促红细胞生成素对新生鼠缺氧缺血性脑损伤细胞凋亡的影响

目的:观察给予外源性重组人红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后神经细胞凋亡的影响。方法:实验于2005-03/06在解放军第四军医大学病理实验室进行。①取新生7dSD大鼠72只,随机分为3组(n=24),假手术组、模型组和促红细胞生成素组,各组又分为造模后6,24,48,72h组4个亚组,每组6只大鼠。②促红细胞生成素组和模型组大鼠结扎右颈动脉,手术后即刻分别腹腔内注射重组人红细胞生成素注射液(10U/g)及同体积生理盐水,手术后2h两组大鼠吸入体积分数为0.08氧气和体积分数为0.92氮气的混合气体2h,建立缺氧缺血脑损伤新生鼠模型及促红细胞生成素治疗模型。假手术组分离动脉不结扎,不缺氧。③各组大鼠在造模后相应时间点断头处死,采用TUNEL法检测大脑海马区神经细胞凋亡情况。结果:经补充后72只进入结果分析。①模型组6h右侧海马CA1区出现凋亡细胞[(19.10±5.90)个],24h显著增高,48h达高峰[(65.70±8.33)个]后逐渐下降,但72h仍高于假手术组[(28.70±5.74),(0.60±0.84)个,F=71.587,P<0.01]。②促红细胞生成素组各个时间点CA1区的凋亡细胞数均少于模型组(P<0.01),尤其在24h最明显[(28.20±7.77),(60.30±7.75)个,t=-9.251,P<0.01]。结论:外源性重组人红细胞生成素能抑制缺氧缺血性脑损伤后的神经细胞凋亡,对脑组织确有保护作用。     

新生大鼠缺氧缺血模型脑组织中肾上腺髓质素含量变化及其对脑细胞凋亡的影响

目的:观察新生大鼠缺氧缺血后脑内肾上腺髓质素含量变化,以及给予外源性肾上腺髓质素对缺氧缺血大鼠脑细胞凋亡的影响。方法:实验于2003-11-01/30在延边大学附属医院儿科疾病研究室进行。①脑组织肾上腺髓质素测定:选用7日龄Wistar大鼠29只单纯随机分为正常组9只、模型组及肾上腺髓质素组各10只,正常组不干预,另外2组大鼠结扎左侧颈总动脉,并吸入含体积分数为0.08氧气制备缺氧缺血性脑病模型,造模后肾上腺髓质素组即刻腹腔注射肾上腺髓质素2.0nmol/kg(浓度为82μmol/L),48h后将大鼠断头处死,取左侧脑组织测肾上腺髓质素含量。②细胞凋亡测试:7日龄Wistar大鼠39只分4组,正常组9只,模型组、肾上腺髓质素组和胰岛素样生长因子1组各10只,正常组不干预,另外3组同前造模,造模后即刻后2组分别腹腔注射肾上腺髓质素2.0nmol/kg、胰岛素样生长因子11.5μg/kg。48h后心脏灌注处死,取脑组织,行TUNEL法及苏木精-伊红染色,测定细胞凋亡数,凋亡百分率,凋亡面密度及数密度。结果:68只大鼠全部进入结果分析。①脑组织肾上腺髓质素含量:肾上腺髓质素组高于正常组和模型组[(1.81±0.43),(0.41±0.02),(1.07±0.27)ng/g,F=34.81,P<0.01],模型组高于正常组(P<0.01)。②凋亡细胞数:正常组显著低于其他3组(P<0.001),肾上腺髓质素组显著低于模型组[(9.20±0.53),(23.43±5.11)个/视野,P<0.001]。③凋亡细胞数密度和面密度:模型组高于正常组(P<0.001),肾上腺髓质素组低于模型组(数密度:0.0016±0.0007比0.0049±0.0009;面密度:0.043±0.018比0.131±0.044,P<0.001),胰岛素样生长因子1组与肾上腺髓质素组差异不显著(P>0.05)。④凋亡细胞百分率:模型组明显高于正常组[(55.5±5.1)%,(7.6±3.6)%,P<0.01],肾上腺髓质素组明显低于模型组[(21.8±1.8)%,P<0.01]。结论:①肾上腺髓质素在缺氧缺血后脑组织内含量明显升高。②肾上腺髓质素可降低缺氧缺血后的脑细胞凋亡,对脑细胞有保护作用,其效果与胰岛素样生长因子1相似。     

