化合物新型洗手液抗甲型流感病毒效果及毒性评价

目的：配制含有多酸化合物的新型洗手液,并探讨其在人手部抗流感病毒的效果和安全性。方法：采用MDCK细胞
流感病毒模型研究2种多酸化合物K10Na［(VO)3(SbW9O33)2］?26H2O(PM-1001)和K15［Pr(BW11O39)2］?28H2O(Pr-B)
的体外抗病毒作用,选择3个适宜的多酸剂量配制成含高、中、低剂量多酸洗手液;依据美国标准方法进行洗手液抗病毒效果评价,含2种多酸化合物的洗手液各有5名志愿者参与实验,将每名志愿者的10个手指随机分成5组,在手指上涂0.02 mL组织培养半数感染剂量（TCID50）为107.5/0.1 mL的病毒悬液后,分别在加病毒后、病毒液晾干后和用不同洗手液处理后收集病毒,采用MDCK细胞培养法测定病毒滴度;检测流感病毒在手部晾干30和60 min后的浓度和活力变化;选择含高浓度PM-1001的
洗手液,按照《消毒技术规范》（2008版）利用昆明小鼠和白色家兔进行毒性评价。结果：PM-1001和Pr-B抗流感病毒的治疗指数(TI)分别为82.68和69.13;对照组的病毒浓度为104.33±0.66TCID50/0.1 mL,各洗手液处理组组织培养法均未检测到病毒,各洗手液处理组病毒浓度均低于对照组（P<0.001）,30和60 min收集的病毒浓度分别为103.98 ±0.42TCID50/0.1 mL和103.83±0.35TCID50/0.1 mL,与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05）;含高浓度PM-1001的洗手
液对昆明小鼠的经口毒性实验半数致死浓度（LD50）大于5　000　mg/kg^-1（体质量）,对家兔完整皮肤刺激指数为0.33,对3只家兔眼刺激的平均评分分别为0、0.67和0.33。结论：含多酸化合物的新型洗手液可有效抑制手部甲型流感病毒,属实际无毒级的物质,对家兔完整皮肤和眼无刺激性。     

甲型H1N1病毒感染BEAS-2B细胞差异蛋白的初步研究

目的通过建立2009H1N1流感病毒感染BEAS-2B（人支气管上皮细胞）细胞模型,探讨病毒感染细胞后细胞蛋白质差异变化,为2009H1N1流感病毒的致病机理研究奠定基础。方法 100 TCID50 2009H1N1（D、S、O）流感病毒感染BEAS-2B细胞12、24、48、72h后提取细胞总蛋白进行双向电泳,Image MasterTM 2D Platinum Software 7.0软件分析图像,对有差异的蛋白酶解,质谱分析鉴定差异蛋白。结果质谱共鉴定出包括蛋白酶体α5、巨噬细胞移动抑制因子（MIF）、前纤维蛋白1（profilin-1）、α-2干扰素等13个差异蛋白。结论 13个差异蛋白可能参与了2009H1N1流感病毒的致细胞病变过程。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

连翘挥发油的成分分析及抗病毒活性的考察

目的：考察连翘挥发油及其主要成分α-蒎烯及β-蒎烯对甲、乙型流感病毒与乙肝病毒的活性。方法：①通过GC—MS分析翘挥发油的化学成分；②以2．2．15细胞为乙型肝炎病毒载体，分别测定它们抑制乙型肝炎病毒进行DNA复制和产生HBsAg、HBeAg的能力；③以MDCK（狗肾）细胞为病毒宿主，分别测定它们抑制病毒引起细胞病变的程度（CPE）。结果：①在最大无毒剂量时，即在连翘挥发油258．69μg／ml、α-蒎烯258．69μg／ml、β-蒎烯192．45μg／ml时，均无抗乙肝病毒活性；②连翘挥发油α-蒎烯、β-蒎烯的浓度分别是192．5μg/ml时，均无抗甲、乙型流感病毒活性；③连翘挥发油的主要成分是α-蒎烯及β-蒎烯，总相对含量为71．48％。结论：连翘挥发油、α-蒎烯及β-蒎烯均无抗甲、乙型流感病毒与乙肝病毒的活性。