α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致 Parkinson病多巴胺能神经细胞损伤机制奠定基础     

共表达MAGE-1与EGFP基因的小鼠黑色素瘤细胞系的建立

目的 :构建黑色素瘤抗原 1(MAGE 1)基因的真核表达载体 ,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中进行表达。方法 :采用分子生物学的手段 ,构建了MAGE 1与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因共表达的质粒pIRES2 EGFP MAGE 1,通过脂质体以共表达质粒转染B16细胞 ,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达 ,用免疫组化染色法检测细胞中MAGE 1的表达。结果 :成功地构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 1。以其转染B16细胞后 ,经荧光显微镜及免疫组化染色法检测 ,可见细胞内有EGFP及MAGE 1的表达。结论 :成功地建立了可共表达MAGE 1与EGFP基因的B16细胞 ,为MAGE 1在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。     

α-突触核蛋白在体外培养SH-SY5Y细胞内过表达可导致氧应激

目的：观察α-突触核蛋白基因在SH-SY5Y细胞内过表达对细胞的影响。 方法： LipofectAMINE法转染SH-SY5Y细胞，用G418对转基因细胞进行筛选，免疫荧光细胞化学检测α-突触核蛋白表达，氧化应激敏感的荧光素探针DCF-DA对活细胞进行染色后用荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内氧应激状况，还原型谷胱甘肽测定试剂盒通过分光光度计检测细胞内还原型谷胱甘肽水平。 结果： 转染细胞筛选后，细胞呈α-突触核蛋白免疫反应阳性；转α-突触核蛋白基因细胞内存在DCF信号增强和还原型谷胱甘肽水平下降。 结论： α-突触核蛋白过表达可引起细胞内氧应激，表明α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中可能起重要作用。     

时空调控 miR-195敲减转基因载体的构建及验证

目的：构建时空调控 miR-195敲减转基因载体并验证其活性。方法通过分子克隆技术构建含有神经特异性启动子、四环素诱导表达系统、miR-195海绵、绿色荧光蛋白及绝缘子等调控元件的转基因载体并测序鉴定,利用细胞转染技术将该载体瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞,经荧光显微镜观察其荧光表达,利用实时定量 PCR 技术及蛋白免疫印迹检测miR-195含量及 GFP 蛋白表达。结果通过将 Tet-on 四环素诱导系统中反义转录激活子 rt-TA 克隆到 NSE 启动子下游,以及 TRE-Tight 的多克隆位点内引入 miR-195海绵携带 IRES 介导的 EGFP ,获得双质粒 Tet-on 表达载体。以 pcDNA 3.1＋质粒为骨架,3个不同区域的双拷贝 cHs 4绝缘子核心片段为间隔,将其调控元件（ NSE-rtTA ）和反应元件（ TRE-miR-195 sponge-IRES-EGFP ）串联成单一转基因载体。该载体经测序验证序列正确,瞬时转染入 SH-SY 5 Y 细胞,经强力霉素诱导36 h 后细胞内可见明显绿色荧光蛋白表达,且 miR-195表达水平明显降低。结论成功构建神经系统特异性 miR-195敲减转基因载体,并具有时空调控的特点,为进一步建立转基因动物模型奠定基础。     

人源载体介导的minidystrophin-EGFP融合基因在Cos-7细胞中的表达

目的 构建微小肌营养不良蛋白（minidystrophin）和增强绿色荧光蛋白（enhaneed green fluorese protein，EGFP）融合基因的人源载体，观察该载体在Cos-7细胞中的表达。方法 以正常人肌营养不良基因cDNA（GenBank NM_004006）为模板，通过PCR克隆的方法构建minidystrophin基因，融合EGFP基因后连接到人源载体pHmeo，大量提取荸组质粒，转染Cos-7细胞，通过逆转录聚合酶链反应、荧光显微镜观察等方法检测该载体在细胞内的表达。结果 成功构建pHmDysG载体，转染Cos-7后，逆转录聚合酶链反应可扩增出735bp特异条带，荧光显微镜观察可见表达蛋白分布于细胞膜上。结论 prim载体介导的minidystrophin基因可以在真核细胞表达，并被有效地转运至细胞膜，可望用于杜氏肌营养不良基因治疗的研究。     

