I型胶原基因启动子研究进展

I型胶原由 α1(I)链 (COL1A1)与 α2 (I)链 (COL1A2 )组成 ,人 COL1A1与 COL1A2基因的启动子都已鉴定并克隆。调节转录的核因子有 Sp1、NF- 1、AP- 1、CBF、NF- кB、C- myb、c- Krox、BFCOL1、Zf9、Sp3、Smads、TGP、Egr- 1、TWIST与 NP/ NMP4等。在 COL1A1和 /或 COL1A2基因启动子上已鉴定出 TGFβ、糖皮质激素、TNFα、IFNγ与视黄酸等的应答元件     

COL1A1基因PCOL2和Sp1结合位点多态与先天性髋脱位的关联分析

目的 研究Ⅰ型胶原a1链(collagen type Ⅰ alpha 1，COL1A1)基因PCOL2和Sp1结合位点多态性在中国北方人群中的分布，并探讨其与先天性髋脱位(congenital dislocation of the hip，CDH)的关系。方法 在81个CDH核心家系的243名成员中，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法，对位于COLIAI基因启动子内的PCOL2多态(-1997G／T)和转录调控区第1内含子内的Sp1多态(1546G／T)进行基因分型，并进行传递不平衡检验。结果COL1A1，基因PCOL2结合位点G／T多态与CDH不存在明显关联(P=0．537)，中国人PCOL2多态位点的基因型和等位基因频率分布与西班牙白人群和美国白人群差异存在统计学意义；Sp1结合位点只检测到SS基因型，未检测到Ss或ss基因型。结论 COL1A1基因PCOL2和Sp1结合位点多态存在种族差异，PCOL2和Sp1结合位点多态可能与中国人CDH的发病风险无关。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响1

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原(COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响.方法构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～+42bp(0.27kb)与-2483～+42bp(2.5kb)片段.将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性.结果13nmol/LIGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍.2.5μmol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍.TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性.结论IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-α、IFNγ、IFNα能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用.     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人α1(Ⅰ)前胶原启动子活性的影响

目的 :探讨胰岛素样生长因子 1(IGF 1)和胰岛素对人α1(Ⅰ )前胶原 (COL1A1)基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素γ(IFNγ)、干扰素α(IFNα)对这一作用的影响。方法 :构建含COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶 (CAT)报告基因的重组体pCOLH0 2 7与pCOLH2 5 ,它们分别含该启动子序列 2 68～ 4 2bp( 0 2 7kb)与 2 4 83～ 4 2bp( 2 5kb)片段。将这 2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞 ,加入IGF 1或胰岛素 ,部分细胞还加入TNFα或IFNγ或IFNα,测定CAT活性。结果 :13nmol/LIGF 1使转染后的这 2个重组体活性分别增高 3 68倍与 4 0 4倍。 2 5 μmol/L的胰岛素亦使之分别增高 3 69倍与 3 93倍。TNFα、IFNγ、IFNα能降低IGF 1与胰岛素诱导的pCOLH2 5活性。结论 :IGF 1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达 ,TNF α、IFNγ、IFNα能抑制IGF 1和胰岛素的这一作用。     

