宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株的构建

ＦＳ５４是本室构建的宋内氏福氏２ａ双价志贺氏菌杂交株，具有志贺氏菌的毒力。本研究通过遗传重组，给ＦＳ５４株引入了ａｒｏＤ基因的转座于Ｔｎ１０插入失活物（ａｒｏＤ：：Ｔｎ１０），构建了ＦＳ５４株的芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株，并进一步去除了Ｔｎ１０所携带的四环素抗性和宋内氏１相大质粒（ｐＳＳ１２０：：Ｔｎ５）上所携带的卡那霉素抗性，得到了宋内氏福氏２ａ双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株Ｆｓ５４－７ｂ．     

宋内氏福氏2a双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株的生物学特性

ＦＳ５４－２、ＦＳ５４－３、ＦＳ５４－４、ＦＳ５４－５、Ｐｓ５４－６、ＰＳ５４－７及ＦＳ５４－７ｂ等株为本室构建的宋内氏福氏２ａ双价志贺氏菌芳香族氨基酸营养缺陷型减毒株，不但其Ｔｎ１０所携带的四环素抗性已消除，ＦＳ５４－７ｂ株的Ⅰ相大质粒Ｔｎ５所携带的卡那霉素抗性亦已消除。本文为在此基础上，进一步对双价减毒株的侵入力、毒力、免疫原性与免疫保护性及遗传稳定性等进行的研究，证明双价减毒株仍保持了入侵肠上皮细胞的能力，动物实验安全低毒，有很好的免疫原性，对小白鼠有很好的双重免疫保护性。此株显示了良好的应用前景。     

福氏2a宋内氏双价痢疾菌aroD基因缺失减毒株FS－5441的构建

通过Ｐｌｋｃ噬菌体将Ｔｎ１０插入灭活的ａｒｏＤ基因片段导入双价有毒痢疾菌ＦＳ－１５中，构建了该株的芳香族氨基酸营养缺陷减毒株，并通过Ｂｏｃｈｎｅｒ培养基去除Ｔｎ１０所携带的四环素抗性，经原位杂交从中检测到ａｒｏＤ基因缺失株ＦＳ－５４４１。该株稳定表达福氏及宋内氏双价Ｏ抗原，Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ显示该株表达Ｉｐａ蛋白，具有穿入ＨｅＬａ细胞的能力，穿入率为１９％。营养缺陷表型的回复突变率小于１０￣（－１１）。小白鼠毒力试验证明安全无毒，免疫小白鼠后对福氏及宋内氏毒株的攻击具有保护活性。     

志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力,免疫原性？…

目的 研制多价、安全、高效和无抗生素抗性的志贺氏菌疫苗。方法 利用动物模型，评价志贺氏菌双价疫革个性选株ＤＯＭ３的残余毒力、免疫原性和保护力。结果 ＤＯＭ３的残余毒力分别比野生型毒株Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ３０１和ＳｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅＩ１１２低１２０倍和５７倍，８７３和１９５倍（ＳＰＦＢＡＬＢ／ｃ小鼠）。ＤＯＭ３丧失了侵袭上皮细胞的能力。ＤＯＭ３具有和Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ２ａ３０１几乎相同的免     

