HBsAg真核表达质粒及其诱导的小鼠特异性免疫应答

目的 研究HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S在真核细胞中的表达和质粒DNA的免疫效果。方法 应用基因重组技术构建HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S；经酶切和测序鉴定无误后，用阳离子脂质体介导的方法将重组质粒转染HepG2和COS-7细胞，48h后，再ELISA的方法检测重组质粒在细胞中HBsAg的表达，同时同质粒DNA免疫小鼠，用ELISA检测免疫小鼠血清抗-HBs抗体水平；用乳酸脱氢酶释放法检测小鼠肿瘤细胞HBsAg特异性CTL反应。结果 重组质粒pCI-S和pcDNA3.1-S转染的HepG2和COS-7细胞培养上清液和sAg均为阳性。DNA免疫小鼠血清可检测到高滴度的抗-HBs抗体，免疫小鼠脾细胞可检测到校强的HBsAg特异性CTL反应。结论 HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S可在HepG2和COS-7细胞中高效表达，DNA免疫小鼠成功地诱导出抗-HBs和HBsAg特异性CTL反应。     

HSV-2NP6与IL-18真核表达载体的构建与表达

目的在前期筛选的HSV-2gD模拟抗原表位序列P6的基础上,在GenBank上选取与P6序列相对应且相似的HSV-2天然野生株gD的基因序列NP6,以pcDNA3.1(-)为载体、IL-18为佐剂,构建和表达NP6与IL-18串联的重组表达质粒,并观察免疫小鼠后的效果。方法采用串联简并引物PCR法构建重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6和pcDNA3.1-IL18。将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-IL-18和pcDNA3.1-IL-18-HSVNP6肌内注射免疫BALB/c小鼠3次,每次间隔1周。末次免疫后1周眼眶静脉采血,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体滴度、IFN-γ及IL-18含量。结果构建的串联重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6和pcDNA3.1-IL18经酶切及测序显示基因序列完全正确,间接免疫荧光、Western blot检测证实模拟抗原表位序列NP6具有近似天然序列的生物学活性;用表达质粒免疫小鼠,可刺激产生高滴度的特异性抗体,并可产生较高水平的IL-18和IFN-γ。结论成功构建和表达了重组质粒pcDNA3.1-IL18-NP6,表达产物具有免疫原性。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。　方法　用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。　结果　从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。　结论　成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。     

黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位优化的淋病奈瑟菌孔洞蛋白B核酸疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的 分析黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)辅佐的淋病奈瑟菌孔洞蛋白B(PorB)核酸疫苗诱导小鼠的免疫应答水平.方法 PCR法扩增目的 基因porB、ltB、ltB-porB,分别构建3种相应的peDNA3.1(-)真核重组表达载体,经PCR、双酶切及基因测序鉴定后转染Hela细胞,用细胞免疫荧光法鉴定质粒的蛋白表达.将核酸疫苗经鼻饲免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫及细胞免疫应答水平,同时用免疫组织化学法检测porB、ltB、ltB-porB基因在小鼠鼻黏膜内的表达.组间均数比较采用方差分析.结果 构建的真核重组质粒均能在Hela细胞内及小鼠鼻黏膜组织内表达.核酸疫苗免疫组小鼠的生殖道灌洗液PorB特异性sIgA及血清porB特异性IgG水平明显高于对照组(P＜0.01;P＜0.05),且ltB-porB融合基因组特异性sIgA明显高于porB组(P＜0.05);pcDNA3.1(-)/porB组小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4和脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别为(170.04±23.89)pg/mL、(114.68±14.27)pg/mL和1.68±0.19,pcDNA3.1(-)/ltB-porB组分别为(161.42±27.50)pg/mL、(124.16±19.04)pg/mL和1.73±0.28,均高于对照组pcDNA3.1(-)和PBS,差异均有统计学意义(P＜0.01;P＜0.05),高于对照组pcDNA3.1(-)/ltB,差异均有统计学意义(均P＜0.05),但两核酸疫苗免疫组间差异无统计学意义(均P＞0.05).结论 所构建的核酸疫苗分别在Hela细胞及小鼠鼻黏膜组织内获得了表达,经黏膜途径免疫能诱导小鼠产生较高水平的特异性体液免疫和细胞免疫应答,尤其是黏膜免疫应答;证实黏膜佐剂LTB可辅佐PorB诱导小鼠产生高水平的生殖道黏膜免疫.