IL-13和乙醇促进人肺成纤维细胞胶原的表达

目的:研究乙醇和/或白细胞介素13(IL-13)对人肺成纤维细胞(HFL-1)Ⅰ、Ⅲ型胶原α1链基因(COL1A1、COL3A1)以及Ⅰ型胶原蛋白(CoⅠ)表达的影响,探讨肺纤维化的机制。方法:培养HFL-1,通过实时定量荧光RT-PCR检测乙醇和/或IL-13对HFL-1细胞IL-13受体(IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-4Rα)mRNA、COL1A1 mRNA和COL3A1 mRNA表达的影响,ELISA的方法检测乙醇和/或IL-13对HFL-1分泌CoⅠ的影响。结果:单独低浓度乙醇(25、50、100、200mmol/L)作用HFL-1后,与对照组相比IL-13Rα1 mRNA与IL-4Rα mRNA水平比对照组显著增高(P<0.05),而IL-13Rα2 mRNA水平比对照组显著降低(P<0.05)。单独低浓度乙醇(25、50、100、200 mmol/L)对HFL-1的COL1A1 mR-NA和COL3A1 mRNA表达无影响(P>0.05)。IL-13(10、20、50μg/L)可以促进HFL-1的COL1A1 mRNA和COL3A1 mR-NA的表达(P<0.05),且存在浓度依赖性。乙醇(200 mmol/L)与IL-13(10、20、50μg/L)共同作用刺激HFL-1促进COL1A1 mRNA和COL3A1 mRNA的表达比IL-13(10、20、50μg/L)单独作用强(P<0.05)。IL-13组(10、20、50μg/L)和乙醇(200 mmol/L)与IL-13(10、20、50μg/L)共同刺激组HFL-1均有CoⅠ的分泌,但共同刺激组HFL-1分泌CoⅠ量显著增加(P<0.05)。结论:单独低浓度乙醇(25、50、100、200mmol/L)不影响HFL-1细胞的COL1A1和COL3A1表达,但可以影响HFL-1细胞IL-4Rα、IL-13Rα1和IL-13Rα2的表达,而乙醇与IL-13共同刺激与单独IL-13刺激相比对HFL-1的COL1A1和COL3A1以及CoⅠ的表达有显著的促进作用。     

Ⅰ型胶原基因转录调控的研究进展

调控Ⅰ型胶原(COL1)基因转录的顺式作用元件位于启动子和第一个内含子中。顺式作用元件及其结合的转录因子有生物种类特异性。一些转录因子以不同的亲和力与其部分潜在结合位点结合,它们间的相互作用稳定了DNA的环状结构,并引发转录。转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子在转录水平参与COL1基因的调控,在COL1基因启动子上有它们的反应元件。     

COL1A1敲除抑制卵巢癌细胞 ES-2增殖

目的:探讨Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha 1 chain,COL1A1)基因缺失是否抑制卵巢癌细胞的增殖。方法:构建COL1A1基因敲除的载体PX459-COL1A1,转染人卵巢癌ES-2细胞并用嘌呤霉素筛选,获得COL1A1敲除的ES-2细胞。用基因组测序方法检测COL1A1基因的编辑;细胞增殖、集落形成和细胞迁移实验检测COL1A1缺失对卵巢癌细胞增殖、集落形成及迁移的影响;细胞周期和细胞凋亡实验检测COL1A1缺失对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响。裸鼠荷瘤模型体内实验研究COL1A1基因敲除对卵巢癌细胞增殖的影响。结果:Western blot和DNA测序结果显示CRISPR/Cas9方法可以编辑ES-2细胞的COL1A1基因,从而抑制COL1A1蛋白表达。COL1A1缺失显著抑制细胞增殖、软琼脂集落形成能力和细胞迁移(P<0.01)。此外,COL1A1缺失将卵巢癌细胞阻滞于G₂期(P<0.01),并促进细胞凋亡(P<0.01)。分子机制研究表明COL1A1缺失可以明显抑制成骨细胞特异性转录因子osterix和基质金...     

COL1A1/COL1A2基因突变分析与成骨不全的产前基因诊断

目的对有成骨不全(Osteogenesis Imperfecta,OI)孕史的患者,进行系统B超及COL1A1/COL1A2基因检测,希望建立OI患儿产前诊断方案,为OI患儿进行产前诊断提供技术保障。方法对于有OI孕史的孕妇,进行系统B超监测;根据胎儿股骨、长骨的超声影像学表现,初诊为成骨不全。抽取羊水,采用直接测序法对羊水DNA的COL1A1和COL1A2基因全编码外显子及启动子区域进行突变位点检测。检出的新突变,对孕妇夫妇及家系其他成员直接测序证实。产前诊断标本均需做母血污染鉴定。结果胎儿超声影像学表现为股骨短小,胫腓骨弯曲成角,颅骨变薄且发现多处骨折,考虑OI。STR法鉴定,羊水无母血污染。DNA序列分析结果显示COL1A1基因鉴定出19个SNP位点,没有鉴定出突变位点;COL1A2基因鉴定出13个SNP位点及第36外显子的第2180位置碱基发生错义突变位点(c.2180G>A,p.Gly727Asp)。孕妇在COL1A2基因的第36外显子亦存在错义突变位点(c.2180G>A,p.Gly727Asp),但其临床特征不一致。其他成员均未检测到Gly727Asp突变。结论有OI孕史的孕妇,采取B超和COL1A1/COL1A2基因诊断技术,可以快速、有效对高危胎儿做出确诊,为预防患病胎儿出生提供技术保障。     

