腺病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2的下调及生长抑制效应

目的:探讨采用腺病毒做为载体介导基于RNA干涉的针对高HER2肿瘤的基因治疗的可能性。方法:构建HER2-绿色荧光蛋白融合蛋白表达质粒pHER2-GFP,并与9种针对HER2不同靶序列的siRNA表达质粒分别共转染CHO-K1细胞,根据荧光蛋白表达量从中筛选出沉默效率最高的质粒。将筛选出的质粒转染HER2高表达乳腺癌SKBR3细胞,检测它们对HER2表达的影响。随后,将siRNA转录单元克隆入腺病毒载体,成功包装病毒后感染SKBR3细胞,再次测定其下调HER2的效应及其对细胞生长的影响。结果:2种有效下调HER2表达的质粒被筛选出来。将此2种质粒所含siRNA转录单元包装入腺病毒后仍然保持了原有的基因沉默效应。HER2下调增加了SKBR3细胞中G1期细胞的比例,并且诱导部分细胞凋亡。MTT和细胞长期增殖抑制实验表明腺病毒介导的RNA干涉抑制了SKBR3细胞生长。结论:重组腺病毒介导的RNA干涉能够下调HER2的表达并且对高表达HER2的乳腺癌细胞有生长抑制作用。     

siRNA表达载体介导靶向NADH-细胞色素b5还原酶基因的RNA干扰实验研究

目的探索经载体介导的RNA干扰抑制人NADH-细胞色素b5还原酶（bSR）基因表达的可行性。方法应用网络在线软件设计并合成两条针对b5R mRNA的RNA干扰的DNA模板片段，分别将其克隆至经过改建、带有neo基因的pSilencer1．0-U6载体上，构建成siRNA真核表达载体；脂质体转染法将上述重组质粒转入人肺成纤维细胞和BEL-7402肝癌细胞株。通过半定量RT-PCR和荧光定量RT—PCR分析，检测所构建的重组siRNA真核表达载体对b5R基因表达的干扰效应。结果获得两个能在细胞内生成靶向b5R基因siRNA的重组载体pSib5R-1和pSib5R-2；其中pSib5R-2对成纤维细胞b5R mRNA的抑制率达81.7％，对BEL-7402细胞b5R mRNA的抑制率达60％。结论两种细胞b5R基因的表达均可被载体介导的RNA干扰有效抑制；成功构建了针对b5R基因的siRNA表达载体，为建立稳定表达siRNA的、b5R酶缺陷的细胞模型提供了实验基础。     

人HSV-1 UL40基因重组质粒的构建及其在siRNA筛选中的应用

目的： 快速筛选出高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA，为进一步应用RNA干扰的相关研究奠定基础。方法: 应用RT-PCR扩增人HSV-1 F株UL40基因，将其连接到pEGFP-N1构建pEGFP-N1-UL40融合蛋白表达质粒。将化学合成的针对UL40基因的siRNA与重组质粒共转染Vero细胞，通过观察绿色荧光蛋白报告基因的表达筛选高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。结果: 倒置荧光显微镜观察发现设计的4对siRNA中siRNA3和siRNA4能明显降低绿色荧光蛋白的表达，流式细胞仪检测证明siRNA3和siRNA4对目的基因沉默效率分别达到76.99％和84.00％。结论: 成功构建了人HSV-1 UL40基因融合表达载体pEGFP-N1-UL40，并利用该载体筛选出2对高效沉默人HSV-1 UL40基因的siRNA。     