VEGF真核表达载体的构建及在内皮与心肌细胞内的表达

目的：探讨外源性人VEGF165基因在内皮细胞与心肌细胞内表达的可行性。方法：构建了(vaseular endothelium growth factor,VEGF)与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因其表达载体pIRES2—FGFP—VEGF165，以脂质体法转染内皮细胞和心肌细胞，采用荧光显做镜检测内皮细胞与心肌细胞中EGFP的表达，同时利用免疫组织化学方法检测VEGF的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pIRES2—EGFP—hVEGF165，采用脂质体法转染内皮细胞与心肌细胞后，经荧光显微镜观察，可见细胞内有EGFP的表达，同时经免疫组化证实有VEGF的表达。结论：采用脂质体法可以成功地将外源性VEGF165基因转染到内皮细胞与心肌细胞中，并进行表达。本研究为今后利用VEGF基因治疗心肌缺血等疾病提供了实验基础。     

EGFP-线粒体蛋白导入载体的构建及功能验证

目的 构建能够将外源蛋白导入真核细胞线粒体的真核表达载体,并且通过增强型绿色荧光蛋白的表达进行示踪.方法 利用多重PCR扩增法将线粒体导肽序列与EGFP序列融合在一起,并插入真核表达载体pcDNA3.1,构建成真核表达载体pcDNA5.1-EGFP.将P53基因分别插入pcDNA5.1-EGFP和pcDNA3.1构建成pcDNA5.1-P53和pcDNA3.1-P53载体.经酶切和测序验证后在脂质体介导下分别将上述载体转染293T细胞,一方面在荧光显微镜下比较绿色荧光蛋白与细胞色素C在细胞内的分布情况,另一方面通过免疫荧光法比较P53蛋白在细胞内的定位.结果 绿色荧光的表达分布与细胞色素C具有一致性,且转染pcDNA5.1-P53载体的细胞内P53蛋白集中在胞质线粒体中,而转染pcDNA3.1-P53载体的细胞内P53蛋白主要分布在细胞核内.结论 成功构建能够将外源蛋白导入线粒体的真核表达载体.     

rhbFGF转染人皮肤成纤维细胞的研究

将重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因上游，并在其5′端加上白介素-4的信号肽序列，形成融合基因，利用脂质体转染原代培养的成纤维细胞，荧光显微镜和蛋白质印迹杂交检测rhbFGF-EGFP融合蛋白的表达，细胞计数法观察bFGF对细胞生长的影响。结果表明成功构建了pEGFP-rhbFGF质粒，并经脂质体介导有效地转入原代培养的人皮肤成纤维细胞内。用G418筛选纯化转基因后的细胞能够向胞外分泌rhbFGF活性物质，明显促进成纤维细胞自身的增殖。表明bFGF基因转染能够稳定有效地促进成纤维细胞的增殖。     

人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表达载体的构建和鉴定

目的 构建表达人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SY5Y细胞系,观测其上调AMPKα2基因的效果.方法 PCR法扩增AMPKα2基因片段,克隆到pEGFP-N1质粒载体上.对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析.用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SY5Y细胞系,经G418筛选阳性克隆后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达.流式细胞仪检测转染重组质粒细胞内ROS变化.结果 经DNA测序和酶切鉴定表明,pEGFP-N1-AMPKα2表达载体构建成功.重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞系后,细胞中AMPKα2蛋白表达量明显增高.SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-AMPKα2后,ROS含量增多.结论 成功构建了人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体.pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞系中的表达,为将来应用其研究AMPK在局麻药致细胞损伤中的作用奠定了基础.     