Abstract：

Objective To investigate the specific humoral immune response and cellular immune response induced by DNA vaccine with Neisseria gonorrhoeae porin B (PorB) fused with B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B (LTB) in mice. Methods Target genes of porB, ltB and ltB-porB were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into eukaryotic vector pcDNA3.1(-). The recombinants were identified by PCR, enzyme digestion and DNA sequencing.The vectors were transfected into Hela cells, and expressed proteins were checked by cytoimmunofluorescence. Female BALB/c mice were intranasally immunized with recombination vectors. The humoral immune response and cellular immune response were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. The expressions of recombination vectors in intranasal mucosal tissues of the immunized mice were detected by immunohistochemistry. The means between groups were compared by analysis of variance. Results All the three recombinants were expressed in Hela cells and intranasal mucosal tissues. The PorB specific IgG in serum and sIgA in vaginal secretions in DNA vaccine immunized mice were significantly higher than those in controls (P＜0.01 ; P＜0.05). Moreover, the sIgA level in pcDNA3.1 (-)/ltB-porB group was higher than that in peDNA3, 1(-)/porB group (P＝0. 002). The levels of interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) in the supernatants and stimulation index (SI) of spleen lymphocyte culture in pcDNA3, 1(-)/porB group were (170.04±23.89) pg/mL, (114.68±14.27) pg/mL and 1. 68±0.19, respectively; and those in pcDNA3, 1(-)/ltB-porB group were (161.42±27.50) pg/mL, (124.16±19.04) pg/mL and 1.73±0.28, respectively; which were both higher than those in pcDNA3.1(-)/ phosphate buffered saliae (PBS) group (P＜0. 01; P＜0.05) and pcDNA3.1 (-)/ltB group (all P＜0.05), while there was no significant difference between pcDNA3.1 (-)/ltB-porB group and pcDNA3. 1 (-)/porB group (0. 998, 0. 696, 0. 994; all P＞0.05). Conclusions The constructed DNA vaccines are all successfully expressed in Hela cells and murine intranasal mucosal tissues. The mucosal immunization of the vaccines [pcDNA3. 1 (- )/porB and pcDNA3.1 ( -)/ltBporB] could induce humoral immune response and cellular immune response, especially mucosal immune response. It is confirmed that mucosal adjuvant LTB could promote PorB to induce higher level of mucosal immune response in mice.     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白gD的表达纯化及多克隆抗体的制备

目的表达及纯化单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)糖蛋白D(glycoprotein D,gD)并制备多克隆抗体。方法双酶切pcDNA 3.1-HSV1-gD和pFastBacTM I质粒,gD基因克隆到pFastBacTM I载体,连接产物转化E.coli DH10Bac感受态细胞并鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD。将构建正确的重组杆粒转染Sf9细胞包装杆状病毒。杆状病毒经传代扩增后,诱导重组gD蛋白的表达,使用Ni-NTA亲和层析及凝胶过滤层析纯化重组gD蛋白,进行15%SDS-PAGE电泳鉴定并采用肽指纹图谱分析纯化的gD蛋白。将纯化的gD蛋白进行热稳定性试验检测其在不同缓冲液条件下的稳定性。用重组gD蛋白免疫小鼠,利用ELISA法检测血清抗体滴度。结果成功构建重组质粒pFastBacTM I-gD,转化E.coli DH10Bac感受态细胞后,经蓝白斑筛选鉴定重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,鉴定正确的重组质粒感染Sf9细胞,包装出重组杆状病毒,获得滴度为8×108 pfu/ml的P3代杆状病毒。重组杆状病毒再次感染Sf9细胞能够表达高纯度可溶性的重组gD蛋白。不同缓冲液条件下重组gD蛋白稳定性良好。用gD蛋白免疫小鼠,获得ELISA效价为1×105的多克隆抗体。结论成功构建重组杆状病毒质粒Bacmid-gD,表达的HSV-1 gD蛋白稳定及免疫原性良好,制备的抗gD蛋白多克隆抗体滴度高,为HSV-1的亚单位疫苗的制备鉴定了基础。     

