自身核抗原U1SnRNP70kD多肽分子中U1RNA结合功能区的cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身核抗原Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽分子中Ｕ１ＲＮＡ结合功能区（Ｕ１ＲＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，Ｕ１ＢＤ）的ｃＤＮＡ，经ＤＮＡ测序证实以后定向插入原核表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，进而导入大肠杆菌中表达重组蛋白。免疫印迹法研究表明：９６％（４８／５０）的抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清能够识别该重组蛋白，证实Ｕ１ＢＤ重组蛋白具有Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗原性，而且Ｕ１ＢＤ是Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ多肽上主要抗原表位区域，能够被大多数抗Ｕ１ＳｎＲＮＰ７０ｋＤ抗体阳性血清识别。这为今后对Ｕ１ＢＤ抗原表位精确定位，分析特定抗原表位与疾病的相关性以及制备重组抗原用于临床检测等研究奠定基础。     

自身核抗原U1RNP 70 kD多肽全长基因克隆及鉴定

应用逆转录ＰＣＲ方法从Ｈｅｌａ细胞中成功地克隆了编码自身核抗原Ｕ１ＲＮＰ７０ｋＤ多肽的全长基因，将此基因重组入原核表达载体系统ＰＧＥＸ－２Ｔ中，以限制性酶切及核苷酸测序鉴定扩增的ＤＮＡ片段，经计算机分析，基因全长１．３ｋｂ，编码４３７个氨基酸，并进行了基因同源性比较。结果表明，克隆得到的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ报道的完全一致，蛋白质一级结构分析表明编码的７０ｋＤ多肽在羧基片段有３个可能的抗原性区域，该多肽的抗原表位可能主要存在于羧基半段上，为重组蛋白的表达及抗原表位的定位研究奠定基础。     

乙型肝炎病毒preS抗原在大肠杆菌中的高效表达与鉴定

利用ＰＣＲ和基因重组技术构建了乙型肝炎病毒完整ｐｒｅＳ抗原高效表达克隆，该克隆在大肠杆菌中表达一分子量约３１ｋＤ的融合蛋白，由ＭＳ２、白细胞介素３Ｎ端１４个氨基酸接头和ｐｒｅＳ抗原组成，在ＩＬ－３Ｎ端与ＭＳ２连接处有凝血酶识别位点，可被该酶切开。     

APAAP免疫印迹技术对抗副流感病毒1，3型单克隆抗体识别抗原表位的研究

副流感病毒１，３型（ＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓｔｙｐｅ１，３：ＰＩＶ＿１．３）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）应用免疫印迹技术（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）识别抗原表位特性。结果表明：ＰＩＶ＿１．３抗原经还原剂处理后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ５％～１５％梯度胶电泳，能分辨二十多条清晰的蛋白带。转印后采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶复合物（ＡＰＡＡＰ）染色，本底浅，呈玫瑰红色带，优于ＨＲＰ染色结果。ＰＩＶ＿１的５株ＭｃＡｂ：ＩＣ＿５、ＩＨ＿６、ＩＨ＿２、ＩＣ＿１０、３Ｄ＿５分别与６８ｋＤ～５０ｋＤ、６８ｋＤ、５８ｋＤ～２７ｋＤ、５５ｋＤ～５０ｋＤ、５０ｋＤ对应ＰＩＶ＿１的蛋白质抗原表位起反应。ＰＩＶ＿３的６株ＭｃＡｂ：２Ａ＿１０、５Ｇ＿３、２Ｄ＿１１、２Ｅ＿１０、２Ｂ＿１２、４Ｆ＿１２与７０ｋＤ、６８ｋＤ、６０ｋＤ～５０ｋＤ、５５ｋｐ～４０ｋＤ、５５ｋＤ、４０ｋＤ对应的蛋白质抗原表位特异结合，说明ＰＩＶ＿１．３的１１株ＭｃＡｂ同对应抗原表位点的结合分布较广，有利于对ＰＩＶ＿１．３抗原的快速、敏感、特异检测。     