志贺氏菌双价疫苗候选株DOM3的残余毒力、免疫原性和保护力

目的 研制多价、安全、高效和无抗生素抗性的志贺氏菌疫苗. 方法 利用动物模型,评价志贺氏菌双价(S.flexneri 2a -S.dysenteriae I)疫苗候选株DOM3的残余毒力、免疫原性和保护力.结果 DOM3的残余毒力分别比野生型毒株S.flexneri 2a 301和S.dysenteriae I 112低120倍和57倍(昆明系小鼠),873和195倍(SPF BALB/c小鼠).DOM3丧失了侵袭上皮细胞的能力.DOM3具有和S.flexneri 2a 301几乎相同的免疫原性,但较S.dysenteriae I 112 的免疫原性略差.皮下免疫小鼠血清中特异性抗体IgA、IgG滴度峰值出现在最后一次皮下注射的第2周, 而IgM滴度峰值出现在第1周, 然后滴度逐步下降, 在6周后趋于稳定.血清中同时具有抗S.flexneri 2a 菌和抗S.dysenteriae I 菌的抗体, 且其滴度变化的趋势基本一致.使用昆明系小鼠,以30 LD50(6.13×107CFU) 的野生型毒株S.flexneri 2a 301和21 LD50(6.26×107 CFU) 野生型毒株S.dysenteriae I 112 攻击,保护率分别为90%和70%; 使用SPF BALB/c小鼠,以20 LD50(1.38×106 CFU)的 S.flexneri 2a 301和23 LD50( 6.95×106 CFU )的S.dysenteriae I 112攻击,保护率分别为100%和80%;与生理盐水和E.coli LE392对照比较,差异均具有显著性(P＜0.05). 结论 志贺菌双价疫苗候选株DOM3是一株有希望的疫苗候选株,为今后DOM3的安全性和免疫原性志愿者试验及疫苗改进提供了依据.     

志贺菌福氏2a301菌株torA基因改变的研究

目的探讨志贺菌福氏2a301菌株torA基因的改变以及与TorA(trimethylamine N-oxide TMAO reduetase，三甲胺N-氧化物还原酶)转运相关的TAT分泌系统的存在。方法利用酶活性检测和Western blot方法来验证志贺菌福氏2a301测序菌株torA基因发生的碱基置换，并且利用正常大肠杆菌中torA基因的克隆转化来研究TAT分泌系统的存在。结果实验表明志贺菌福氏2a301菌株不具有TorA酶活性，不表达TorA蛋白，和序列分析的结果相符；但是，将torA基因克隆子转化入301菌株后，转化子获得了TorA酶活性，表达了TorA蛋白。结论在志贺菌福氏2a301菌株中torA基因发生了改变，但具有完整的TAT分泌途径，可以转运蛋白。     

改良SELEX技术筛选福氏志贺菌2a特异性适配体

目的:构建与福氏志贺菌2a高亲和性、特异性结合的DNA寡核苷酸适配体库.方法:体外合成76 nt高通量随机序列的单链DNA寡核苷酸文库(ssDNA),运用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria SELEX),福氏志贺菌2a作为靶标与文库ssDNA反应;通过优化PCR反应,将Lambda酶外切及葡...     

志贺氏菌常见菌单克隆抗体的制备和应用

本文利用杂交瘤技术,参照现抗原表,建立了一组能稳定分泌抗志贺氏菌常见菌型的单克隆抗体杂交瘤细胞系共42株,从中选用了包括抗福氏菌群全部型和群抗原抗志贺氏菌Ⅰ、Ⅱ型及宋内氏菌的单克隆抗体细胞系19株。用这组单克隆抗体组成的小套试剂盒,经以实验室标准菌种及4个省市地方菌种验证。结果表明完全可以代替传统的诊断血清,用于志贺氏菌的检验。另外表明,抗福氏志贺氏菌型群抗原的单克隆抗体还可进一步用于该菌抗原关系的分析。     

宋内志贺氏菌I相大质粒的定向改造和透动转移

本文通过全细胞PCR克隆了宋内志贺氏菌侵袭性I相大质粒上的virG基因的部分片段（virG),并用天冬氨酸半醛脱氢酶基因（asd)取代了virG的中间部分,随之插入自杀性诱动质粒pXL275中,获得重组质粒pKNVA1。通过细菌间交配和体内同源重组,pKNVA1整合至I想大质粒中,在另一温度敏感的结合转移质粒pTH10的帮助下,共整合质粒被诱动转移至福氏志贺氏菌FWL01和大肠杆菌X6097中,并通过氯霉素富集和蔗糖反选择使自杀质粒pKNVA1从大质粒上脱落下来,玻片凝集试验和大质粒电泳图谱证实了宋内I相大质粒的成功诱动转移,表明这是一种定向转移大质粒行之有效的方法。     