柯萨奇B2病毒VP1基因疫苗诱导细胞免疫的初步研究

目的构建柯萨奇B2病毒(CVB2)VP1侯选基因疫苗,评价其诱导细胞免疫的效果.方法采用逆转录PCR技术扩增CVB2的主要中和抗原 VP1基因,通过分子克隆构建pcDNA3-CVB2VP1基因免疫质粒并免疫BALB/c小鼠, 51Cr释放法测定CTL杀伤效应.结果基因免疫质粒表达载体为pcDNA3,亚克隆片段为CVB2VP1,pcDNA3-CVB2VP1接种组CTL特异性杀伤百分率均高于pcDNA3组(P＜0.01),E/T为50∶1时特异性CTL杀伤百分率最高,为(31.2±6.8)%(P＜0.05).结论 pcDNA3-CVB2VP1可诱导小鼠产生细胞免疫.     

PcDNA3.1(+)-MCP-1和PcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα.方法:据GeneBank中大鼠MCP-1和GroαcDNA序列设计并合成引物,提取急性胰腺炎模型大鼠总RNA,RT-PCR扩增,并将扩增产物TA克隆至pGEM-T easy载体,然后分别双酶切pGEM-MCP-1和pGEM-Groα回收目的片段再克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+).结果:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建完成后,用限制性内切酶、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定,证实其构建成功.结论:pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Groα真核表达质粒构建成功,为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备急性胰腺炎pcDNA3.1(+)-MCP-1和pcDNA3.1(+)-Gro DNA疫苗奠定了基础.     

磷酸铝佐剂对乙型肝炎DNA疫苗抗体应答的增强作用

目的 探讨磷酸铝佐剂对乙型肝炎DNA疫苗诱导体液免疫应答的增强作用。 方法 应用基因重组技术构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)真核表达质粒pcDNA 3.1-S,经酶切和测序鉴定无误后,作为乙型肝炎DNA疫苗,将不同浓度的磷酸铝悬液与之混合后免疫小鼠;用酶联免疫吸附法检测重组质粒在小鼠局部肌肉中HBsAg的表达和在血清中HBsAg的含量;并于免疫小鼠6周后检测小鼠血清抗-HBs水平。 结果 与单纯使用质粒pcDNA 3.1-S相比,将质粒pcDNA 3.1-S与磷酸铝悬液混合后免疫小鼠,重组质粒在小鼠局部肌肉中HBsAg表达差异无显著性;HBsAg在血清中的浓度均为阴性。将质粒pcDNA3.1-S与磷酸铝悬液混合后免疫小鼠,6周后检测小鼠血清抗-HBs,每1μl质粒中含1、10、50、100 μg磷酸铝组,小鼠血清抗-HBs抗体的P/N值分别为11.00±6.62、20.30±10.20、49.1 8±24.40和48.68±27.78,单纯使用质粒pcDNA3.1-S组P/N值为11.54±5.60。含1μg和10μg磷酸铝组,抗-HBs抗体P/N值与单纯用质粒pcDNA3.1-S组相比,差异无显著性;50μg和100μg磷酸铝组抗-HBs抗体P/N值高于单纯用质粒pcDNA3.1-S组,但50μg和100μg磷酸铝组二者差异无显著性。 结论 磷酸铝与质粒pcDNA3.1-S混合对pcDNA3.1-S在小鼠局部肌肉中HBsAg的表达无明显增强作用,但一定含量的磷酸铝能显     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.     

弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究

目的 研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法 根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中。大量制备pcDNA3. 1-P30和pcDNA3.1质粒DNA。将48只 BALB/c小鼠随机分成4组,每组1 2只,空质粒对照组(A组)第O、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂;P30 DNA疫苗免疫组(C组)第O、2、4周经小鼠股四头肌注射100 μg pcD- NA3. 1-P30质粒DNA;P30 DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第O、2周经小鼠股四头肌洼射100 μg pcDNA3. 1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50 μg rP30+福氏完全佐剂。末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间。结果 成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论 pcDNA3.1-P30 DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力。