霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。     

人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

嗜肺军团菌flaA基因的克隆及原核融合表达

目的 构建嗜肺军团菌鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)的融合表达载体,并在原核系统表达,为进一步研究鞭毛亚单位蛋白的致病作用和免疫保护性提供前提条件.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌flaA基因,与带有硫氧还蛋白基因(Trx)的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-flaA融合蛋白, 用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定.结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了嗜肺军团菌1435 bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-flaA,SDS-PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET-flaA在大肠杆菌中得到了高效融合表达.结论 成功构建嗜肺军团菌flaA基因重组质粒,并在原核系统中得到了高效表达.     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术,扩增出357 bp的HCV核心蛋白基因片段,双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒pET-32a/HCVc。转化到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况,Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达;SDS-PAGE电泳显示其在32 000处有一条融和表达条带;Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,而且表达产物有良好的抗原性。     

幽门螺杆菌BIB原核表达工程菌的构建及微生物学特性分析

目的构建融合了幽门螺杆菌尿素膜通道蛋白（Ure I）、尿素酶B亚单位（UreB）的表位基因及霍乱毒素B亚单位（CTB）的原核表达质粒pET28a（＋）／ct B／ure I-B（简称BIB）及其原核表达工程菌,并研究其生物学特性。方法参考基因库中ure l、ure B、ct B的基因序列,合成不舍信号肽的ct B基因及ure I、ure B优势表位基因,串联融合,形成多靶点重组ct B／ure I-B基因（简称BIB基因）,并构建pET28a（＋）／BIB原核表达质粒,经限制性内切酶Nco I、Xho I酶切以及DNA测序鉴定正确后,将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建含BIB基因的原核表达工程菌。经乳糖诱导后,SDS-PAOE电泳检测重组蛋白（rBIB）,Western blot及肌注BALB／c小鼠实验检测rBIB的免疫反应性和免疫原型。结果构建的原核表达质粒pET28a（＋）／BIB,经双酶切和测序分析显示,构建的BIB基因与设计序列100％一致。乳糖诱导后,SDS-PAGE电泳显示在33kD左右出现一条明显蛋白条带,Western blot检测在33kD左右出现特异反应条带,肌注免疫BALB／c小鼠产生了较高的抗体水平。结论成功构建了pET28a（＋）／BIB原核表达质粒及BIB原核表达工程菌,该工程菌可表达重组蛋白rBIB,且该重组蛋白具有良好的免疫反应性及免疫原性。     

人肠三叶肽在大肠杆菌中的表达

目的 构建三叶肽(TFF)原核重组质粒pET32a-TFF3,实现TFF3融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达并鉴定表达产物.方法 用Trlzol试剂提取人结肠组织mRNA,逆转录后经PCR扩增得到不含信号肽的TFF3编码序列,插入原核表达载体pET32a,构建pET32a-TFF3重组质粒,转化大肠杆菌BL-21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白.结果 酶切和测序证实pET32a-TFF3重组质粒构建成功.SDS-PAGE分析表明在IPTG浓度为1 mmol/L时,诱导6 h后蛋白表达量最大.Western blot分析表明,TFF3融合蛋白相对分子质量约为24×10~3,其能与兔源TFF3抗体特异性结合.结论 成功构建了pET32a-TFF3重组质粒,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为后续深入研究TFF3奠定了基础.     

高纯度可溶性嵌合蛋白VEGI+的表达纯化

目的:制备纯化的新型血管生长抑制剂可溶性嵌合蛋白VEGI ,为进一步研究其活性奠定基础.方法:应用PCR方法制备血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)与寡肽CTTHWGFTLC相嵌合的融合基因VEGI ,将PCR产物克隆至pGEM-T载体中,经酶切及测序鉴定后,与原核表达载体pET30a( )重组,构建重组表达载体pET30a-VEGI ,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,纯化并鉴定表达产物.结果:成功扩增融合基因VEGI ,构建的重组质粒pET30a-VEGI 酶切鉴定结果与预期一致,诱导后表达产物以包涵体为主.SDS-PAGE电泳及Western印迹结果表明,复性纯化后的嵌合蛋白VEGI 相对分子质量约为23 000,纯度约为90%.结论:成功构建了重组表达载体,并在大肠杆菌诱导表达,亲和层析纯化后获得纯度较高的可溶性嵌合蛋白VEGI .     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定

目的：构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法：设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因（双酶切纯化后）定向克隆至质粒pET29a（＋）中,转化到大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹（Western blotting）分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性。结果：重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量（Mr）为28950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带。结论：成功构建重组表达质粒pET29a（＋）-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性。     

重叠PCR合成乙型肝炎病毒核心抗原基因及其在大肠杆菌中表达

目的：构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）基因的融合表达质粒并在原核系统表达,为治疗性疫苗的研制奠定基础。方法：根据大肠杆菌偏爱密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条长约40bp寡核苷酸片段,将重叠PCR合成的HBcAg基因插入到pET30a中,经限制性核酸内切酶酶切鉴定和核酸序列分析无误后转化BL21（DE3）中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况。结果：酶切和测序鉴定表明,成功构建了重组质粒pET30a／rmcAg,SDS—PAGE分析显示目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中获得高表达,表达量占总菌体蛋白的64．3％。结论：应用重叠PCR合成HBcAg基因并在大肠杆菌中获得了高效表达。     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a(+)与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a(+)载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta (DE3),用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni+-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a(+)与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.     