丰富环境对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡及脑源性神经营养因子/酪氨酸蛋白激酶受体信号通路的影响

目的探讨丰富环境对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡及脑源性神经营养因子(BDNF)/酪氨酸蛋白激酶受体(TrkB)信号通路的影响。方法将48只7日龄Wistar大鼠幼仔,随机分成假手术组、模型组和丰富环境组,每组再分为14 d和28 d两个亚组,每个亚组8只。采用Rice方法制作缺氧缺血性脑损伤模型。模型组和假手术组不进行处理,丰富环境组在造模24 h后应用丰富环境进行刺激。造模后14 d和28 d,采用TUNEL法和双重免疫荧光染色法检测海马区神经元凋亡水平;采用免疫组化染色法检测海马区BDNF、TrkB蛋白表达情况。结果造模后14 d、28 d,与假手术组比较,模型组海马区TUNEL阳性细胞数、双标记阳性细胞数以及海马BDNF和TrkB阳性细胞数显著增加(t 27.214, P 0.001),丰富环境组TUNEL阳性细胞数、双标记阳性细胞数显著少于模型组(t 12.687, P 0.001),丰富环境组造模后28 d海马BDNF和TrkB阳性细胞数显著高于模型组(t 137.998, P 0.001)。结论丰富环境刺激可以降低缺血缺氧性脑损伤新生大鼠海马神经元凋亡,上调BDNF、TrkB蛋白表达。     

电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马神经元突触形态可塑性的影响机制

背景:电针治疗阿尔茨海默病有较好的临床疗效,但其作用机制尚不清楚。目的:观察电针对阿尔茨海默病模型大鼠海马神经元突触数密度、面密度、突触连接带的平均面积及海马CA3区超微结构的影响。设计:完全随机分组设计,对照实验。单位:四川省人民医院中医科,成都中医药大学针灸推拿学院。材料:选用24月龄雄性SD大鼠50只,体质量(480±20)g;3月龄雄性SD大鼠6只,体质量(250±15)g。通道式水迷宫:由黑色玻璃制成(2.1m×1.7m×0.6m),水深40cm,水温22～25℃。共设4个盲端。WQ1002F型Hans电针仪。方法:实验于2002-09/2003-06在成都中医药大学三级动物实验中心完成。①先后通过3次通道式水迷宫实验将老年SD大鼠分组:第1次水迷宫实验(针对6只青年大鼠)在造模前8d进行,共4d。得出青年大鼠平均逃避潜伏期。第2次水迷宫实验(针对50只老年大鼠)在造模前4d进行,得出老年大鼠平均逃避潜伏期。其中36只潜伏期<青年大鼠潜伏期均值 1倍标准差值为正常老年大鼠,从中随机选出12只,随机分为2组:对照组和假手术组,每组6只。对其余24只大鼠采用穹窿-海马伞切断术造成阿尔茨海默病模型。第3次水迷宫实验(针对造模的24只大鼠)在造模后第2天进行,从中选出潜伏期大于青年大鼠潜伏期均值 2倍标准差值的大鼠,即为合格的阿尔茨海默病模型,再从中随机筛选出12只,随机分为2组:模型组和电针组,每组6只。②造模后第6天开始对电针组进行治疗,选穴百会、涌泉、太溪、血海,用30号3.33cm毫针分别在“百会”斜刺0.5寸,“涌泉”、“太溪”、“血海”直刺0.3寸,连接电针仪进行治疗,施以连续波,频率20Hz,电压2～4V,强度以大鼠能安静耐受为度(约为2mA),留针30min,1次/d,连续治疗20d。对照组、假手术组(只在与造模大鼠相同位置暴露大脑皮质,不切断穹窿-海马伞)和模型组只进行固定,未予任何治疗。③治疗结束后,采用透射电镜观察大鼠海马CA3区超微结构,采用体视学方法计数突触的数量和突触连接带与测试线的交点数,求出能够较好反映突触形态可塑性变化的体视学参数突触的数密度、面密度和突触连接带的平均面积。④组间两两比较,方差齐性用t检验,非齐性用t检验。主要观察指标:各组大鼠突触数密度、面密度、突触连接带的平均面积比较。结果:最终符合要求进入结果分析的老年大鼠24只,每组6只。①超微结构:对照组和假手术组的突触密度大于模型组,而突触平均面积较小;电针后突触的密度较模型组明显增大,而突触的平均面积较小。②大鼠海马CA3区突触数密度、面密度:模型组和电针组明显低于对照组和假手术组(P<0.05～0.01),以模型组最低;假手术组与对照组差异不明显(P>0.05);电针组明显高于模型组(P<0.01)。③大鼠海马CA3区突触连接带平均面积:模型组和电针组明显大于对照组和假手术组(P<0.05～0.01),以模型组最高;假手术组与对照组差异不明显(P>0.05);电针组明显小于模型组(P<0.01)。结论:电针能有效地使阿尔茨海默病大鼠海马神经元突触形态得到一定程度的修复,阻止海马神经元突触的退变。     

