胆固醇诱导人血管平滑肌细胞表型转化

目的观察胆固醇对人血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化的影响。方法体外培养人血管平滑肌细胞株,分别用(12.5、25.0、50.0)mg/L浓度的胆固醇作用细胞48 h;50.0 mg/L的胆固醇分别作用细胞24、48、72 h。采用实时定量PCR检测VSMC中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及平滑肌22α(SM22α)mRNA的表达;采用Western blot法检测胆固醇对VSMC中α-SMA、SM22α及单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白(MCPIP)表达的影响;CCK-8法检测VSMC增殖。结果 (12.5、25.0、50.0)mg/L胆固醇作用VSMC 48 h较对照组相比,α-SMA及SM22αmRNA水平及蛋白水平表达均降低(P0.05),50.0 mg/L胆固醇作用后表达水平最低,存在剂量依赖效应;用50.0 mg/L胆固醇分别作用VSMC 48、72 h后,α-SMA及SM22αmRNA及蛋白表达与对照组相比均降低(P0.05)。与对照组相比,胆固醇作用均明显促进VSMC增殖(P0.05)。50.0 mg/L胆固醇作用VSMC48 h可诱导MCPIP蛋白表达增加。结论胆固醇作用VSMC后可降低收缩型标志蛋白α-SMA及SM22α的表达、促进VSMC增殖,提示胆固醇可诱导VSMC表型转化。     

脂多糖诱导血管内皮细胞凝血途径相关因子基因表达变化

目的：观察脂多糖(LPS)对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织因子(TF)、组织因子抑制物(TFPI)和凝血酶调节蛋白(TM)的影响。方法：应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养，用生长良好的第2、3代细胞进行实验。同时应用CCK-8测定细胞在不同浓度的LPS(1-100 mg/L)处理前后细胞活性；应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TM、TF和TFPI mRNA水平。结果：浓度为10 mg/L的LPS对细胞活力与对照组相比没有显著差异。浓度为10 mg/L的LPS作用使HUVECs显著上调TF mRNA表达，6-24 h可以使细胞TFPI mRNA表达下调,以后渐恢复正常表达，72 h达到正常对照组水平，同时下调TM mRNA表达。结论：LPS(10 mg/L)对HUVECs的活性不造成直接的影响，可显著上调HUVECs的TF mRNA转录，抑制TFPI mRNA 的转录，而不改变TM mRNA的转录，这可能与LPS在感染过程中诱导血栓形成,血液凝固和DIC发生相关。     

卡托普利对LPS致血管内皮细胞活化及损伤的拮抗作用

目的:探讨血管紧张素转换酶抑制剂对脂多糖(LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活化及损伤的拮抗作用及可能机制。方法:建立体外人脐静脉内皮细胞培养。细胞生长至融合状态后分别加入LPS(1mg/L)及不同浓度的卡托普利(Cap)(10^-7mol/L、10^-5mol/L及10^-3mol/L)孵育18h。ELISA方法检测培养上清中血管假性血友病因子(vWF)含量,流式细胞仪间接免疫荧光法检测细胞膜表面细胞间粘附分子(ICAM)-1蛋白表达。同时利用原位杂交方法检测肿瘤坏死因子-α(TNFα)mRNA表达。结果:ELISA及间接免疫荧光法检测的结果提示暴露于1mg/LLPS后,HUVEC的vWF及ICAM-1表达明显强于对照组,加入Cap后,随Cap浓度增加明显下调LPS升高的vWF及ICAM-1表达,至Cap为10^-3mol/L时,其vWF与ICAM-1表达与LPS组有明显差别(P＜0.05)。Cap抑制LPS升高的vWF及ICAM-1表达呈一定的浓度依赖方式。原位杂交显示Cap10^-5mol/L及10^-3mol/L时表现明显下调TNFαmRNA表达,与LPS组比较差异明显(P＜0.05,P＜0.01)。结论:Cap对脂多糖诱导的HUVEC的活化及损伤有拮抗作用。     

MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用

目的：探讨MEK1/2在脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）ICAM-1表达中的作用。 方法： 用不同浓度LPS或LPS加MEK1/2特异性抑制剂PD98059和HUVECs孵育不同时间后，分别采用RT-PCR和Western blotting检测ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。 结果： LPS呈时间-浓度依赖性地上调HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达。LPS预处理后2 h，HUVECs ICAM-1 mRNA和蛋白的表达即开始升高，LPS(100 μg·L-1)作用后6 h,ICAM-1 mRNA和蛋白的表达基本达到高峰；PD98059(10 μg·L-1)可显著抑制LPS(100 μg·L-1)诱导6 h的ICAM-1 mRNA和蛋白的表达，抑制率分别为54.4%和44.9%（P<0.01 vs LPS）。 结论： 调控MEK1/2通路可能为内毒素休克诱导血管内皮损伤的防治提供新的策略。     

p21基因启动子甲基化对血管平滑肌细胞向泡沫细胞转化的影响

目的观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对血管平滑肌细胞(VSMC)p21基因启动子甲基化及对VSMC向泡沫细胞转化的影响。方法采用组织贴块法培养人脐血管平滑肌细胞,给予不同浓度氧化低密度脂蛋白ox-LDL(0,10mg/L,20mg/L,40mg/L)孵育24h,甲基化特异PCR(MS-PCR)检测p21基因启动子区CpG岛甲基化程度,MTT比色法测定VSMC增殖活性,油红O染色镜下观察计数泡沫细胞比率。结果 ox-LDL呈浓度依赖性促进p21启动子甲基化,同时平滑细胞增殖活性增高,向泡沫细胞转化增加。结论 ox-LDL可以通过p21基因甲基化促进VSMC向泡沫细胞转化,p21基因甲基化可能在动脉粥样硬化发生中起到一定作用。     

血红素加氧酶系统对ox-LDL介导的血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制

目的探讨血红素加氧酶(HO)系统对ox-LDL介导的血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及其机制.方法采用倒置显微镜和MTT法观察VSMC生长状况;检测VSMC中cAMP/cGMP的水平、c-fos和c-myc mRNA及其蛋白质和HO-1蛋白质的表达.结果HO特异性抑制剂锌原卟啉-9(ZnPP-9)组在6、12 h的VSMCs生长曲线与ox-LDL组(C组)间无明显差异(P＞0.05);然而,48 h明显高于C组(P＜0.01);24、72 h与ox-LDL组重合,在终点(96h)略高于ox-LDL组(P＞0.05);ZnPP9组与ox-LDL组c-myc、c-fosmRNA及其蛋白和HO-1蛋白的表达均较强.尽管HO分解的代谢产物三价铁(Fe )螯合剂(去铁胺)组生长曲线高于ZnPP-9组(48h时与ZnPP-9组重合)和ox-LDL组(P＜0.01),但VSMCs体积明显增大,数量减少.结论锌原卟啉-9抑制血红素加氧酶活性而促进ox-LDL介导的血管平滑肌细胞增殖效应,去铁胺螯合Fe 能抑制VSMCs数量增加.其机制可能与HO-1活性和c-myc、c-fosmRNA及其蛋白表达有关,而与HO-1蛋白表达和cAMP/cGMP水平无明显关系.     