宋内志贺氏菌I相大质粒的定向改造和诱动转移

本文通过全细胞PCR克隆了宋内志贺氏菌侵袭性I相大质粒上的virG基因的部分片段(virG*),并用天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)取代了virG*的中间部分,随之插入自杀性诱动质粒pXL275中,获得重组质粒pKNVA1.通过细菌间交配和体内同源重组,pKNVA1整合至I相大质粒中,在另一温度敏感的结合转移质粒pTH10的帮助下,共整合质粒被诱动转移至福氏志贺氏菌FWL01和大肠杆菌X6097中,并通过氯霉素富集和蔗糖反选择使自杀质粒pKNVA1从大质粒上脱落下来,玻片凝集试验和大质粒电泳图谱证实了宋内I相大质粒的成功诱动转移,表明这是一种定向转移大质粒行之有效的方法.     

福氏2a志贺菌磷酸烯醇丙酮酸盐合成酶基因的克隆与序列分析

目的：福氏2a志贺菌301株染色体编码与代谢相关的酶类基因，分析结构特点并进行同源性比较，以期部分阐明其与大肠杆菌生化特性相似的分子生物学基础。方法：鸟枪法随机克隆福氏2a志贺菌染色体DNA，经探针杂交和末端核苷酸序列测定筛选出带有磷酸烯醇丙酮酸合成酶（pps）完整基因的阳性克隆，利用exouclease Ⅲ制备嵌套缺失体亚克隆，采用双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列。结果：福氏2a志贺菌301株pps基因（全长2474bp）与大肠杆菌pps基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分别为98．8％和97．6％。编码区上游和下游存在较多变异。福氏2a志贺菌301株pps基因与GenBank中其它菌株pps基因的同源性均低于55％。结论：福氏2a志贺菌pps基因苷酸序列与大肠杆菌pps基因核酸序列高度同源。     

志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(DnaK)多克隆抗体的制备和鉴定

目的制备小鼠抗志贺菌福氏5a M90T热休克蛋白70(Dna K)的多克隆抗体,并鉴定其特异性和效价。方法 PCR扩增M90T中的基因dna K插入到原核表达载体p ET-24a中,获得p ET24a-dna K重组质粒,然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和柱纯化融合蛋白Dna K-His。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采集抗血清。用免疫印迹法、ELISA和免疫荧光技术鉴定抗血清的特异性和效价。结果重组质粒p ET24a-dna K在大肠杆菌BL21(DE3)中可以高效表达。用纯化的融合蛋白Dna K-His免疫小鼠制备得到的多克隆抗体能特异性低检测志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白,能有效地用于免疫印迹法、ELISA和免疫荧光等试验。结论成功制备了抗志贺菌福氏5a M90T Dna K蛋白的小鼠多克隆抗体。     

唐山地区福氏志贺菌超广谱β-内酰胺酶基因型和同源性的分析简

 目的 了解唐山地区福氏志贺菌的耐药特征,明确其所携带超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的基因型和菌株之间的相关性。 方法 用纸片扩散法作ESBLs确证试验;对产ESBLs的菌株用微量肉汤稀释法测定其MICs;用PCR扩增ESBLs基因并测序;通过可变数目串联重复序列（VNTR）进行同源性分析。 结果 用纸片扩散法检出具有ESLBs表型的19菌株株,经琼脂稀释法检测,同样具有ESBLs表型。菌株对头孢曲松、头孢噻肟、头孢哌酮、哌拉西林、阿莫西林-克拉维酸和环丙沙星的不敏感率为95%~100%,对其它药物敏感率均在84%以上。其型别主要为CTX-M-14、CTX-M-3、CTX-M-57和TEM-1。 同源性分析19株福氏志贺菌分为4个克隆系。结论 唐山地区儿童福氏志贺菌呈多重耐药,对第3代头孢菌素耐药性有增加趋势,所携带基因型主要为CTX-M-14,首次检出CTX-M-57基因型。唐山地区存在遗传紧密相关的福氏志贺菌流行克隆,也存在不相关克隆。