人源肠毒素大肠杆菌CS3纤毛基因的克隆及表达

Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹结果证明在ＣＦＡ／Ⅱ阳性菌Ｅ４４８１５的诸多质粒中，编码ＣＳ３纤毛抗原的质粒为一约为６０ＭＤ的大质粒；当这些质粒用ＨｉｎｄⅢ消化时，该抗原的编码基因位于５．０ｋｂ的ＤＮＡ片段上。回收该片段并插入到载体质粒ｐＢＲ３２２的ＨｉｎｄⅢ位点，构建了Ｅ．ｃｏｌｉＥ４４８１５株质粒的有限基因库。通过筛选，获得了两种插入方向的阳性重组子。全细胞ＥＬＩＳＡ测定结果表明，只有当插入片段的转录方向和载体质粒中的ｐ１启动子的转录方向一致时，重组质粒才能有效地表达ＣＳ３纤毛抗原；宿主不同时表达水平存在一定差异。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹试验表明：ＣＳ３纤毛抗原有两种不同的单体形式，分子量大约分别为１５．０ｋＤ和１５．５ｋＤ。ＣＳ３纤毛抗原编码基因的克隆为研究ＣＳ３基因表达调控和研制预防ＥＴＥＣ腹泻疫苗打下了基础。     

自身核抗原U1SnRNP 70kD多肽分子中U1RNA结合功能区的cDNA克隆…

本研究采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身核抗原Ｕ１ＳｎＲＮＰ ７０ｋＤ多肽分子中Ｕ１ＲＮＡ结合功能区的ｃＤＮＡ，经ＤＮＡ测序证实以后定向插入原核表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ，进而导入大肠杆菌中表达重组蛋白。     

自身核抗原U1RN70kD多肽全长基因克隆及鉴定

应用逆转录ＰＣＲ方法从Ｈｅｌａ细胞中成功地克隆了编码自身核抗原Ｕ１ＲＮＰ７０ｋＤ多肽的全长基因，将此基因重组入原核表达载体系系统ＰＧＥＸ－２Ｔ中，以限制性酶切及核苷酸测定鉴定扩增的ＤＮＡ片段，经计算机分析了基因全长１．３ｋｂ，编码４３７个氨基酸，并进行了基因同源性比较。结果表明，克隆得到的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ报道的完全一致，蛋白质一级结构分析表明编码的７０ｋＤ多肽在羧基片段有３个可能的抗原性区域。     

人Ⅱ型免疫缺陷病毒gag基因在大肠杆菌中的表达

目的：表达ＨＩＶ－２基因工程ｇａｇ抗原。方法：将编码ＨＩＶ－２型ｇａｇ的部分和全部ｐ５５ｇａｇ１／２基因,克隆到载体ｐＥＴ－１７ｂ后,分别在Ｅ．Ｃｏｌｉ ＢＩ２１中表达。结果;表达产物为５１和６１ｋＤ融合蛋白,并可与ＨＩＶ－２病人血清发生特异性反应。     

抗胃癌鼠单抗3G9 Fab段基因的克隆及其在大肠杆菌…

本文报道用聚合酶链延伸反应（ＰＣＲ）从分泌抗胃癌鼠单抗的杂交瘤细胞系３Ｇ９中克隆出了重链Ｆｄ段和ｋ链的基因。ＤＮＡ序列测定表明３Ｇ９的ＶＨ、Ｄ、ＪＨ分别属于ＶＨ７１８３、ＤＦＬ１６．１和ＪＨ３；Ｖｋ和Ｊｋ分别属于ＶｋⅡ和Ｊｋ２。将３Ｇ９Ｆｄ段和ｋ链ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣｏｍｂ３中，在大肠杆菌中获得了表达，用还原和非还原的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳作免疫印迹实验，证明了Ｆａｂ段的表达。并用酶联免过滤实     

自身抗原SSA/Ro-52kD抗原优势表位分析

探讨自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位,为疾病机制的研究提供依据,根据计算机软件进行的蛋白质序列结构分析。采用ＰＣＲ法克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ多肽片段的ｃＤＮＡ,定向插入表达载体ＰＧＥＸ－５Ｘ－１,并且导入大肠杆菌中表达重组融合蛋白,用ＧＳＴ亲和层析柱进行纯化,经免疫印迹法与病人阳性血清进行反应,结果表明片段Ｒｏ５２３具有较强的抗原性,这提示ＳＳＡ／Ｒｏ－５２ｋＤ的抗原优势表位     

