人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态

背景:研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复.然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态.设计、时间及地点:免疫组织化学水平的开放性实验,于2007 05/2008 04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供.方法:取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2 d将标有5'-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况.结果:5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广.移植后1周,脑组织切片见5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5' -溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5' -溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞.移植后2周,5' -溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞.     

人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活和分化

背景:神经干细胞移植可明显改善受损的神经功能,但在体内外多种因素的影响下,移植的神经干细胞其分化数量和分化方向受到限制.目的:观察人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活、迁移和分化情况.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2007-04/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:SD雌性大鼠30只,由中国医学科学院实验动物研究提供.流产胎儿由泸州医学院附属医院妇产科提供.方法:取流产胎儿大脑皮质,剪碎后消化离心,过滤后取沉淀细胞重新悬浮,加入含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、白血病抑制冈子的DMEM/F12培养基,体外培养获得人胚神经干细胞.30只大鼠通过结扎颈外动脉建立脑梗死模型,行走时向右侧转圈者为成功模型,剔除5只无上述明显症状的失败模型鼠.于造模后24 h,以前囟尾侧0.8 mm,中线右外侧1.2 mm为注射点,每只大鼠移植行BrdU标记的1×109 L-1人胚神经干细胞悬液10 μL,深度为硬脑膜下3.0～3.2 mm.主要观察指标:免疫组织化学及免疫荧光染色观察植入的人胚神经干细胞在脑梗死区的存活、迁移和分化状态.结果:人胚神经干细胞体外培养48 h后聚集成球悬浮生长,传三四代后加入血清诱导可见巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,发出绿色荧光并聚集成球.BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后第2,4 周均可见其在脑梗化区存活片向周围迁移,且第4周时迁移的范围更广.移植后2周,皮质颗粒层和皮质下均见较多的BrdU阳性细胞,目BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸件蛋白双阳性细胞;移植后4周脑梗死区BrdU阳性细胞数明显减少,主要存在于脉络丛和微血管中,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞能存活于脑梗死的环境中,并逐渐分化成神经元或星形胶质细胞.移植后期脑实质内存活的神经干细胞明显减少,大量迁移到侧脑室脉络丛和脑表面微血管内,被内皮吞噬系统消化.     

人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态（英文）

背景：研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复。然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程。目的：观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态。设计、时间及地点：免疫组织化学水平的开放性实验,于2007-05/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成。材料：纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供。方法：取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞。通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2d将标有5＇-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染。主要观察指标：应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况。结果：5＇-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广。移植后1周,脑组织切片见5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞。移植后2周,5＇-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5＇-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5＇-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞。结论：人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞。     

大鼠脑损伤对移植人胚神经干细胞存活和分化的影响

目的 探讨大鼠脑液压冲击伤(FPI)后对植入的人胚神经干细胞(HNSCs)存活和分化的影响。方法 取8周龄人胎儿大脑皮层细胞，体外培养获得神经干细胞(NSCs)，巢蛋白免疫荧光染色；SD大鼠制作FPI模型．于伤后24h在损伤区移植标有5-溴脱氧脲嘧啶(BrdU)的HNSCs，1周和4周后处死大鼠，邻片行BrdU／微管相关蛋白-2(MAP-2)和BrdU胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学双染。结果 HNSCs移植后1周可见BrdU阳性细胞向周围迁移，且BrdU／MAP-2双阳性细胞多于BrdU GFAP双阳性细胞；移植后4周BrdU阳性细胞迁移的范围更广，但细胞数量明显减少，脉络丛和微血管中可见BrdU阳性细胞．BrdU／GFAP双阳性细胞多于BrdU／MAP-2双阳性细胞。结论 HNSCs能存活于损伤区域，移植后逐渐分化为星形胶质细胞．且易被内皮吞噬细胞吞噬。     

脑溢安对大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的:应用血清药理学方法研究脑溢安对体外培养促神经干细胞的分化作用,旨在进步阐明脑溢安的脑保护机制。方法:从新生3d大鼠海马中分离神经干细胞,按不同培养方法进行分组,加神经干细胞基础培养液为空白组。于神经干细胞基础培养液中加50mL/L脑溢安血清为实验组。于神经干细胞基础培养液中加50mL/L正常血清为对照组。加入含50mL/L脑溢安血清的培养基中培养。在培养的第2天和第7天,用免疫细胞化学法计数Nestin,NF-200,GFAP,O4四类免疫阳性细胞的变化。结果:在培养的第2天,空白组Nestin阳性细胞最多,占数细胞总数的96.1%是实验组和对照组的8～11倍,其次是胶原纤维酸性蛋白细胞(glialfibrilleryacidicprotein,GFAP)、O4细胞,NF-200细胞最少,仅占细胞总数的3.83%;实验组以NF-200阳性细胞最多,占细胞总数的42.83%,分别为空白组11.3倍和对照组的1.2倍,其次是GFAP细胞,但较对照组少。培养的第7天,空白组仍以Nestin阳性细胞为最多,其他三类细胞与第2天比较无明显差异;实验组仍以NF-200为最多,占细胞总数的43.85%,其次是GFAP,O4细胞,Nestin细胞最少。培养7d后,实验组细胞的凋亡率(4.85%)与对照组(15.32%)比较差异有显著性意义(χ2=6.04,P<0.05)。结论:脑溢安具有促进神经干细胞向神经元方向分化及促进神经细胞存     