N-乙酰半胱氨酸抑制IL-18在血管平滑肌细胞中诱导TNF-α和IL-6表达

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)对白细胞介素18(IL-18)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)表达的影响。方法:培养的VSMC细胞,加入或不加入NAC(5mmol/L)处理1h后,再以不同浓度的IL-18刺激不同时间,通过ELISA测定培养上清IL-6及TNF-α蛋白质水平,加入IL-18(100μg/L)6h后RT-PCR分析细胞中相应的mRNA水平。同时Westernblot分析NAC对IL-18激活的NF-κB的影响。结果:通过IL-18刺激的VSMC培养上清中的IL-6及TNF-α水平及细胞中的mRNA水平显著升高(P0.01),且具有时间和剂量依赖关系(P0.01)。NAC(5mmol/L)显著抑制IL-18诱导的IL-6及TNF-α的mRNA和蛋白质水平表达(P0.01)。Westernblot分析显示NAC能够抑制IL-18对NF-κB的激活作用。结论:NAC体外可以抑制IL-18在SMC中诱导的IL-6及TNF-α表达。     

半边莲生物碱抑制内皮素-1诱导的人脐动脉平滑肌细胞增殖

目的：探讨半边莲生物碱(LCLA)对内皮素-1（ET-1）诱导人脐动脉平滑肌细胞（VSMC）增殖的抑制效应及其作用机制。 方法： 采用细胞计数、［3H］-TdR掺入、流式细胞术、免疫细胞化学染色及Fura-3/AM 荧光探针标记方法检测VSMC增殖；并用台盼蓝拒染、乳酸脱氢酶（LDH）检测方法观察LCLA对VSMC的毒性反应。 结果： LCLA(100、200和400 mg/L)、BQ-123(10-6mol/L)、ST(10-7mol/L)均抑制ET-1所诱导的VSMC增殖（均P＜0.05）：明显降低VSMC的细胞数目、［3H］-TdR掺入量、S期和G2/M期的数目百分比，增加G0/G1期的数目百分比；减弱细胞内增殖细胞核抗原（PCNA）的表达强度和Ca2+荧光强度；LCLA的抑制作用存在明显的剂量依赖关系，但对VSMC存活率和LDH释放量均没有影响。 结论： LCLA浓度依赖性地抑制ET-1所诱导的人脐动脉VSMC增殖，其机制与降低VSMC内Ca2+含量有关。     

Caveolin-1在17β-雌二醇对抗脂多糖诱导的血管平滑肌细胞MCP-1表达中的作用

目的:旨在观察小窝蛋白-1(caveolin-1)在17β-雌二醇(E2)抑制脂多糖(LPS)诱导的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)中的作用。方法:原代培养VSMCs,以不同浓度E2(10-9-10-6mol/L)干预LPS诱导的MCP-1的分泌,ELISA法检测MCP-1生成的变化。分别使用caveo-lin-1的阻断剂β-甲基环糊精(β-MCD)以及特异性caveolin-1 siRNA抑制caveolin-1表达,W estern b lotting法检测caveolin-1蛋白表达的变化。结果:LPS浓度和时间依赖地诱导MCP-1的表达,不同浓度E2(10-9-10-6mol/L)抑制LPS诱导的MCP-1的表达;分别使用β-MCD以及caveolin-1 siRNA抑制caveolin-1的表达,能抑制LPS诱导的MCP-1的表达,而E2(10-6-10-9mol/L)又可以抑制caveolin-1的表达。结论:E2抑制LPS诱导的血管平滑肌细胞MCP-1的表达,caveolin-1是这一抑制作用的中间环节。     

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导离体兔胸主动脉反应性改变的影响

目的和方法:应用离体血管环张力测定技术,观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖(LPS)诱导兔离体胸主动脉反应性变化的影响。在扫描电镜下观察内皮细胞超微结构的变化,以探讨CCK-8抗内毒素休克作用的可能机制。结果:LPS(100mg/L)孵育后的胸主动脉环对乙酰胆碱(ACh)的内皮依赖性舒张反应降低,且呈时间依赖性;对苯肾上腺素(PE)的收缩反应降低;孵育7h血管内皮细胞结构损伤;CCK-8(1mg/L)可减轻LPS的损伤效应;CCK-8(1mg/L)单独孵育对胸主动脉的舒缩反应及内皮细胞的超微结构无明显影响。结论:CCK-8能减轻LPS诱导兔离体胸主动脉反应性的异常改变,这可能是CCK-8抗内毒素休克作用的机制之一。     

