HBX基因逆转录病毒载体的构建及在LO2细胞内的稳定表达

目的 构建乙型肝炎病毒X基因(HBX)逆转录病毒载体,并使其在人正常肝细胞LO2内的进行稳定表达.方法 PCR扩增HBX基因,克隆到逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag中,构建表达HBX的重组逆转录病毒载体质粒pSEB-Flag-HBX,通过通过PCR、酶切、测序验证HBX基因后;体外将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBX基因的重组逆转录病毒,并感染靶细胞人正常肝细胞LO2,稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,获得成功转入HBX的LO2细胞.通过RT-PCR和Western blot进一步验证HBX基因及HBx蛋白在LO2细胞内的表达.结果 (1)成功获得携带HBX基因的阳性重组质粒pSEB-Flag-HBX;(2)HBX基因被逆转录病毒成功地导入靶细胞LO2细胞,并实现稳定表达,RT-PCR检测到HBX mRNA在靶细胞中的表达,Western blot检测到HBx蛋白在靶细胞LO2-HBx细胞中的表达.结论 成功构建了携带HBX基因的重组逆转录病毒载体,感染人正常肝细胞LO2后能够稳定表达HBx蛋白,为进一步探讨HBx在肝癌发生发展中的作用提供了较为理想的实验模型.     

人FGF-9慢病毒表达载体的构建、包装及鉴定

目的构建人成纤维细胞生长因子-9（FGF-9）慢病毒表达载体,鉴定其表达,并对慢病毒载体进行包装,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。方法PCR扩增人FGF-9基因。全长序列交换入线性表达载体,连接产物转化感受态细胞,PCR及基因测序鉴定阳性克隆。重组质粒转染293T细胞,荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达,Western—blot鉴定FGF-9表达。重组病毒质粒在脂质体介导下与结构质粒和包膜质粒共转染293T细胞包装成人FGF-9过表达慢病毒,RT—qPCR测定滴度。结果PCR及测序证实人FGF-9基因正确克隆至病毒质粒;感染293T细胞后,荧光显微镜观察到eGFP,Western—blot检测到FGF一9融合蛋白表达;三质粒共转染293T细胞获得慢病毒,测其浓度为2×10^8TU／mL。结论成功构建人FGF-9慢病毒表达载体．可在293T细胞中表达,并包装成慢病毒,为在体及体外研究FGF-9的功能及其与肿瘤等疾病的关系提供基础。     

双特异性磷酸酶-1过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭的影响

目的：构建携带人双特异性磷酸酶-1(dual specificity phosphatase-1,DUSP-1)基因的过表达慢病毒载体并包装病毒,感染人肾癌细胞株A498后观察DUSP-1的过表达对肾癌细胞株A498增殖和侵袭能力的影响。方法从pCMV6-XL5-DUSP-1质粒上获得目的基因片段,采用DNA重组技术将DUSP-1基因插入到慢病毒表达载体质粒Plv-EGFP(2A)Puro中,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-DUSP-1载体。重组慢病毒表达质粒及辅助包装质粒pH1、pH2共转染293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒上清并感染肾癌细胞株A498,利用Western blot检测细胞DUSP-1蛋白的表达情况。用MTS法检测细胞增殖能力的变化,Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果成功构建携带DUSP-1过表达载体。包装病毒后成功感染A498细胞株,DUSP-1蛋白表达较对照A498细胞株显著上调。重组质粒组细胞在490 nm吸光值明显上升(P＜0.05);细胞侵袭试验中,重组质粒组的穿膜细胞数明显高于空载体组(P＜0.05)。结论成功构建了人DUSP-1基因的重组慢病毒表达载体pLV-EGFP(2A)Puro-DUSP-1,进行病毒包装后成功培养稳定高表达DUSP-1基因的肾癌细胞株;DUSP-1基因的过表达具有促进肾癌细胞株A498增殖和侵袭的作用。     

携带人尾型同源盒基因-2基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建尾型同源盒基因-2(CDX2)基因的慢病毒表达载体并进行鉴定。方法 PCR扩增CDX2基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pWPI,通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒。重组质粒转染包装细胞293T后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染直肠癌细胞XB1847,经PCR和Western Blot证明重组慢病毒携带的CDX2在XB1847细胞内表达的情况。结果经PCR扩增、酶切及测序验证,重组质粒构建成功,命名为pWPI-CDX2。PCR和Western Blot证明重组慢病毒感染XB1847细胞后CDX2能稳定表达。结论成功构建了携带CDX2的慢病毒载体,为研究CDX2在直肠癌中的功能提供了实验基础。     