“形神共养”对脑缺血再灌注大鼠功能恢复和突触形态结构参数的影响

目的:探讨"形神共养"的丰富生存环境对大鼠缺血再灌注脑损伤后神经功能及突触超微结构的影响。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为缺血"神养"组(IE1)、缺血"形养"组(IE2)、缺血"形神共养"组(IE3)、缺血标准环境组(IS)、假手术标准环境组(SS)、正常对照组(NC),每组10只。制作大鼠缺血再灌注模型。IE1、IE2、IE3组均给予丰富生存环境训练;其余组居于标准环境。于第3天、10天、17天、24天、31天进行改良神经功能缺损评分,实验结束后透射电镜观察缺血侧皮质和海马的突触超微结构的形态变化。结果:于训练第10天、17天、24天、31天,IE1、IE2和IE3组的行为学评分有不同程度的改善,且与IS组比较有显著性差异(P0.05)。患侧皮质和海马IE1、IE2、IE3组突触后致密物厚度、突触间隙宽度与IS组相比有显著性差异(P0.05),且IE2、IE3两脑区突触界面曲率与IS组相比有显著性差异(P0.05)。结论:"形神共养"组大鼠的丰富生存环境训练对脑缺血再灌注的神经功能改善有促进作用。     

N-甲基-D-天冬氨酸受体在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑海马中的远期表达

目的:观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后,海马发育过程中N-甲基-D-天冬氨酸受体的远期表达变化。方法:实验于2006-03/06在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。选用新生7日龄SD大鼠72只,按随机数字表法分为缺氧缺血性脑损伤组和假手术组,每组36只。各组又分为生后15d(n=6)、22d(n=6)、29d(n=6)、36d(n=12)及43d(n=6)5个时相点。①参照Rice法通过结扎7日龄大鼠左侧颈总动脉,吸入氧气体积分数为0.08的氮氧混合气,制成缺氧缺血性脑损伤模型,出现自发或夹尾左旋则证明模型制作成功。假手术组仅切开颈部皮肤,暴露左侧颈总动脉。②应用免疫组织化学法检测缺氧缺血后不同时点两组大鼠脑海马CA1区N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚单位的表达(n=6),测量平均灰度值,灰度值越低,蛋白表达越强;生后36d时相点大鼠(n=6)利用Morris水迷宫测定学习记忆能力;最后应用电镜观察生后36d大鼠海马突触结构。结果:72只大鼠,全部进入结果分析,无脱失。①生后22-43d缺氧缺血性脑损伤组大鼠(缺氧缺血后15-36d)脑海马CA1区NR1平均灰度值分别为167.69±6.48,174.57±4.81,179.30±5.92,176.50±5.93,均显著高于同日龄假手术组148.96±4.91,151.17±6.37,152.06±9.86,156.32±6.86(P均<0.01)。②Morris水迷宫实验中,缺氧缺血性脑损伤组大鼠逃避潜伏期显著长于假手术组(48.87±9.47)s,(11.97±2.20)s,(P<0.01);原平台象限游泳距离/总游泳距离的百分比显著低于假手术组(14.45±3.85)%,(62.20±8.74)%(P<0.01)。③生后36d(缺氧缺血后29d),透射电镜下缺氧缺血性脑损伤组大鼠患侧海马突触后膜致密物较假手术组明显减少。结论:新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后期存在海马N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达下调,可能对大鼠远期空间学习记忆产生一定影响。     