Differential induction of brain heme oxygenase-1 and heat shock protein 70 mRNA in sepsis

We examined gene expression of heat shock protein 70 (HSP70) and heme oxygenase-1 (HO-1), which is the rate limiting enzyme in heme catabolism and is also known as heat shock protein 32 (HSP32), in the rat brain using a sepsis model induced by bacterial lipopolysaccharide (LPS). Intraperitoneal injection of LPS (10 mg/kg) to rats caused the elevation of body temperature and white blood cell (WBC) counts as well as marked elevation of serum interleukin-6 (IL-6) level, showing the typical pathological characteristics of sepsis. In this model, HO-1 mRNA increased at 6 h after LPS administration and continued to rise until 30 h. In contrast, HSP70 mRNA increased only between 3 h and 6 h after LPS administration, returning completely to the control level by 12 h. HO-1 mRNA was expressed predominantly in the cortex and the medulla oblongata, while HSP70 mRNA was expressed mainly in the striatum. HO-1 and HSP70 mRNA levels thus showed distinctive time courses and tissue distribution in the brain, suggesting that gene expression of these heat shock proteins (HSPs) is separately regulated.     

HO-1在造影剂所致肾小管上皮细胞损伤中的作用

目的:探讨血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)在造影剂所致肾小管上皮细胞损伤中的作用.方法:体外培养的HK-2细胞,分为正常对照组、甘露醇对照组、造影剂损伤组、钴原卟啉(CoPP)处理组、锌原卟啉(ZnPP)处理组.比色法测定细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平,四甲基偶氮唑(methyl ...     

Gene expression of heme oxygenase-1 during glial activation by lipopolysaccharide

The effect of bacterial lipopolysaccharide (LPS) on the expression of mRNA encoding heme oxygenase-1 (HO-1), which is the rate limiting enzyme in heme catabolism and is also known as heat shock protein 32 (HSP32), was examined in primarily cultured rat glial cells. Treatment of cells with LPS elicited an increase in HO-1 mRNA, accompanying down regulation of delta-aminolevulinate synthase, in a dose-dependent fashion. HO-1 mRNA increased markedly at 12 h after LPS treatment (10 microg/ml) and reached a maximum at 24 h. In contrast, HSP70, a major heat shock protein, slightly increased only at 6 h after LPS treatment and returned to the control level by 12 h. These results suggest that HSPs are induced under separate regulation during glial activation by LPS through oxidative stress, a part of which is likely mediated by intracellular free heme.     

金纳多对内毒素诱导小鼠急性肺损伤保护作用机制的初步研究

目的：初步探讨银杏叶提取物金纳多（Ginaton）对内毒素（lipopolysaccharide, LPS）诱导小鼠的急性肺损伤(acute lung injury, ALI)保护作用的可能机制。方法：于小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）复制ALI动物模型。将小鼠随机分为对照组、LPS组、Ginaton组和Ginaton＋LPS组。观察各组肺组织病理学改变,测量肺湿/干重比,支气管肺泡灌洗液蛋白含量及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性,测量丙二醛（malondialdehyde, MDA）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, iNOS）和髓过氧化物（myeloperoxidase,MPO),免疫组织化学方法检测血红素加氧酶（heme oxygenase HO-1）及iNOS蛋白表达。结果： 金纳多可有效减轻LPS所致肺组织病理学变化,并降低肺湿/干重比和肺泡灌洗液中蛋白含量,降低肺泡灌洗液中LDH活性、肺组织MPO和iNOS活性,同时MDA和NO含量下降。免疫组织化学结果显示,LPS组iNOS表达上升（P＜0.01）,而血红素加氧酶（HO-1）蛋白表达未见明显变化;而预先给予Ginaton可显著提高HO-1的表达,降低iNOS的表达（P＜0.01）。结论：Ginaton可减轻LPS所致急性肺组织损伤,其机制可能与诱导HO-1的表达,下调iNOS的表达和活性有关。     