针对人caspase-8基因的siRNA的载体的构建及其沉寂效应检测

目的：设计并构建针对人caspase-8基因mRNA的siRNA表达载体，观察其对转染细胞中的caspase-8的抑制作用。方法：化学合成用于产生针对caspase-8的发夹状的RNA的寡核苷酸，将合成的寡核苷酸链退火形成双链，连接入经Hind Ⅲ和Bgl II双酶切后的pSUPER真核表达载体。对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体介导，把重组质粒瞬时转染入HeLa细胞，RT—PCR、间接免疫荧光检测其对mRNA和蛋白表达的干涉效果。结果：构建了针对人caspase-8基因的RNA干涉真核表达载体pSUPER—C1和pSU—PER—C2，并在人HeLa细胞中有效发挥了对caspase-8基因的干涉作用，而且pSUPER—C1对于caspase-8基因的抑制作用要优于pSUPER—C2。结论：成功地构建了针对人caspase-8基因的siRNA载体，转染HeLa细胞后可抑制caspase-8基因的表达。     

Pokemon基因siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定

目的针对Pokemon基因对于许多肿瘤抑制基因和原癌基因上游的作用,将其作为RNAi的靶基因,构建表达这些siRNA的重组逆转录病毒表达质粒。方法利用Ambion公司的网上设计工具设计针对Pokemon肿瘤基因的4条siRNA序列,并化学合成4对互补的siRNA的DNA片段。将此双链DNA片段克隆到pSilencer 5．1-H1 Retro vector的Bam HⅠ和HindⅢ位点,构建其逆转录病毒重组表达质粒。结果表达人类Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒构建成功。结论我们成功构建了人类Pokemon基因的重组逆转录病毒重组表达质粒,为下一步Pokemon基因的RNA干扰提供了实验依据,并且开辟了肿瘤基因治疗的新思路。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

抑制Coronin-1基因表达的siRNA载体的构建和筛选

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察、实时定量PCR和Western blot法检测其对Coro-nin-1基因表达的影响。结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9%和75.1%。结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coro-nin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定基础。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒在软骨细胞的表达

背景：白细胞介素1受体拮抗蛋白能延缓骨性关节炎进程,通过转基因方法可以使白细胞介素1受体拮抗蛋白表达的增加。 目的：观察重组人重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况。 方法：双酶切法切取重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白的c-DNA片段,通过T4DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上。体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的重组人白细胞介素1受体拮抗蛋白质粒经脂质体转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。 结果与结论：获得重组人pEGFP-C1-IL-1Ra真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确。荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞基因得到表达。     

靶向大鼠TGF-β1基因shRN A真核表达载体的构建及鉴定

构建并鉴定靶向大鼠TGF-β1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体,为探索肝纤维化的基因治疗提供有力工具。根据大鼠TGF-β1基因的mRNA序列设计并合成2条编码shR-NA的特异性寡核苷酸片段,另选通用阴性对照序列HK,将上述片段退火后分别克隆入线性化质粒载体PGenesil-1．1中,构建出含靶基因片段的shRNA真核表达载体PGenesil-TGF-β1-A、PGenesil-TGF-β1-B及PGenesil-HK,行酶切鉴定及测序分析,并采用脂质体介导法体外转染Hela细胞,荧光显微镜观察转染结果。经酶切和测序鉴定证实,构建的shRNA成功插入到载体,重组质粒的插入序列与设计的靶基因片段完全一致,3种重组质粒均能转染入Hela细胞表达绿色荧光。成功构建出靶向大鼠TGF-β1基因的shRNA真核表达载体,为后续研究抗肝纤维化的基因药物奠定了实验基础。     

The immediate early genes of human cytomegalovirus require only proximal promoter elements to upregulate expression of interleukin-1 beta.