表达人NEP基因重组腺病毒载体的构建及其降Aβ作用的研究

目的构建携带人全长NEP基因的重组腺病毒载体,包装扩增获得高滴度病毒,检测其对损伤细胞的降β 淀粉样肽(Aβ)作用。方法构建含NEP基因的腺病毒穿梭载体pAdTrack nep,并与骨架载体pAdEasy l在细菌内重组为pAd NEP,经293细胞包装为增殖缺陷性腺病毒,感染人神经母细胞瘤SK N SH细胞。采用RT PCR和Western blot法分析检测NEP的表达水平及感染内源性损伤的SK N SH细胞(sweAPP SK),采用Elisa法初步检测NEP对Aβ的降解程度。结果成功构建重组腺病毒AD NEP和对照病毒AD GFP,且重组腺病毒能感染人神经母细胞瘤SK N SH细胞并检测到目的基因的高表达。Elisa结果显示,NEP高表达有明显减轻Aβ在细胞外累积的作用。结论利用细菌内质粒同源重组法可快速简捷地制备表达外源基因的腺病毒,感染AD NEP的神经细胞通过NEP高表达可以明显减轻Aβ累积。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。     

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测.方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体.PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒.体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达.结果成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL.体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达.结论构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎治疗奠定实验基础.     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

密码子优化的HIV-1型gp120基因重组腺病毒载体疫苗的构建与鉴定

目的 构建密码子优化型gp120基因重组腺病毒载体（rAden-mgp120）,为研发新型HIV预防性疫苗奠定基础.方法 首先利用PCR的方法扩增mgp120基因,将目的基因克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得重组穿梭载体克隆pENTR/D-TOPO-mgp120.经过穿梭载体克隆与表达载体（pAd-CMV/VS-DEST）间的重组反应获得表达克隆质粒pAden-mgp120,表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAden-mgp120.结果 经PCR和测序鉴定,重组载体rAden-mgp120构建正确,转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为6.8x1011pfu/ml,该重组腺病毒载体能正确表达mgp120蛋白.结论 成功构建了重组腺病毒rAden-mgp120为HIV-1预防奠定了基础.     

转染的FasL基因诱导HCC9204细胞凋亡的形态学研究

目的 构建含FasL基因的腺病毒载体，转染肝癌9204细胞株，观察FasL基因对9204细胞株的影响。方法 以腺病毒作载体，把FasL基因克隆入腺病毒载体，构建成含FasL基因的转基因载体并酶切鉴定，用脂质体包裹法把含FasL的腺病毒载体转染HCC9204细胞株，用RT－PCR方法证实转染后有无FasL基因表达，采用电镜观察9204细胞形态学变化。结果 酶切鉴定证实含FasL基因的转基因载体构建成功；RT－PCR显示转染后9204细胞株FasL基因表达水平显高于未转染细胞株（P＜0.01）；肝癌细胞株9204转染FasL基因72h后，在光镜下可见调亡细胞体积缩小，生长不良，染色质浓度，密度增高，胞核中出现颗粒样物质，电镜下可见调亡小体。结论 成功地构建了FasL基因的转基因载体；转染FasL基因可诱导肝癌9204细胞株出现凋亡。     

基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外实验

目的 探讨体外基因转移Fas配体（Fas-ligand,FasL)对人恶性黑色素瘤细胞凋亡的影响。方法 用携带人FasL,cDNA的缺陷型重组腺病毒载体（Ad-FL)，在体外转导两株黑色素瘤细胞，并使其表达；通过流式细胞仪，RT－PCR法进行Fas/FasL表达检测，TUNEL法及荧显微镜相关凋亡检测，分析，结果 流式细胞仪和RT－PCR检测两株黑色素瘤细胞表面均表达Fas，不表达FasL，而Ad-FL转导的两株黑色素瘤细胞均能表达FasL，Ad-FL能显著诱导两株黑色素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。结论 重组腺病毒FasL在体外诱导人黑色素瘤凋亡效果显著。     