HO-1在CCK-8减轻脂多糖所致的急性肺损伤中的作用

目的： 探讨血红素氧合酶（HO）-1在八肽胆囊收缩素（CCK-8）减轻脂多糖（LPS）所致急性肺损伤（ALI）中的作用。方法: 将大鼠随机分为5组：正常对照组、LPS组、CCK-8+LPS组、LPS+Hm（氯血红素，CO供体）组、LPS+ZnPP（锌原卟啉，HO-1特异性阻断剂）组。各组给药后2 h、6 h、12 h行支气管肺泡灌洗、检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞（PMN）数目；进行肺组织的形态学观察；测定肺组织中丙二醛（MDA）含量和HO-1蛋白活性；应用RT-PCR和Western blotting技术检测给药后6h肺组织中HO-1 mRNA和蛋白的表达情况。结果: LPS组肺组织出现损伤性变化，同时BALF中PMN数目、肺组织中MDA含量、HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA和蛋白的表达均高于相应对照组（均P<0.05）；CCK-8+LPS和LPS+Hm组肺组织损伤程度、BALF中PMN数目和肺组织中MDA含量低于相应LPS组，而肺组织中HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA和蛋白的表达均高于相应LPS组（均P<0.05）；LPS+ZnPP组肺组织损伤程度、BALF中PMN数目和肺组织中MDA含量分别高于相应LPS组，而肺组织中HO-1蛋白活性、HO-1 mRNA和蛋白的表达分别低于相应LPS组（均P<0.05）。结论: CCK-8可部分通过HO-1介导的抗氧化、抑制PMN聚集等效应来发挥减轻LPS所致的肺损伤作用。     

一氧化碳保护大鼠肠道对抗LPS的作用机制

目的： 探讨外源性CO对LPS攻击时大鼠肠道的保护作用及作用机制。 方法： 血气分析监测大鼠呼吸参数，在1、3、6 h的时点上，分别对空白组、脂多糖组（LPS，5 mg/kg）、低浓度CO吸入组（CO 250 mL/M3）、腹腔内CO注射组（CO 2 mL/kg）、脂多糖CO吸入组（LPS 5 mg/kg+CO 250 mL/M3）和脂多糖血症CO腹腔内注射组（LPS 5 mg/kg+CO 2 mL/kg），用硫代巴比妥酸法（TBA）测定肠道丙二醛（MDA）含量，用羟胺法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，并应用RT-PCR检测肠道组织内的血红素氧合酶-1（HO-1）mRNA的变化。 结果: 给予250 mL/M3的CO持续吸入以及2 mL/kg的CO腹腔内注射，在1、3、6 h时点上，大鼠无缺氧情况的出现。两种方法给予外源性的CO，均降低了内毒素血症时大鼠肠道组织中的MDA含量，提高了SOD的活性，同时诱导了肠组织的HO-1 mRNA 的表达。 结论: 低浓度的CO吸入（250 mL/M3）和一次性腹腔内注射CO（2 mL/kg）补充对大鼠是安全的，补充低浓度或小剂量的外源性CO可以对脂多糖血症肠道提供保护作用，并可以刺激HO-1的产生，促进内源性的CO产生发挥抗炎作用。     