Human cytomegalovirus (HCMV) can infect monocytes and macrophages. The immediate early one (IE1) gene product of HCMV positively regulates its own expression, as well as the expression of the interleukin-1 beta (IL-1) gene. This study describes the IL-1 promoter proximal region required for upregulation of IL-1 gene expression by the HCMV IE1 or IE1 plus IE2 gene products. An IL-1 chloramphenicol acetyltransferase (CAT) construct containing the IL-1 genomic upstream sequence from position -1097 to +14 and four additional IL-1CAT plasmids containing progressive deletions of the -1097 to -131 sequence were used to evaluate the effect of the HCMV IE gene products on IL-1 gene expression. IL-1CAT plasmids were transfected into a monocytic cell line, THP-1, with plasmids containing either the IE promoter-regulatory region upstream of the bona fide IE1 (pIE1), IE2 (pIE2), or IE1+2 genes (pIE1+2) or a control plasmid containing the IE promoter-regulatory region alone (pLink760). In the presence of pIE1+2, there was an approximate 15-fold increase in CAT activity compared with the control, pLink760, in cells with CAT plasmids containing the -1097 to +14 IL-1 sequence. Plasmids with progressive deletions of this sequence, including the plasmid containing the shortest upstream segment (-131 to +14) also had an approximate 15-fold increase in CAT activity. The upregulation of IL-1 expression was mediated, primarily, by IE1 and not by IE2. This effect was promoter specific because an IL-1CAT plasmid with a complete deletion of the proximal promoter elements (-234 to +146) did not respond to the HCMV IE gene products.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

TRKC基因体外转染大鼠神经干细胞的方法

目的探讨体外转染TRKC基因的神经干细胞的制备方法。方法利用自行合成的引物进行PCR反应,定向克隆构建TRKC-cDNA质粒并进行DNA测序分析,将pEGFP-C1质粒和TRKC-cDNA质粒进行酶切、重组,构建出pEGFP-C1-TRKC质粒。用脂质体将重组质粒转染到体外培养的大鼠神经干细胞中。用W estern b lot、免疫荧光和MTT法观察转染基因的表达和转基因后神经干细胞的增殖活性。结果成功构建了TRKC-cDNA质粒,DNA测序证明所获得的目的基因与公布序列的一致性为99%,所获得的重组子符合研究要求。pEGFP-C1-TRKC质粒转染到神经干细胞后,宿主细胞能高效、稳定地表达目的基因产物GFP和TRKC。在NT-3作用下转TRKC基因神经干细胞的增殖活性有明显增强。结论以质粒为载体、脂质体为介导可成功地把TRKC基因转染到神经干细胞内,转染基因表达好且具有功能。     

干扰素诱导蛋白Nmi与人巨细胞病毒皮层蛋白UL23相互作用区域的研究

目的:探究干扰素诱导蛋白N-Myc相互作用因子(Nmi)与人巨细胞病毒(HCMV)皮层蛋白UL23相互作用的关键区域。方法:根据前期实验结果,分别将10个不同截短突变型的Nmi构建到原核表达载体p GEX-4T-1上,转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,表达并纯化出带有GST标签的融合蛋白,利用GST-pulldown的方法探究Nmi与UL23相互作用的区域。根据GST-Pulldown实验结果,用同源重组的方法在真核表达载体pc DNA4-Myc上分别构建3个缺失突变型Nmi。将实验组和对照组的Nmi分别与含有Flag标签的UL23质粒共转染至He La细胞中,通过免疫共沉淀法进一步研究Nmi与UL23的相互作用区域。结果:(1)10个截短突变型Nmi与GST基因融合的原核表达载体构建成功;(2)3个缺失突变型Nmi与Myc基因融合的真核表达载体构建成功;(3)GST-pulldown实验证明Nmi与UL23相互作用位点位于Nmi上的第192~202位氨基酸区域;(4)免疫共沉淀法确认Nmi的第192~202位氨基酸区域是与UL23相互作用的区域,与GST-pulldown实验结果一致。结论:Nmi与UL23相互作用的区域位于Nmi上第192~202位氨基酸区域。这为阐明UL23帮助HCMV在宿主体内潜伏的分子机理提供了基础。     