巨型艾美耳球虫孢子化卵囊抗原免疫原性的研究

用脂质体包裹Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ孢子化卵囊抗原给鸡口服免疫，以１０３个孢子化Ｅ．ｍａｘｉｍａ卵囊／只的剂量攻毒，可使鸡获得４６％的保护力。ＥＬＩＳＡ检测结果表明，鸡体在免疫后产生了特异性抗体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明，所提取Ｅ．ｍａｘｉｍａ孢子化卵囊可溶性抗原至少有１６条带，其中８条主带分子量分别为：＞９７．４ｋＤ、４７．９ｋＤ、４２．７ｋＤ、３５．５ｋＤ、２９．５ｋＤ、２３．４ｋＤ、１３．５ｋＤ、１０．５ｋＤ。用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明，口服活卵囊初次免疫１４ｄ后的鸡血清，可识别出４条带，其分子量分别为：＞９７．４ｋＤ、６０．３ｋＤ、４７．９ｋＤ、４２．７ｋＤ。     

从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更 …

目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库,并用大肠癌相关抗原ＣＡ－Ｈｂ３筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆ＥＬ５Ｄ、ＥＬ６Ｄ和Ｃａｌ２,测定３个克隆的核苷酸序列,并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为２２０、５００、５００ｂｐ。测序结果表明,ＥＬ６Ｄ和Ｃａ１２属ＶＨ５－Ｄ－ＪＨ４,仅为ＶＨ结构亚单位,而ＥＬ５Ｄ属Ｖｋ的Ｊｋ１,     

正常人肝细胞膜HBV—PHSA受体相关抗原及特性

用蔗糖密度梯度离心法纯化ＰＨＳＡ受体阳性的正常人肝细胞膜（ＨＰＭ），通过Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ技术发现抗ＨＢＶ ＰｒｅＳ２（１２０～１４５）合成肽多克隆抗体可识别到两种抗原成份（７０ｋＤ和１２０ｋＤ）。用蛋白酶Ｋ、脂肪酶、神经氨酸酶消化ＨＰＭ后再进行Ｗｅｓｔｅｒｎ识别，结果表明这两种抗原成份分别具有糖脂蛋白和糖蛋白的性质。由于已知抗ＰｒｅＳ２（１２０～１４５）是针对ＨＢＶ ＰＨＳＡ受体抗原表位的     

表达人自身抗原SSA/Ro60重组体的构建及鉴定

目的：构建表达人自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０的重组体,为研究自身免疫病中的抗原体作用提供物质基础。方法：采用逆转录－ＰＣＲ技术克隆自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０ ｃＤＮＡ,定向插入表达载体ＰＧＥＸ－２Ｔ,并经酶切电泳,ＤＮＡ测序鉴定分析。结果：经鉴定,证明成功构建了表达人自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０的重组体。结论：ＳＳＡ／Ｒｏ６０表达型重组体可用于自身抗原ＳＳＡ／Ｒｏ６０的大量生产并用于诊断。     

新的识别人活化B细胞分化抗原5C5单克隆抗体（5C5－G＿1）的制备和鉴定

新制备的抗人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５单克隆抗体５Ｃ５－Ｇ＿１经Ｗｅｓｔｅｒ印迹分析表明，该分化抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（还原条件下）显示五条带，分子量分别为９２ｋＤ、５２ｋＤ±（两条）、４０ｋＤ和２０ｋＤ。用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ＿１的混合物，从３Ｄ５细胞的λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库中筛选到７个阳性ｃＤＮＡ克隆。     

中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化

目的：获得原核表达的中国版纳猪ＳＬＡＩ类Ｐ１蛋白质分子。方法：ＰＣＲ扩增去信号肽的ＳＬＡＩ类Ｐ１ｃＤＮＡ序列，亚克隆至ｐＧＥＭＴ载体，测序。将亚克隆的Ｐ１　ｃＤＮＡ片段插入表达载体ｐＥＴ４２ｂ（＋），构建重组表达质粒ｐＥＴ－４２ｂ（＋）／ｓｌａ－ｐｌ，转化Ｅ·ｃｏｌｉ表达菌 ＢＬ２１－ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）－ＲＩＬ，ＩＰＴＧ诱导 Ｐ１－８ ｘ ｈｉｓ融合蛋白表达，经包涵体洗涤，８ ｍｏｌ／Ｌ尿素变性溶解，Ｎｉ２＋亲和层析，梯度透析后，定量保存。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果：目的蛋白（分子量３９．５ ｋＤ）表达量占细菌总蛋白 １５％，每升表达菌获得纯度９５％的目的蛋白 ４０ ｍｇ～６０ｍｇ。结论：成功建立猪 ＳＬＡ分子全长原核表达、纯化体系，为建立间接识别猪移植抗原ＳＬＡＩ类分子的人Ｔ细胞系及表位分析打下基础。     