考尼伐坦抑制精氨酸血管加压素诱导的心脏成纤维细胞增殖及胶原表达

目的 探讨大鼠心脏成纤维细胞(CFs)经精氨酸血管加压素(AVP)及其受体拮抗剂考尼伐坦(CON)干预后,细胞的增殖和细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的变化.方法 采用胶原酶Ⅱ消化法、差速贴壁法、差速脱壁法获取并纯化CFs,应用CCK-8活细胞计数试剂盒检测细胞活性,RT-PCR方法检测细胞中Ⅰ型胶原蛋白α1链(COL1 A1)和Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1) mRNA的变化,Western blot法检测COL1A1、COL3A1蛋白表达的变化.结果 干预培养的CFs 24 h后,10-7 mol/LAVP可显著促进CFs细胞增殖(P＜0.01),而10-7 mol/L CON可显著抑制这一作用(P＜0.01).干预培养的CFs 12 h后,10-7moL/L AVP可诱导CFs COL1A1、COL3A1 mRNA表达显著增加,同时蛋白表达亦显著增加,而10-7 mol/L的CON可抑制这些作用.结论 AVP可促进CFs的细胞增殖和COL1A1、COL3A1 mRNA和蛋白表达,而CON可部分抑制这种作用.     

NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327)。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P0.05)。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。     

Ⅰ型成骨不全一家系的分子诊断

目的 对Ⅰ型成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)1个家系进行分子诊断.方法 从先证者的基因组DNA人手,自行设计30对引物,扩增产物涵盖全部COL1A1基因52个外显子及启动子区域,并以相应引物对PCR产物进行直接测序.针对突变位点,设计扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)引物,在60名无关对照中进行突变筛查.结果 在先证者的其中1条COL1A1等位基因上存在突变,即COL1A1基因第1441位(位于第52外显子,P30)发生了GAT→CAT改变.使原来编码的天冬氨酸被组氨酸取代(D1441H);其母亲的其中1条COL1A1等位基因上也存在相同突变,而正常对照相应的COL1A1基因序列与GenBank参考序列相同.ARMS分析显示,在60个无关对照中均未检测到D1441H突变.查阅国内外相关文献及COL1A1基因突变数据库,未发现有关COL1A1基因D1441H突变的报道.结论 建立了基于COL1A1基因突变分析的成骨不全分子诊断方法 ,并在中国人Ⅰ型成骨不全患者中发现1个新的COL1A1基因D1441H突变.     

营养不良性大疱性表皮松解症的分子遗传学进展

显性和隐性遗传性营养不良性大疱性表皮松解症 (DEB)的致病基因均定位于编码 型胶原基因 (COL7A1)上。COL7A1每一功能区 (三螺旋区、铰链区、启动子区、剪接位点、增强子区等 )内均可能发生突变 ,突变类型有甘氨酸置换、启动子突变、提早终止密码突变 (PTC)等 ;DEB的分子病理发生和遗传异质性与 COL 7A1突变密切相关 ,本文就这些方面的最新研究进展作一综述。     