钙粘附蛋白N-cadherin基因RNAi质粒载体的构建与鉴定

目的:构建有效的小鼠神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)基因RNA干扰质粒载体。方法:在小鼠基因库中选择3个靶序列并设计合成相应3对寡核苷酸序列,同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列,然后将以上4对寡核苷酸序列退火后连入pSilencerTM 3.1-H1 hygro质粒并分别命名为pSicad1、pSicad2、pSicad3、pSi-control。酶切和测序鉴定后,将以上重组质粒转染MN9D细胞,用Western Blot和半定量RT-PCR方法检测N-cadherin基因mR-NA和蛋白的表达水平。结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pSilencerTM 3.1-H1 hygro质粒,与对照组相比,pSicad2和pSicad3转染MN9D细胞后,N-cadherin mRNA和蛋白水平的表达均受到明显抑制,其中N-cadherin蛋白水平在pSicad3组下降50%(P0.01)。结论:结果表明已成功构建了小鼠N-cadherin基因RNAi质粒载体,为N-cadherin功能研究奠定了基础。     

The immediate early genes of human cytomegalovirus upregulate expression of the cellular genes myc and fos.

Human cytomegalovirus (HCMV) is an important pathogen of the lung. We determined whether the HCMV immediate early genes (IE1 and IE2) can alter the regulation of the cellular immediate early genes (c-fos and c-myc). Plasmid constructs containing the promoter-regulatory regions c-myc or c-fos upstream of the reporter gene, chloramphemicol acetyl transferase, were co-transfected into T cells (Jurkat cells), monocytes/macrophages (THP-1 cells), or human fibroblast cells with plasmid constructs containing the promoter-regulatory region of the HCMV IE genes upstream of the bona fide IE1, IE2 or IE+2 genes; a plasmid that contained no IE coding region was used as a control. These studies show that both products of the HCMV IE genes markedly upregulated expression of the cellular c-fos and c-myc genes. The viral effects of individual proteins (IE1 or IE2) were dependent both on the promoter-regulatory region of the cellular gene and the cell type. In all cells, the combination of IE1 and IE2 further upregulated both cellular genes, suggesting a synergistic effect of IE1 with IE2. Both of the c-myc promoters (P1 and P2) were up-regulated by the HCMV IE gene products. IE1 and IE2 also upregulated the cells' endogenous c-myc and c-fos genes, as determined by amounts of the respective mRNAs. These studies show that HCMV can markedly alter cellular IE gene expression and that the effects of HCMV IE1 and IE2 proteins are dependent both on the promoter-regulatory region of the cellular gene and the type of cell in which the interaction occurs.     

HBx、MHBs~（t155）真核表达载体构建及在HepG2细胞中的表达

目的建立稳定、高效的HBx、羧基末端截短的中分子表面蛋白（MHBst）体外表达细胞株,以进一步研究HBx、MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及其机理。方法设计特异性引物,采用PCR方法从adr亚型HBV质粒pHBV DNA中扩增HBx、羧基末端截短至155位氨基酸的中分子表面蛋白（MHBst155）编码基因,并定向插入绿色荧光蛋白（GFP）表达载体pEGFP-C1的BglⅡ、KpnⅠ和BglⅡ、BamHⅠ酶切位点,转化宿主菌DH5α,提取质粒,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。采用脂质体介导将空载体、重组质粒分别转染到人肝肿瘤细胞株HepG2中,G418筛选抗性细胞克隆,荧光显微镜下观察GFP表达,挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR、蛋白印迹检测抗性细胞中HBx、MHBst155的mRNA及蛋白水平。结果经酶切及测序鉴定成功构建了pGFP-HBx、pGFP-MHBst155重组表达载体,将空载体及重组质粒转染HepG2,经G418筛选约20 d获得抗性细胞克隆。将带有绿色荧光的抗性克隆扩大培养并经传代40次,细胞仍表达强的绿色荧光。RT-PCR及蛋白印迹检测表明转染重组体的HepG2/GFP-HBx、HepG2/GFP-MHBst155细胞有相应的条带,而空载体、空白对照组未出现条带。结论成功构建了HBx、MHBst155真核重组表达载体pGFP-HBx、pGFP-MHBst155,获得了稳定表达融合蛋白GFP-HBx、GFP-MHBst155的HepG2细胞系,为进一步研究HBx及MHBst蛋白在肝癌发生中的作用及分子机制构建了良好的平台。     