抗人VEGF165单链抗体的构建与表达

为降低鼠源抗体对人体的免疫原性,构建表达了ＶｍＤ１１的单链抗体。方法用ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ构建出单链抗体的基因,克隆入表达载体ｐＫｐＬ－３ａ,在大直菌ｏｐｏ２１３６中表达,采用抗原结合ＥＬＩＳＡ和竞争抑制ＥＬＩＳＡ测定活性。结果经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测,诱导后的细菌表达了２６ｋＤ的蛋白;ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ证实该蛋白为表达的单链抗体。经变性,复性后,该单链抗体可特异结合人ＶＥＧＦ１６５抗原,并与Ｖ     

SS—A／Ro抗原分子生物学特性及其临床意义

ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗原为细胞内ＲＮＡ－蛋白质复合体的一种，依赖细胞功能状态的不同分别存在于细胞核和细胞浆内。该抗原主要由连接四种ＲＮＡ（ｈＹ１，ｈＹ３，ｈＹ４，ｈＹ５）的５２ＫＤ和６０ｋＤ蛋白多肽组成。ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗原自身抗体存在于多种结缔组织疾病中，尤其是系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）及干燥综合症（ＳＳ）。ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗体可作为新生儿红斑狼疮（ＮＬＥ）的血清学标志，在病理过程中可能起一定作用。ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗原分子克隆的成功不仅为研究该抗原的结构特征提供了新的手段而且提供了大量用于检测ＳＳ－Ａ／Ｒｏ抗体的纯化抗原。     

7型腺病毒疫苗株76.5～87mu核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）７６５－８７ｍｕ核苷酸序列，分析该区段的基因结构和功能。方法从Ａｄ７疫苗株克隆出６８－８７ｍｕ核苷酸片段，应用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法进行核苷酸序列分析。结果Ａｄ７ｖ７６５～８７ｍｕ核苷酸序列长度为３５５７ｂｐ，推测此片段编码Ｅ３区１２１ｋＤ、１９２ｋＤ、２０１ｋＤ、２０５ｋＤ、１０３ｋＤ和１５２ｋＤ蛋白的一部分。所编码的６个蛋白与Ａｄ７原型株（Ａｄ７ｐ）和Ａｄ７ｈ（１９８６年以来南美流行的毒株）核苷酸高度同源（大于９７２％）。１６１ｋＤ蛋白由于缺失一个核苷酸，造成移码突变，编码提前终止。编码７７ｋＤ蛋白的ＯＲＦ由于缺失一段核苷酸而提前终止编码。结论这一结果为阐明Ａｄ７的基因结构与功能并为构建Ａｄ７载体时对Ｅ３区缺失提供依据     

大鼠重组中枢型乙酰胆碱转移酶单克隆抗体的制备(英文)

利用分子生物学方法制备了大鼠中枢型乙酰胆碱转移酶（ｃＣｈＡＴ）的单克隆抗体并利用免疫组织化学等方法进行了检测。以大鼠纹状体ｃＤＮＡ 为模板，扩增出长度为７１５ ｂｐ 的大鼠ｃＣｈＡＴ 基因片段（含外显子６～１０）。将该片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ 载体中进行测序，将碱基序列正确的ｃＣｈＡＴ ｃＤＮＡ 片段定向插入ｐＭ ＡＬ－ｃ２ 载体中，构建成表达载体。利用ＤＮＡ测序对连接部位的阅读框架进行分析，未出现移码突变。将表达载体转化大肠杆菌并经诱导表达了分子量为６９ ｋＤａ 的融合蛋白，其大小与用表达载体的氨基酸序列所推导的分子量一致。用纯化后的融合蛋白作为抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠，并获得了Ｍ ａｂ６７６ 克隆。利用Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法对其进行分析表明该克隆能识别大鼠脑组织提取物中分子量为６２ ｋＤａ 的蛋白成分，这与大鼠脑中ＣｈＡＴ 分子量的大小一致。利用此单克隆抗体进行免疫组织化学反应的阳性结构见于纹状体、苍白球、Ｂｒｏｃａ氏斜角带核、无名质、内侧隔核以及脑干的脑神经运动核等胆碱能神经元的聚集区。上述结果表明本研究所制备的单克隆抗体具有识别大鼠ｃＣｈＡＴ 的特异性。