COL 2A1基因突变与Ⅱ型胶原病

Ⅱ型胶原是关节软骨的主要的结构成分。COL 2A1基因编码的Ⅱ型胶原α1链,3条相同的α1链组成Ⅱ型胶原蛋白。α1链包括N端、三螺旋区和C端,三螺旋区由Gly-X-Y重复序列组成。COL 2A1基因突变位点常发生在Gly-X-Y三螺旋重复位置,且表型突变位点发生在比N端和C端严重。COL 2A1基因突变所导致的一组疾病总称为Ⅱ型胶原病,Ⅱ型软骨成长不全与软骨形成不足、脊柱骨骺发育不良、Kniest发育不良、骨性关节炎以及I型Stickler综合征等,本文就COL 2A1基因突变与Ⅱ型胶原病的研究进展作一综述。     

北京地区汉族人群Ⅰ型胶原基因Sp1结合位点多态性的研究

目的　探讨北京地区汉族人群 型胶原 (collagen type α1 ,COL1A1)基因 Sp1结合位点多态性的分布规律。方法　用聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性分析方法 ,对北京地区汉族 134名绝经后妇女和 43名健康男性的 COL 1A1基因 Sp1结合位点多态性进行了检测。结果　 134名绝经后妇女和 43名男性均为 SS基因型 ,即无多态位点。结论　中国汉族人可能缺乏或罕有 COL 1A1基因 Sp1结合位点多态性 ,与朝鲜人及日本人相同 ,而与高加索人种显著不同。     

中国北方汉族人群TNF-α、VDR基因间交互作用与HBV感染结局相关

目的 探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)和维生紊D受体(VDR)基因多态位点交互作用与2型肝炎病毒(HBV)感染慢性化的关系.方法 391例慢性乙型肝炎(CHB)患者为病例组和212例乙型肝炎病毒自限性感染者为对照组,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测TNF-α基因启动子区-238G/A、-857C/T、-863C/A、VDR-TaqⅠT/C和FokⅠC/T位点的基因型,采用相乘模型分析基因-基因问的交互作用.结果 TNF-α-238 GA与VDR-FokⅠCT/CC(ORint=4.04)、TNF-α-863 CC与-857CC(ORint=1.26)、VDR-FokⅠCT/CC与TNF-α-857CC的基因间(ORint=1.37)均为正交互作用,增加HBV感染发展为慢性乙型肝炎的风险;TNF-α-238 GA与-857 CC(ORint=0.92)、VDR-FokⅠCT/CC与TNF-α-863 CC基因间(ORint=0.95)为负交互作用,降低HBV感染发展为慢性乙型肝炎的风险.结论 TNF-α和VDR基因间交互作用可能影响HBV感染结局.     

TGFβ1/Smad3信号通路介导的赖氨酸羟化酶2活性变化在肺纤维化胶原沉积中的作用

目的:探讨TGFβ1/Smad3信号通路对赖氨酸羟化酶2(lysyl hydroxylase 2,LH2)活性变化的影响,以及这一变化在肺纤维化胶原沉积中的作用及机制。方法:用含10%胎牛血清的F12培养基培养人肺成纤维细胞株HFL1。实验分为对照组、TGFβ1 (10μg/L)刺激组和米诺地尔(5μmol/L)干预组,对照组加等量培养基;48 h后收集各组RNA及蛋白,采用RT-qPCR检测PLOD2、α-SMA及COLⅠ的mRNA表达水平,Western blot检测LH2、总Smad3、磷酸化Smad3、α-SMA、COLⅠ和COLⅣ的蛋白水平变化,ELISA检测细胞中羟基赖氨酰吡啶酚(hydroxylysylpyridinoline,HP)的含量变化。结果:TGFβ1刺激后,PLOD2、α-SMA及COLⅠ的mRNA表达上调(P0.01);其对应的蛋白水平如LH2、磷酸化Smad3、α-SMA、COLⅠ和COLⅣ蛋白水平增高,而总Smad3的蛋白水平没有变化。米诺地尔干预后上述基因的mRNA及蛋白表达减少(P0.01)。TGFβ1刺激后ELISA检测到HP含量较对照组增加,米诺地尔干预后合成减少(P0.05)。结论:TGFβ1/Samd3信号通路激活,使LH2表达增多;而米诺地尔通过抑制TGFβ1/Samd3信号转导,减少LH2的表达,减少羟基化胶原吡啶链的合成,从而减轻肺纤维化病变。     