重组沙门菌侵袭蛋白A的原核表达与纯化

目的在大肠杆菌中表达重组沙门菌侵袭蛋白A,并对表达产物进行分离和纯化。方法提取沙门菌基因组模板,PCR扩增侵袭因子invA基因目的片段,插入表达质粒载体pET-30c（＋）中,构建pET—invA重组子,经双酶切和测序证实后,转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β-D硫代半乳糖（IPTG）诱导重组蛋白表达,镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组蛋白,SDS—PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果成功构建了沙门菌pET—invA大肠杆菌表达重组子,实现了该蛋白在大肠杆菌中的高效表达,分离纯化的表达产物纯度达到电泳纯。结论沙门菌侵袭蛋白A的成功表达和分离纯化,为该蛋白的免疫学性能研究、相应抗体的制备以及沙门菌快速检测方法的建立奠定了基础。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

脑源性神经营养因子原核表达载体的构建及其生物学活性分析

目的：构建含有脑源性神经营养因子（BDNF）的原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达后研究其生物学活性。方法按照大肠杆菌BL21（DE3）的密码子偏好性进行密码子优化,人工合成大鼠BDNF的基因序列并构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF。经限制性内切酶（Bam HI ,Hind Ⅲ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达后,用SDS‐PAGE检测重组蛋白的表达情况,以BDNF特异性抗体采用Western blot法鉴定BDNF蛋白抗原性,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测BDNF蛋白对 PC12细胞活力的影响。结果构建的pET28a（＋）／BDNF经双酶切和测序鉴定与设计序列100％一致;工程菌经IPTG诱导后在相对分子质量17×103左右有1条明显蛋白条带,Western blot显示目的蛋白能够与特异性BDNF抗体反应;不同浓度BDNF蛋白处理组与对照组比较细胞活力均有不同程度的增加,其中50 ng／mL BDNF处理组效果最优。结论成功构建原核表达质粒pET28a（＋）／BDNF及相应的原核表达菌,该工程菌表达的BDNF蛋白具有良好的生物学活性。     

乙型肝炎核心抗原基因的合成及其原核表达载体的构建

目的:合成乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因并构建原核表达载体.方法:根据大肠杆菌偏嗜性密码子,利用Synthetic Gene Designer软件对HBcAg基因进行密码子优化,分成24条相互重叠的寡核苷酸片段,采用PCR法扩增获得完整的HBcAg基因,经BamH I和Xho I双酶切后定向克隆到pET30a(+),得pET30a(≠)-HB-cAg,经PCR扩增、酶切及测序鉴定后,定点突变法改正错误位点.之后将重组子转入BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达情况,Western Blot检测蛋白抗原性.结果:成功构建了重组质粒pET30a(≠)-HBcAg,SDS-PAGE分析显示目的蛋白主要以包涵体的形式在大肠杆菌表达,表达效率64%左右;Wesbern Blot显示表达产物具有较好的抗原性.结论:成功合成HBcAg基因并构建了原核表达载体.     

Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因的克隆、原核表达及初步鉴定

目的构建Panton-Valentine杀白细胞毒素(PVL)lukS-PV基因表达载体,并在大肠杆菌中表达相应蛋白。方法提取PVL阳性金黄色葡萄球菌的基因,PCR方法扩增lukS-PV,A-T克隆至pGEM-T载体上,经PCR、双酶切和测序鉴定后,亚克隆到pET28a( )表达载体上,鉴定并转化至Rosetta(DE3)plys表达宿主菌中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果构建了lukS-PV-pGEM-T和lukS-PV-pET28a( )重组质粒,经PCR扩增和限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切均得到939bp的目的片段,基因测序与GENEBANK中的PVL的序列一致,宿主菌表达带HIS标签的重组LukS-PV蛋白。结论成功克隆lukS-PV基因和构建重组表达质粒,并在宿主菌中成功表达重组LukS-PV蛋白,为PVL免疫学检测方法的建立奠定基础。     

幽门螺杆菌多表位重组原核表达工程菌的构建及表达特性研究

目的 构建含有幽门螺杆菌尿素酶（UreI、UreB）及粘附素（HpaA）的多表位原核表达质粒pET28a(+)/ureI-ureB-hpaA〔pET28a(+)/IBA〕及相应的原核表达工程菌,研究其表达特性。 方法 通过生物信息学方法从ureI 、ureB和 hpaA基因中筛选T细胞和B细胞优势表位基因序列,人工合成并构建原核重组表达质粒pET28a(+)/IBA。经限制性内切酶（Nde Ⅰ,Xho Ⅰ）酶切鉴定及DNA测序鉴定后导入大肠杆菌BL21 (DE3) 。该工程菌经IPTG诱导后,用SDS-PAGE检测重组蛋白（rIBA）的表达情况,以抗幽门螺杆菌悉尼株（SS1株）特异卵黄抗体采用Western blot检测rIBA的抗原性。 结果 构建的多表位原核表达质粒pET28a(+)/IBA双酶切和测序鉴定与设计序列100%一致。工程菌经 IPTG 诱导后SDS-PAGE电泳显示在相对分子质量40×10 ³左右有一条明显蛋白条带,Western blot显示有相应位置特异反应条带。 结论 成功构建幽门螺杆菌多表位重组原核表达质粒pET28a(+)/IBA及相应原核表达工程菌,该工程菌表达的rIBA具有抗原性,表明该重组蛋白与幽门螺杆菌有高度相关性。     

嗜肺军团菌momp原核重组质粒的构建和表达

目的构建嗜肺军团菌momp原核重组质粒,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌LP1型DNA为模板,PCR扩增得到momp基因,定向克隆至原核载体PET32a（＋）中,经酶切及测序鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳进行分析,其产物用亲和层析法进行纯化。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒pET-momp,诱导表达及纯化出50KD的蛋白。结论成功构建momp基因的原核表达载体并得到高效表达。