中药诱导大鼠骨髓间质干细胞分化的实验

背景体外定向诱导分化可使骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨、肌肉细胞、神经元样细胞等,而中药是否能对大鼠骨髓间质干细胞有诱导分化作用呢?目的研究SD大鼠MSCs体外扩增培养及用中药定向诱导分化为神经元样细胞的功效.设计以细胞为研究对象,重复观察测量,探索性研究.单位一所医学院病理生理学教研室.材料实验用骨髓取自经检验健康的SD雄性大鼠.方法通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养,流式细胞仪检测其表面抗原表达,多种中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志.主要观察指标①MSCs分离和扩增结果.②MSCs表面抗原及神经元样细胞鉴定结果.结果大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.流式细胞仪检测结果显示CD14,D11α,D34,D38,D45,D80,D86为阴性,D29,D44,D90,D105,D166呈阳性.黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导1～3 h后大部分MSCs转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶、巢蛋白呈阳性,胶质纤维酸性蛋白阴性.结论SD大鼠骨髓间质干细胞是具多向分化潜能的细胞,具有较强的增殖、自我更新能力.在适宜的诱导条件下,可以分化为神经元样细胞.     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的:建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术;观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法:分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织,经消化及机械吹打后,用悬浮培养的方法,获得细胞克隆;用有限稀释法,得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆;用免疫细胞化学方法,鉴定神经干细胞。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并具有增殖的能力;原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性;单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力,是属于中枢神经系统的干细胞。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7d,进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P<0.01或0.05)。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均>0.05。结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响

目的：前期体内动物模型实验说明，通心络可能具有影响神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化的作用。实验拟观察通心络对大鼠胚胎神经干细胞源性神经细胞谱系的影响以及时效、量效的关系。 方法：实验于2007—06／10在南方医科大学机能学实验室完成。①实验材料：孕12～14dSD大鼠由南方医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。通心络，主要成分为人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍、冰片等，由石家庄以岭药业股份有限公司生产，国药准字Z19980015。通心络含药血清的制备：按大剂量组1g／（d·kg）、小剂量组0．5g／（d·kg）分别予大鼠通心络混悬液灌胃，7d后抽血离心，吸取血清，过滤消毒，分装，-70℃冻存备用。②实验方法：自孕12～14d大鼠胚胎中分离培养神经干细胞，取第3代细胞分别给予大、小剂量组通心络含药血清干预。以添加普通血清干预的为对照。③实验评估：于培养1，3，7d通过免疫荧光染色观察各种类型神经细胞所占比例。 结果：①神经干细胞经通心络含药血清干预后1d，仅在大剂量组海马齿状回有极少数细胞呈BrdU（＋）GFAP（＋），其余细胞都呈BrdU（＋）Nestin（＋），小剂量组和对照组均为BrdU（＋）Nestin（＋）细胞。②经通心络含药血清干预后3d，大剂量组、小剂量组和对照组Nestin（＋）、13tubulin（＋）、GFAP（＋）细胞比例差异有显著性意义（P〈0．01），GalC（＋）细胞比例差异无统计学意义（P〉0.05）。③大鼠胚胎神经干细胞经通心络含药血清干预后：各组Nestin（＋）细胞比例先降后升：13tubulin（＋）细胞比例大剂量组持续上升，小剂量组和对照组先升后降；GFAP（＋）细胞比例大剂量组先升后降，小剂量组和对照组持续上升，GalC（＋）细胞比例大、小剂量?     