应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素调控人α1(Ⅰ)型胶原基因转录

目的应用寡核苷酸圈套技术研究胰岛素对人COL1A1基因转录的调控。方法建立稳定转染pCOLH12.5质粒(含CAT基因与人COL1A1基因-2483～ 42bp片段)的WI-38细胞株,加入不同剂量胰岛素,测CAT值;分别瞬时转染不同序列ssPT入克隆细胞株中,加入2.5μmol/ml的胰岛素,测CAT值。结果2.5μmol/ml的胰岛素显著增加了COL1A1基因启动子活性;含sp1位点的ssPT浓度为120 nmol/L时,受胰岛素刺激所增加的CAT值得到显著抑制,不含sp1位点的ssPT无此作用。结论ssPT能够应用于基因转录调控的研究。胰岛素在人COL1A1基因上的反应元件可能位于启动子-129至-105区域内。     

靶向COL1A1基因的shRNA对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭与迁移的影响

目的探讨Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭与转移的影响。方法设计2条shRNA干扰载体及1条阴性对照载体,分别稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞。用Western blot法筛选抑制效率最高的细胞进行细胞平板集落形成实验、细胞黏附实验、细胞迁移及侵袭实验,观察COL1A1基因对MDA-MB-231细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。结果转染pshRNA-COL1A1-2干扰载体的MDA-MB-231细胞COL1A1蛋白表达降低最明显,抑制率达66.98%±2.08%,选择该组细胞作为有效干扰组进行后续实验。pshRNA-COL1A1转染组细胞的集落形成率显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P<0.05);细胞黏附实验中pshRNA-COL1A1转染组细胞的吸光度值较对照组明显降低(P<0.001);转染pshRNA-COL1A1质粒组细胞的穿膜细胞数也显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P<0.001)。结论 COL1A1基因沉默可在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附、侵袭和迁移。     

胰岛素样生长因子1和胰岛素对人a1（I）前胶原启动子活性的影响

目的：探讨胰岛素样生长因子1（IGF-1）和胰岛素对人a1(I)前胶原（COL1A1）基因启动子的调控作用及肿瘤坏死因子a(TNFa）、干扰素γ（IFNγ）、干扰素a(INFa）对这一作用的影响。方法：构建含 COL1A1基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶（CAT）报告基因的重组体pCOLH0.27与pCOLH2.5,它们分别含该启动子序列-268～ 42bp(0.27kb)与-2483～ 42bp(2.5kb)片段。将这2个重组体瞬时转染人皮肤成纤维细胞,加入IGF-1或胰岛素,部分细胞还加入TNFa或IFNγ或IFNa,测定CAT活性。结果：13nmol/L IGF-1使转染后的这2个重组体活性分别增高3.68倍与4.04倍。2.5umol/L的胰岛素亦使之分别增高3.69倍与3.93倍。TNFa、IFNγ、IFNa能降低IGF-1与胰岛素诱导的pCOLH2.5活性。结论：IGF-1和胰岛素能在转录水平促进COL1A1基因的表达,TNF-a、INFγ、IFNa能抑制IGF-1和胰岛素的这一作用。     

普伐他汀对人Ⅰ型胶原α 1(Ⅰ)链启动子活性调控的研究

目的研究普伐他汀人Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)链启动子活性的调控,从转录水平上了解普伐他汀对Ⅰ型胶原合成的影响.方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代、传代培养.构建含人α 1(Ⅰ)前胶原基因5'侧翼序列-2.5kb与报告基因氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的重组体phCOL2.5,用FuGENE转染试剂瞬时转染平滑肌细胞,CAT-ELISA测定普伐他汀对重组体的作用.结果设对照组的CAT值为1,普伐他汀组的CAT值为0.62±0.04,普伐他汀能明显抑制Ⅰ型胶原α1(Ⅰ)启动子的活性.结论普伐他汀可以在转录水平上调节人α1(Ⅰ)前胶原基因表达.