α-synuclein基因过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚

目的观察α-synuclein过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法将消除终止密码子α-synuclein基因扩增产物连入pGEM T-easy载体，DNA测序证实后亚克隆入增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质2000将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达，HE染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证实并亚克隆入pEGFP-N1质粒后，限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、酶切位点上均符合实验设计。将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光，其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚；免疫荧光细胞化学检测，EGFP阳性细胞同时也表现为α-synuclein免疫反应阳性，某些细胞胞浆内可见α-synuclein免疫阳性产物聚集；HE结果发现一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成，约占细胞总数的10．8％。结论野生型α-synuclein基因过表达可诱导α-synuclein蛋白在HEK293细胞内积聚，胞浆内嗜酸性小体形成。     

EGFP-pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的EGFP-pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定.方法 从pEGFP-N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP-pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到PT67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果 成功构建EGFP-pBABE重组质粒.该质粒转染PT67细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36 h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达.结论 成功构建表达EGFP的EGFP-pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础.     

截短型人bid基因的克隆、表达和促凋亡作用的研究

目的 :探讨截短型bid(truncatedbid ,tbid)基因的表达对Hela细胞的促进凋亡活性。方法 :用RT PCR法克隆人全长bid基因 ,测序正确后 ,通过PCR截去编码N末端 6 0个氨基酸残基的基因 ,而获得tbid基因。将其克隆入含绿色荧光蛋白(GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,用脂质体法转染Hela细胞。通过荧光显微镜、电子显微镜观察和TUNEL检测法 ,检测目的基因的表达对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果 :成功地构建了tbid基因的真核表达载体。以其转染Hela细胞后 ,tbid基因在细胞中得到表达 ,随后引起细胞荧光强度下降 ,生长状况不良甚至死亡。电镜观察及TUNEL检测的结果显示 ,许多细胞呈典型的凋亡特征。结论 :tbid基因的表达可促进Hela细胞的凋亡     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

PD-L2剪切异构体与EGFP融合蛋白的表达及其亚细胞定位研究

目的　探讨PD L2的剪切异构体在哺乳动物细胞的表达和亚细胞定位。方法　以RT PCR方法克隆人PD L2基因的常规剪切体和新型剪切异构体的cDNA ,构建其与EGFP融合的表达载体 ,分别转染K5 6 2细胞进行表达 ,经抗PD L2抗体染色后以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果　从活化的人白细胞中克隆到常规剪切体PD L2Ⅰ和新型剪切异构体PD L2Ⅱ的cDNA ,后者删除了编码胞外区Ig C结构域的外显子 3。进而构建了PD L2Ⅰ EGFP和PD L2Ⅱ EGFP融合蛋白表达载体 ,分别转染K5 6 2细胞。流式细胞仪分析显示 ,转染前者的细胞中既可检测到EGFP的表达又可在细胞膜上检测到PD L2表达 ;而转染后者的细胞中只能检测到EGFP的表达 ,在其细胞膜上不能检测到PD L2表达。共聚焦显微镜观察显示 ,PD L2Ⅰ EGFP主要分布于细胞膜表面 ,PD L2Ⅱ EGFP则主要分布于细胞内。结论　常规剪切体PD L2Ⅰ能正确定位于细胞膜表面 ,而新型剪切异构体PD L2Ⅱ则位于细胞内 ,不能运输至细胞膜 ,提示不同PD L2剪切异构体可能与其功能的调变有关     

增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与轮状病毒（RV）VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布。方法提取A组人RVTB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段。将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况。结果成功构建了融合表达质粒;转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中。结论RVVP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别。     

Bcl-xl基因克隆及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的研究Bcl-xl基因在SH-SY5Y细胞中的表达。方法构建真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,采用脂质体介导将重组质粒导入SH-SY5Y细胞,RT-PCR和Western-blot检测外源基因表达。结果本实验成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP/Bcl-xl,并用脂质体介导的方法高效转染SH-SY5Y细胞,RT-PCR显示有Bcl-xlmRNA表达增加,Western-blot显示有32kD的蛋白质表达增加。结论重组质粒pIRES2-EGFP/Bcl-xl经转染能够在SH-SY5Y细胞中高效表达,为进一步研究Bcl-xl对SH-SY5Y细胞的生物学功能奠定了基础。     