胎鼠神经干细胞的生长、增殖及分化特点观察

目的：建立神经干细胞的分离、培养、分化及鉴定技术；观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点。方法：分离胎鼠大脑皮质及皮质下组织，经消化及机械吹打后，用悬浮培养的方法，获得细胞克隆；用有限稀释法，得到来源于同一细胞的亚细胞系克隆；用免疫细胞化学方法，鉴定神经干细胞。结果：从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织，经原代和传代培养均可形成细胞克隆，并具有增殖的能力；原代和传代细胞抗原-nestin呈阳性；单细胞克隆能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论：用此方法分离、培养的细胞具有自我更新和分化潜能、有很强的增殖能力，是属于中枢神经系统的干细胞。     

半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞原位增殖及定向分化

背景：半乳凝素1表达于室管膜下区的星形胶质细胞中并诱导其分化，分化的星形胶质细胞可明显提高脑源性神经生长因子的产生。目的：观察半乳凝素1诱导脑损伤大鼠内源性神经干细胞的原位增殖和定向分化效果。设计、时间及地点：细胞学体内观察实验，于2007—03／11在佳木斯大学神经科学研究所完成。材料：纯种清洁级成年Wistar大鼠48只，随机分为模型组、药物组，24只／组。半乳凝素1为北京晶美生物工程公司产品。方法：两组大鼠均采用线栓法制作局灶性大脑中动脉闭塞模型。造模后24h，药物组经右侧侧脑室注入10uL浓度为0．2g／L的半乳凝素1，模型组注射等量生理盐水。分别于缺血再灌注后3，7，14，28d处死大鼠，取脑组织制作石蜡切片，处死前1d腹腔注射Brdu。主要观察指标：免疫组织化学染色检测海马齿状回颗粒细胞层下区Brdu和巢蛋白阳性细胞的表达，免疫荧光双标法检测海马齿状回颗粒细胞层下区胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达。结果：模型组脑缺血后3dBrdu、巢蛋白阳性细胞开始增加，7d增殖达高峰，14d后表达开始下降，28d后下降至最低。药物组脑缺血后3d两种阳性细胞均明显增加；7d增殖达高峰，半定量分析Brdu、巢蛋白阳性细胞数分别是模型组的1．8倍和2倍：14d后开始下降；28d降至最低，但仍明显多于模型组俨〈0．05）。脑缺血后各时间点两组Brdu^＋／胶质纤维酸性蛋白^＋细胞基本相似（P〉0．05）；药物组脑缺血7dBrdu^＋／神经元特异性烯醇化酶^＋细胞开始大量增多，28d达高峰，半定量分析所有BrdU^＋细胞中约27％表达神经元特异性烯醇化酶，明显高于模型组（P〈0．05）。结论：半乳凝素1在大鼠脑缺血后可激活内源性神经干细胞的原位增殖及分化，且分化后表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶阳性细胞明显增多。     

人神经干细胞移植到缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑内的存活及分布

目的:新生儿缺氧缺血性脑病是导致脑性瘫痪的重要原因,至今缺乏有效疗法.将体外培养的人神经干细胞经脑室移植入缺氧缺血性脑损伤新生鼠,观察植入细胞在宿主脑内的存活、迁移及分化.方法:实验于2005-01/09在解放军海军总医院儿科实验室完成.①对象:神经干细胞来源于孕12周流产的人胎儿脑组织,孕妇签署知情同意书,符合医院伦理委员会规定.清洁级SD新生鼠80只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,40只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.②实验方法:取人胚胎脑组织,机械分散法分离单个核细胞,接种于添加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中,获取生长旺盛的人神经干细胞球,制成单细胞悬液,浓度约为5.0×1011L-1,培养6 d后行PKH标记用于植入后示踪.两组新生鼠均建立缺氧缺血性脑损伤模型,造模后3 d,细胞移植组损伤侧脑室缓慢注入5 μL人神经干细胞悬液,模型对照组于相同部位注入等量生理盐水.③实验评估:取未经PKH标记的细胞球, 通过免疫细胞化学染色鉴定巢蛋白的表达及其向神经元、星形胶质细胞的分化情况.分别于细胞移植后1,2,4周及3个月,常规取脑组织,行免疫组织化学和荧光分析,观察植入后细胞存活及分布情况.结果:在造模及细胞移植过程中,因麻醉、出血细胞移植组新生鼠死亡5只,模型对照组死亡7只,存活率85%～90%.①神经干细胞的鉴定及分化:80%活细胞巢蛋白呈阳性表达,并可分化为神经元、星形胶质细胞.②神经干细胞植入后存活及分布情况:植入后1周,神经丝蛋白阳性细胞多位于损伤侧皮质及海马处,纹状体、脑干、小脑、嗅球也有少量分布.植入后2周,海马和皮质可见神经丝蛋白阳性细胞,胞体伸出的神经微丝更长,细胞数量与1周时基本相似.植入后4周及3个月时PKH阳性细胞数量明显减少.结论:在含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子的N2培养基中形成的人神经干细胞球,具有良好的增殖能力,可分化为神经元,移植至缺血缺氧新生鼠脑中能够向损伤区迁移,分布范围广.     