黄芪对新生鼠乏氧缺血脑损伤后海马区神经的保护及学习记忆能力的干预

背景:黄芪可通过减轻兴奋性氨基酸的释放及在细胞间的堆积、缓解Ca2 超载、抗氧化等途径抑制凋亡的发生。目的:将黄芪用于未成熟脑缺氧缺血脑损伤的治疗,一方面检测其对海马缺氧缺血后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA表达水平的影响,另一方面通过迷宫实验观察黄芪对缺氧缺血脑损伤的成熟鼠学习记忆能力的干预。设计:随机对照实验。单位:东南大学临床医学院/附属中大医院儿科,基础医学院病理科。材料:实验于2002-10/2003-06在东南大学临床医学院实验中心完成。选取出生7d的同窝SD大鼠114只,随机分成3组:假手术组18只,模型组48只,黄芪治疗组48只。黄芪注射液由成都地奥九泓制药厂生产,规格为10mL/支,含生药20g。方法:模型组与黄芪治疗组建立缺氧缺血脑损伤模型,假手术组不造模。黄芪治疗组于造模后即刻及每天同一时间腹腔注射0.08mL黄芪注射液,7d后停药,模型组于同时间腹腔注射等量生理盐水,假手术组不给药。黄芪治疗组及模型组在缺氧缺血后24h,5d断头取脑,假手术组于假手术后24h断头取脑。各组海马区脑损伤行组织病理学检测,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的表达采用半定量反转录-聚合酶反应方法进行检查,成年90d龄的大鼠进行三等分迷宫测试其学习记忆能力,3个实验各自独立。主要观察指标:①各组海马区脑损伤组织病理学检测。②各组结扎侧海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的表达。③三等分迷宫试验结果。结果:实验纳入大鼠114只,全部进入结果分析。①各组海马区脑损伤组织病理学检测:假手术组双侧海马区组织无水肿、坏死,神经细胞形态正常,神经细胞数为(87.7±0.6)×103/高倍视野。模型组24h时结扎侧海马区水肿,细胞周围间隙增宽,神经细胞数减少为(68.8±3.0)×103/高倍视野,与假手术组比较差异显著(P<0.01);5d时结扎侧海马体积缩小,锥状细胞层紊乱,神经细胞稀少至(48.7±2.2)×103/高倍视野,与假手术组及同侧24h时比较均有显著差异(P<0.01)。黄芪治疗组24h时结扎侧海马区组织水肿较模型组明显减轻,5d时可观察到完整的海马形态,此两时间点神经细胞死亡率均较模型组明显减低(P<0.01)。②各组结扎侧海马半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的表达:假手术组以低水平表达,吸光度值为0.220±0.009。模型组于缺氧缺血后逐渐升高,6h时比假手术组升高11%,至24h时mRNA水平达高峰,较假手术组约升高260%(P<0.01),高峰持续至48h后下降,5d和7d时恢复基础水平。黄芪治疗组变化趋势与模型组相似,但在24,48h两时间点时峰值降低了44%～46%,与模型组比较差异显著(P<0.01)。③三等分迷宫试验结果:与模型组比较,黄芪治疗组达到学会标准所需训练次数明显减少犤(45.7±2.7),(16.1±2.5)次,P<0.01犦,缺氧缺血24h后记忆保持率显著提高犤(48.3±11.7),(80.0±9.0)%,P<0.01犦。结论:黄芪可以有效抑制未成熟脑缺氧缺血损伤后海马区神经细胞的凋亡,提高神经细胞存活率,此种保护作用与抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表达有关。同时黄芪能够明显改善未成熟脑缺氧缺血损伤后的学习记忆能力。     

缺氧缺血脑损伤大鼠脑神经结构与突触素表达的变化

目的 研究大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）后脑神经结构与突触素表达的变化.方法 将7日龄SD大鼠分为HIBD组和假手术对照组.采用单侧颈总动脉结扎术建立缺氧缺血性脑损伤大鼠模型,于脑缺氧缺血后1,4,7,14,28 d采集脑组织标本,进行HE染色和透射电镜观察其组织病理学及神经超微结构变化,并用免疫组化技术检测大鼠脑皮质及海马CA1区突触素的表达.结果 HIBD组脑损伤后神经元突起呈灶性坏死,突触数量减少、结构破坏;同时突触素的表达逐渐增高,至7 d达到高峰;而后开始下降,至28 d明显低于相应对照组（P〈0.001）.假手术对照组突触素表达水平则随日龄增加逐渐增高（P〈0.001）.结论 缺氧缺血性脑损伤可影响发育期脑组织神经结构与突触素的表达,损伤后两周内脑神经具有较强的突触可塑性.     