HPV16-E7H2P融合钙网蛋白基因重组腺病毒载体疫苗的构建与免疫学鉴定

目的 构建表达钙网蛋白(CRT)与乳头瘤病毒16型E7基因H2P突变型(HPV16-E7H2P)融合蛋白重组腺病毒载体(Ad-CRT/HPV16-E7 H2P),为研发新型乳头瘤病毒治疗性疫苗奠定基础.方法 首先利用RT-PCR的方法扩增CRT基因,并进一步构建CRT与HPV16-E7H2P基因融合重组的pJW4303表达载体,将目的基因加上特定的CACC接头后克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆.经过入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应获得表达克隆Ad-CRT/HPV16-E7 H2P.表达克隆线性化后转染HEK293A包装细胞,得到重组腺病毒.结果 构建的Ad-CRT/HPV16-E7H2P经PCR和测序鉴定构建正确;转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.95 × 1011 pfu/mL,该重组病毒载体能正确表达CRT/HPV16-E7H2P融合蛋白.结论 成功构建了Ad-CRT/HPV16-E7H2P,为HPV慢性感染以及宫颈癌的防治奠定了基础     

重组腺病毒ADV-TK 基因的构建及其对肝癌细胞的杀伤作用

目的 探讨含胸苷激酶(TK)自杀基因的重组腺病毒(ADV-TK)对肝癌细胞的杀伤作用.方法 采用细胞内同源重组法构建出携带TK基因的ADV-TK,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定,将ADV-TK感染人肝癌细胞株SMMC-7721,MTT法检测受感染的SMMC-7721细胞被不同浓度GCV作用后的细胞存活率情况.结果 构建的重组腺病毒中带有TK基因,用相同滴度的重组腺病毒和不同浓度的GCV作用于肝癌细胞株SMMC-7721后.MTT法检测到细胞的存活率随着GCV浓度的增加而不断降低.结论 本实验构建的携带TK基因的复制缺陷型腺病毒对肝癌细胞具有明显的杀伤作用.     

High efficient generation of replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase by homogeneous recombination in bacteria

Background Suicide gene therapy is a widely used molecular treatment for head and neck cancer. In this study, we try to use the method of homogenous recombination in bacteria to clone thymidine kinase gene (tk)–a kind of suicide gene to adenovirus backbone vectors for the construction of replication-defective adenoviruses. Methods pAdTrack-CMV/tk was constructed through subclone of a restriction endonuclease fragment including thymidine kinase gene from plasmid pCMV-tk to another plasmid pAdTrack-CMV, and then co-transfected with supercoiled pAdEasy-1, which was an adenoviral backbone vector except for deletions of E1 and E3, to competent E. coli BJ5183 for homogenous recombination using electroporation procedure. With the same method, pAdTrack-CMV was also co-transformed with pAdEasy-1 for homogenous recombination in BJ5183. Identified with restriction endonuclease PacI and polymerase chain reaction (PCR), plasmids pAd-GFP/tk and pAd-GFP were successfully constructed. Each of them was digested with PacI and sequently transfected into human embryo kidney 293 cells (HEK293) using Lipofectamine 2000.Results Comet-like adenovirus-producing foci of Ad-GFP/tk and Ad-GFP were observed after 5 to 7 days of cell culture. After twelve days of packaging, the replication-defective adenoviruses were collected. Identified with PCR, thymidine kinase gene was successfully constructed into Ad-GFP/tk.Conclusion The replication-defective adenoviruses containing thymidine kinase can be constructed more easily by homogenous recombination in bacteria than conventional techniques.     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及对结肠癌治疗作用的体内研究

目的:构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因-病毒治疗系统CNHK200-hA,初步研究其在体内对结肠癌的治疗作用. 方法: 克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1-5),命名为hA. 利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖型腺病毒和非增殖型腺病毒的病毒基因组中,通过动物试验观察其对结肠癌的体内治疗作用. 结果: 构建了一种新型的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA. 动物体内试验显示基因-病毒治疗系统CNHK200-hA能在结肠癌HT-29内高效表达K1-5蛋白,使肿瘤内血管明显减少,对结肠癌的疗效明显好于非增殖型腺病毒Ad-hA及肿瘤增殖型病毒ONYX-015. 结论: 插入了抗肿瘤新生血管生成基因hA的基因-病毒治疗系统CNHK200-hA在体内对结肠癌的治疗作用较非增殖病毒Ad-hA及肿瘤增殖病毒ONYX-015进一步提高.     

RNA干扰介导的人肺腺癌A549细胞FasL基因沉默及意义

目的构建针对肿瘤凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达质粒,研究RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞FasLmRNA表达的抑制作用,探索Fas／FasI途径在肺癌转移中的作用机制。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasLmRNA为靶基因,合成2对编码短发夹结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达质粒pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR检测细胞FasL mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样FasLsiRNA真核表达载体,转染人肺腺癌A549细胞后,FasLmRNA的表达水平显著下降。结论成功构建的FasL基因siRNA真核表达载体pSi2．0-FasL能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasLmRNA的表达。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。