MAGE-3基因稳定转染的HHCC细胞系的建立及其mRNA的表达

目的：构建肿瘤抗原MAGE-3基因的真核表达载体，建立MAGE-3基因稳定转染的人肝细胞癌细胞系（human hepatocellular carcinoma cell line，HHCC）。方法：利用分子生物学方法，构建带有MAGE-3基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-3，经脂质体法转染HHCC后，用G418筛选阳性克隆。在荧光显微镜下观察HHCC中EGFP的表达，用RT-PCR法检测HHCC中MAGE-3 mRNA的表达。结果：成功地构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-3。以其转染HHCC后，经荧光显微镜及RT-PCR分别检测到MAGE-3 mRNA转录和EGFP的表达。结论：建立了1株可稳定转染MAGE-3基因的肝细胞癌HHCC，为进一步应用该基因进行肝癌的免疫治疗提供了实验依据。     

携带增强型绿色荧光蛋白基因的shRNA真核表达载体的构建

目的：构建携带EGFP的shRNA真核表达载体。 方法: 应用PCR的方法从pBSK/U6质粒上扩增出U6启动子及其下游的Xbal、SalI和BamHI酶切位点，并增加NotI位点。将扩增的产物连入pEGFP-C1载体MluI位点处，构建成携带EGFP的siRNA真核表达载体。应用该载体介导针对EGFP的短发夹环RNA（pEGFP/U6/EGFP），转染U251细胞，通过荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP的表达，验证所构建载体在细胞内产生RNA干扰的效果。 结果: 与对照组比较pEGFP/U6/EGFP在细胞内对EGFP的抑制效果达89.8%。 结论: 成功构建携带EGFP的shRNA真核表达载体。     

pLEGFP-N1-基质细胞衍生因子-1α的构建与目的基因在恒河猴骨髓基质细胞内的稳定表达

目的 构建携带人基质细胞衍生因子(SDF)1α基因的反转录病毒真核表达载体pLEGFP-N1-SDF-1α,转染恒河猴骨髓基质细胞(BMSC),观察外源性SDF-1α和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因在BMSC中的表达情况.方法 应用基因重组技术,从pBudce4.1-SDF-1α获得SDF-1α基因片段,重组到pLEGFP-N1真核表达载体上.pLEGFP-N1-SDF-1α经病毒包装,转染至恒河猴BMSC,用Western免疫印迹和免疫细胞化学检测表达情况.结果 酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入基因片段的正确性.BMSC转染pLEGFP-N1-SDF-1α后,在荧光显微镜下发出绿色荧光.western免疫印迹和免疫细胞化学证实SDF-1α在细胞内有效表达.结论 成功构建本研究pLEGFP-N1-SDF-1α,经病毒包装转染至恒河猴BMSC,SDF-1α和EGFP基因在BMSC内有效表达.为BMSC-SDF-1α-EGFP工程细胞自体移植治疗相关疾病提供了依据.     

pLEGFP—N1-基质细胞衍生因子-1α的构建与目的基因在恒河猴骨髓基质细胞内的稳定表达

目的 构建携带人基质细胞衍生因子（SDF）1α基因的反转录病毒真核表达载体pLEGFP-N1-SDF-1α,转染恒河猴骨髓基质细胞（BMSC）,观察外源性SDF-1α和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因在BMSC中的表达情况.方法 应用基因重组技术,从pBudce4.1-SDF-1α获得SDF-1α基因片段,重组到pLEGFP-N1真核表达载体上.pLEGFP-N1-SDF-1α经病毒包装,转染至恒河猴BMSC,用Western免疫印迹和免疫细胞化学检测表达情况.结果 酶切、PCR和DNA序列鉴定均证实插入基因片段的正确性.BMSC转染pLEGFP-N1-SDF-1α后,在荧光显微镜下发出绿色荧光.western免疫印迹和免疫细胞化学证实SDF-1α在细胞内有效表达.结论 成功构建本研究pLEGFP-N1-SDF-1α,经病毒包装转染至恒河猴BMSC,SDF-1α和EGFP基因在BMSC内有效表达.为BMSC-SDF-1α-EGFP工程细胞自体移植治疗相关疾病提供了依据.