к阿片受体选择性激动剂U50488H对心肌梗死大鼠血管紧张素Ⅱ、内皮素和一氧化氮的影响

目的:采用选择性к阿片受体激动剂U50488H激活κ阿片受体,观察其对缺血再灌注大鼠心肌梗死面积以及血管紧张素Ⅱ、内皮素和NO的影响。方法:实验于2002-03/2003-05在解放军第四军医大学生理学教研室完成。选用健康雄性成年SD大鼠32只,随机分为4组(n=8):①对照组:未结扎冠状动脉左前降支。②缺血再灌注组:结扎冠状动脉左前降支,给予心肌缺血45min,并再灌注15min。③U50488H组:预先给予U50488H1.5mg/kg,15min后造模,方法同缺血再灌注组。④Nor-BNI组:在给予U50488H10min前先给予选择性к阿片受体阻断剂Nor-BNI0.5mg/kg,余同U50488H组。观察各组大鼠心肌超微结构、心肌梗死面积以及血浆肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶、血管紧张素Ⅱ、内皮素和一氧化氮等因子的水平。结果:32只大鼠进入结果分析。①心肌梗死面积:U50488H组小于缺血再灌注组和Nor-BNI组[(0.039±0.01),(0.085±0.01),(0.077±0.02)cm2,P<0.01],后两组差异不显著。②血浆中肌酸磷酸激酶和乳酸脱氢酶活性:缺血再灌注组大鼠高于对照组(P<0.01),U50488H组明显低于缺血再灌注组(P<0.01)。③血管紧张素Ⅱ水平:缺血再灌注组大鼠高于对照组[(305±38),(134±26)ng/L,P<0.01],U50488H组明显低于缺血再灌注组[(197±23)ng/L,P<0.01]。④内皮素:缺血再灌注组大鼠高于对照组[(366±32),(179±24)ng/L,P<0.01],U50488H组明显低于缺血再灌注组[(242±27)ng/L,P<0.01]。⑤一氧化氮浓度:缺血再灌注组大鼠低于对照组[(21±6),(58±9)mol/L,P<0.01],U50488H组明显高于缺血再灌注组[(44±8)mol/L,P<0.01]。结论:U50488H可通过激活心脏к阿片受体发挥心脏保护作用,并可以减少心肌酶的漏出,下调血管紧张素Ⅱ、内皮素水平以及上调一氧化氮水平。     

早期运动干预对脑缺血缺氧幼鼠海马区突触素蛋白表达的影响

目的 观察早期运动干预对缺血缺氧性脑损伤（HIBD）幼鼠大脑海马区神经元突触素(Syn)蛋白表达及尼氏体的变化,探讨HIBD早期运动干预的疗效机制。 方法 取3窝新生7d的幼鼠35只,按随机数字表法分为对照组（11只）、干预组（13只）和假手术组（11只）。制作新生Wistar大鼠幼鼠HIBD模型。干预组造模成功后7d开始早期运动干预,每天游泳10min,持续14d;对照组只造模不进行运动干预;假手术组只分离左侧颈总动脉但不结扎,不进行运动干预。采用免疫印迹（Western blot）法检测大脑海马区Syn蛋白的表达水平,以Syn和β带灰度值的比值表示syn蛋白相对表达量;采用尼氏染色方法依据形态学结果观察幼鼠海马区神经元尼氏体数量和细胞形态。 结果 对照组病灶侧海马组织Syn表达(0.447±0.141)较假手术组左侧海马组织Syn表达(1.027±0.035)显著降低(P<0.01)、海马区神经元尼氏体明显减少;干预组病灶侧海马区Syn表达(0.772±0.121)较对照组病灶侧海马组织Syn表达(0.447±0.141)明显升高(P<0.05)、海马区神经元尼氏体显著增多。 结论 早期运动干预可增强缺血缺氧幼鼠病灶侧海马区Syn蛋白的表达和增加神经元内尼氏小体数量。