人胚脑源性神经干细胞特性及免疫原性研究

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞特性及免疫原性,为神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)移植治疗神经系统损伤奠定基础。方法:取孕14周流产胚胎,无菌分离制备大脑神经细胞悬液,用CD133标记的免疫磁珠分选NSC,提取NSCRNA,进行RT-PCR探测MHC-I,MHC-II类分子mRNA转录;用流式细胞术检测细胞表面MHC-I,MHC-II类分子的表达;用正常成人外周血单个核细胞与培养NSC共培养和MTT比色分析法观察淋巴细胞增殖反应;将NSC小鼠脑内接种,进行组织染色观察细胞移植部位的组织学变化。结果:新分离和传代的NSC均发生MHC-I,MHC-II类分子mRNA转录,MHC-I类分子在NSC表面的表达百分率为(5.66±0.37)%,NSC在体外能诱发淋巴细胞增殖反应,A值为1.09±0.48和1.15±0.29,与阴性对照比差异有显著性意义(P<0.05)。NSC小鼠脑内移植具有修复神经损伤作用,局部无淋巴细胞浸润和炎症。结论:人胚脑源性神经干细胞具有免疫原性,但直接脑内接种未发现引起明显的移植排斥反应。     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及自然分化的初步观察

目的神经干细胞体外培养的成功是进一步研究其分化机制的基础,从胚胎大鼠脑室下区分离、培养、鉴定神经干细胞(neuralstemcells,NSCs),并观察其向神经元的分化情况。方法分离胚胎SD大鼠脑室下区的组织,采用无血清原代及传代培养方法,获得具有克隆能力的细胞群;应用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞并检测分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达;应用流式细胞检测技术观测神经干细胞随时间向神经元的分化情况。结果从胚胎大鼠脑室下区分离培养的细胞群具有克隆增殖能力,表达神经上皮干细胞蛋白(nestin),分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原;随着贴壁后分化时间的延长,表达nestin的细胞数量从80.5%下降到10.9%,而神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)阳性细胞数量则从1.1%上升到31.6%。结论用本方法分离的细胞具有自我更新和增殖能力,并具有多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞;随着分化时间的延长,神经干细胞数量下降,而神经元比例有明显上升。     

神经干细胞在创伤性脑损伤灶周边的成活和迁移

背景:成年人中枢神经系统再生困难,颅脑损伤后,损伤灶周边区域神经细胞的存活数量直接影响患者的预后.如何有效地使移植入创伤性脑损伤灶周边的神经干细胞存活分化,是目前神经修复再生研究的重点.目的:探讨神经干细胞移植入大鼠创伤性脑损伤灶周边的成活、迁移和分化情况.方法:利用无血清培养技术,加入表皮生长因子、碱性成纤维生长因子诱导刺激大鼠胚胎源性前脑神经干细胞生长增殖,并存体外进行克隆培养,移植前行BrdU标记,采用免疫组化和免疫荧光法检测其增殖特性和多向分化潜能,并观察其移植到Fenney's落体脑损伤模型鼠脑皮质内的成活和辽移情况.结果与结论:免疫组化及免疫荧光检测结果显示克隆细胞球呈nestin和BrdU阳性,分化后呈NSE,GFAP,MAP-2阳性.免疫组化及荧光双标检测结果显示移植后7,14 d损伤灶周边散在BrdU阳性细胞.并且GFAP阳性细胞增多.提示前脑神经干细胞在体外培养中能够增殖,并分化为神经元和神经胶质细胞,移植后能够在创伤性脑损伤灶周边存活和迁移,形态上显示出与脑组织整合的特点.     

应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化

目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞。方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成。①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20μg/L、表皮生长因子20μg/L、100U/mL青霉素、0.1g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养。3～5d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞。取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液。②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5d。常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞。对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液。③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率。RT-PCR检测标志性基因的表达。结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24h内聚集成细胞球并悬浮生长。免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多。第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性。当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性。RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达。另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin。②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%。结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞。     

移植的神经干细胞在帕金森病模型小鼠脑内的存活与分化

目的 观察移植的神经干细胞在帕金森病(PD)模型小鼠脑内的存活与分化。方法 C57BL／6小鼠皮下注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)造成PD模型。用5-溴尿嘧啶(BrdU)标记的神经干细胞分别移植到模型鼠的一侧或两侧纹状体。用酪氨酸羟化酶免疫荧光评价MPTP对黑质多巴胺能神经元的毒性。用免疫组织化学和激光共聚焦鉴定移植的神经干细胞在体内的存活与分化。结果 MPTP使黑质酪氨酸羟化酶阳性细胞显著减少；在细胞移植的纹状体内发现有明显散在分布的BrdU阳性细胞，表明移植的神经干细胞已经存活；激光共聚焦显示部分BrdU阳性细胞已分化为酪氨酸羟化酶阳性细胞。结论 移植的神经干细胞能在PD模型小鼠纹状体存活，并可分化出特定的多巴胺能神经元。