Expression of heme oxygenase in human airway epithelial cells

Elevated levels of carbon monoxide (CO) are found in the exhaled breath of patients with inflammatory diseases such as asthma and cystic fibrosis. Endogenous CO is derived from heme oxygenase (HO) (EC 1.14.99.3), which catabolizes heme-producing CO and biliverdin. There are three isoforms of HO: HO-1 is inducible by inflammatory cytokines and oxidants, including nitric oxide (NO), whereas HO-2 and HO-3 are expressed constitutively. Primary airway epithelial cells were treated with either 50 ng/ml interleukin-1 beta, tumor necrosis factor-alpha, and interferon-gamma (cytomix), or the NO donor NOC-18 for up to 24 h. Cytomix-induced HO-1 expression peaked at 4 h, returning to baseline by 24 h, whereas HO-2 expression remained unchanged. This increase in HO-1 expression could not be explained by an increase in NO production as inducible NO synthase expression increased between 12 and 24 h. However, the NO donor NOC-18 (500 microM) increased HO-1 expression twofold and HO activity 25-fold, whereas cytomix treatment increased HO activity eightfold. NO induction of HO-1 was not mediated via guanylyl cyclase and was not attenuated by 1 microM dexamethasone, although dexamethasone increased HO-2 protein. Therefore, airway epithelial cells express HO-2 and can express HO-1; thus, the epithelium may be a source of increased CO in airway diseases.     

脂多糖刺激下大鼠腹膜间质细胞IL-18、IL-6的表达和氧化应激的影响

目的:研究脂多糖刺激下大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)IL-18、IL-6和氧化应激产物丙二醛(MDA)的表达。方法:原代培养RPMC,用不同浓度脂多糖(1、10、100 mg/L)刺激RPMC 6 h;10 mg/L脂多糖刺激RPMC 3、6、12、24 h。用real time-PCR法检测IL-18mRNA的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-18和IL-6的蛋白水平,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA的含量。结果:与正常对照组比较,脂多糖刺激下RPMC IL-18、IL-6和MDA的表达明显增加(P<0.05),且呈浓度依赖性;随着刺激时间的延长,上述指标呈递增趋势,IL-18于12 h达高峰。结论:脂多糖刺激下RPMC促炎症因子IL-18、炎症因子IL-6及氧化应激产物MDA的表达均增加,引起持续放大的炎症氧化反应,损伤腹膜导致超滤失败。     

PI3K/Nrf2通路在内毒素休克兔肾损伤中的作用

 目的: 探讨磷脂酰肌醇3-激酶/核因子E2相关因子2(PI3K/Nrf2)信号通路在内毒素休克兔急性肾损伤中的作用。方法: 健康清洁级雄性新西兰大白兔50只,随机分为5组(每组10只):对照组(C组)、内毒素休克模型组(L组)、渥曼青霉素+内毒素休克组(WL组)、渥曼青霉素组(W组)和二甲基亚砜组(D组)。W组、WL组经耳缘静脉注射渥曼青霉素0.6 mg/kg,D组注射二甲基亚砜0.08 mL/kg,C组和L组注射等容量生理盐水。30 min后,L组和WL组静脉注射脂多糖5 mg/kg(溶于2 mL生理盐水),C组、W组和D组注射等容量生理盐水。注射脂多糖或生理盐水后6 h处死兔,取肾组织进行肾损伤评分(HSK),测定血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和尿α1-微球蛋白(α1-MG)浓度,检测肾组织MDA含量及SOD活性,检测肾组织Nrf2和HO-1的mRNA总Akt蛋白、p-Akt蛋白、总Nrf2蛋白、p-Nrf2蛋白、核Nrf2蛋白和HO-1蛋白水平。结果: 与C组、W组及D组比较,L组和WL组HSK、BUN、Cr、α1-MG及MDA含量升高,SOD活性降低,肾组织Nrf2和HO-1的mRNA、p-Akt蛋白、Nrf2总蛋白、p-Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的水平上调(P<0.05)。C组、W组和D组之间上述指标差异无统计学显著性。与L组比较,WL组HSK、BUN、Cr、α1-MG及MDA含量升高,SOD活性降低,肾组织Nrf2和HO-1的mRNA、p-Akt蛋白、Nrf2总蛋白、p-Nrf2蛋白、Nrf2核蛋白及HO-1蛋白的水平降低(P<0.05)。结论: PI3K/Nrf2通路激活是内毒素休克诱发兔急性肾损伤时机体的适应性调节反应机制之一。