大鼠β防御素2基因RNAi慢病毒载体的构建及效应测定

目的 构建大鼠β防御素2(rBD2)基因RNAi慢病毒重组载体,转染培养细胞,检测其沉默效应,筛选出最佳的RNAi慢病毒载体.方法 序列软件设计3条针对rBD2基因CDS区的siRNA序列,合成单链后退火形成双链DNA,分别与酶切处理的慢病毒载体lentivirus连接构成3个RNAi慢病毒重组载体,再转化细菌,测序鉴定.脂质体法转染细胞,荧光实时定量PCR(RT-PCR)及Western免疫印迹测rBD-2 mRNA及蛋白表达,筛选沉默效果最佳的为LV-shrBD2载体.用慢病毒包装系统对LV-shrBD2进行慢病毒颗粒包装并梯度稀释法测定病毒滴度.结果 凝胶电泳显示3个RNAi慢病毒重组载体的PCR产物为316 bp,测序结果表明序列正确.转染细胞后RT-PCR及Western免疫印迹检测,siRNA序列1构建的重组载体mRNA抑制率达82%,干扰效率最高,为所需的rBD2基因RNAi慢病毒载体LV-shrBD2.包装慢病毒颗粒并调整病毒滴度至1×105ifu/μl.结论 成功构建并筛选出沉默效应最佳的rBD2基因RNAi慢病毒表达载体LV-sh1rBD2,为进一步开展rBD2研究提供了依据.     

PSF不同功能片段融合蛋白的构建及其在细胞内的分布

目的 将人类PSF基因的不同功能片段定向连入pEGFP-C2质粒,使PSF蛋白的各功能片段与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,观察其在HeLa细胞中的表达及定位. 方法 以重组质粒pEGFP-C2-PSF为模板,PCR法扩增出目的基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-C2上,构建重组质粒pEGFP-C2- PSF(Ⅰ～Ⅴ).将构建成功的pEGFP-C2-PSF(Ⅰ～Ⅴ)质粒脂质体法转染HeLa细胞,Western印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位与分布. 结果 成功构建质粒pEGFP-C2-PSF(Ⅰ～Ⅴ),并在HeLa细胞中实现表达;Western印迹检测到融合蛋白GFP-PSF(Ⅰ～Ⅴ);在激光共聚焦显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位. 结论 人类PSF基因的不同功能片段的重组质粒pEGFP-C2-PSF(Ⅰ～Ⅴ)构建成功,可用于标记PSF蛋白的不同功能片段,为进一步研究PSF在信号转导中的作用机制以及其生物学功能奠定基础.     

信号肽-canstatin真核表达载体的构建及其在Eca-109细胞中的分泌表达

目的：构建信号肽-canstatin 真核表达载体并在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。 方法： 利用点突变技术将小鼠纤溶酶原信号肽(SP)序列插入到载体pEGFP-C1 EGFP编码序列起始密码的后面,构建pEGFP-C1-SP载体。以pMD18T-Can为模板, 扩增小鼠canstatin基因，构建信号肽-canstatin分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can。用脂质体转染法瞬时转染人食管癌细胞Eca-109。利用Western blotting检测小鼠canstatin 融合蛋白在Eca-109细胞中的分泌表达。 结果：DNA测序证明所构建的带信号肽的中间载体pEGFP-C1-SP正确;酶切和DNA测序表明信号肽-canstatin 分泌型真核表达载体pEGFP-C1-SP-Can构建正确, EGFP-canstatin融合蛋白在人食管癌细胞Eca-109中分泌表达。 结论： 获得了能分泌canstatin融合蛋白的真核表达载体，并分泌到人食管癌细胞Eca-109的细胞外, 为小鼠canstatin的功能研究及应用于基因治疗提供了实验基础。