现代分子生物学技术系列讲座之四反义核酸技术

现代分子生物学技术系列讲座之四──反义核酸技术杜卫东（生物化学与分子生物学研究中心）反义核酸技术是利用人工合成的特异性反义寡核苷酸定向抑制或封闭同的基因（ＤＮＡ或ＲＮＡ）表达的技术。它包括三方面的内容：（１）反义及ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ），...     

反义寡核苷酸设计策略与学习记忆研究

反义核酸是指与体内某ＲＮＡ或ＤＮＡ序列具有互补顺序,并能通过碱基配对与互补链杂交,从而影响其转录或翻译过程的ＲＮＡ或ＤＮＡ片段。反义ＲＮＡ和ＤＮＡ的特异性源自反义序列和靶序列之间的碱基配对。反义核酸的长度可长可短,长的反义核酸一般都借助表达载体导入细胞,通过在细胞中进行转录而实现功能。反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ,ＯＤＮ）是短序列的单链ＤＮＡ,在体外通过化学合成,与细胞内特异的靶序列互补。ＯＤＮ比通过表达载体导入的方式应用广泛,而且由于它可以作为反义…     

反义核酸类药物的药理学研究进展

反义核酸技术是 2 0世纪 80年代出现的一种以应用反义核酸类药物来抑制特定基因表达为目的的基因治疗技术。反义核酸类药物包括反义寡核苷酸和核酶。前者是人工设计合成的与特定基因互补的寡核苷酸 ,它能通过Ｗ Ｃ配对与特定基因结合来抑制其表达。核酶是具有ＲＮＡ裂解活性的ＲＮＡ。它能与与其互补的靶基因的ｍＲＮＡ进行反式结合并能对其进行定点切割。应用反义核酸类药物可以特异 ,高效的抑制某种基因的表达 ,有望成为较理想的基因治疗手段。然而反义核酸要想真正成为一种药物用于临床尚存在一些问题 ,如 :他们必须先找到靶细胞 ,然后通…     

反义技术在心血管病方面的应用

反义核酸是指与体内某些ＲＮＡ或ＤＮＡ序列具有互补顺序，并能通过碱基配对与互补链杂交，从而影响其转录或翻译过程的ＲＮＡ或ＤＮＡ片段，通过反义核酸特异性抑制某些基因的表达，可能抑制由于癌基因的表达引起的血管平滑肌细胞增殖，抑制某些心血管病的发生与发展。近年来该领域的研究结果显示：应用反义核酸技术抑制血管平滑肌细胞的增殖将可能成为治疗心血管疾病的新途径之一。     

反义RNA技术及其应用

反义ＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ）是一类能与特异ｍＲＮＡ互补的小分子量、可扩散的ＤＮＡ转录物,它能够从翻译水平、转录水平和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达。由于反义ＲＮＡ能够选择性地关闭特定基因,因而它已成为一种极有价值的研究工具,是被科学家们广泛用来同病毒性疾病、恶性肿瘤、寄生虫感染和遗传性疾病等作斗争的最引人注目的新武器,也是科学家们用来调节基因表达和观察基因表达的有效手段和方法。随着天然反义ＲＮＡ的发现,人工构建反义ＲＮＡ来调节基因表达的策略应运而生,并已经取得了较大进展。本文拟…     

反义策略研究造血基因调控及白血病基因治疗

绝大多数ＤＮＡ由两条碱基互补的单链组成，生物信息以不同核苷酸排列顺序的形式编码在ＤＮＡ链上。ＤＮＡ双链中被转录为ＲＮＡ的链称为正义链，与正义链互补的链为反义链。精心设计一段正义链，与正义链互补的链为反义链。精心设计一段与正义链互补的寡核苷酸，会象“封条”一样阻断基转录；将含有反义的载体导入细胞内，可以干扰特定基因的表达。反义核酸技术就是利用这一原理，在基因位点、前体ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ及蛋白水下上，     

RNase H在反义寡聚脱氧核苷酸抑制小鼠白血病病毒表达过程中的作用

用与Ｍｏｌｏｎｅｙ小鼠白血病病毒（Ｍｏ－ＭｕＬＶ）５＇端引物序列、ｅｎｖ－ＬＴＲ间序列及ｐｏｌ基因互补的三种反义脱氧寡核苷酸（１４ｍｅｒ，１８ｍｅｒ，３５ｍｅｒ）进行抗小鼠白血病病毒（ＳＲＳＶ）作用研究。发现它们在兔网织红细胞体外翻译系统中能抑制ＳＲＳＶｍＲＮＡ的转译，其中，３５ｍｅｒ作用最强，浓度为８μｍｏｌ／Ｌ时抑制率约４０％１４ｍｅｒ作用较弱，抑制率仅２３％；ＲＮａｓｅＨ能有效降解不对称ＰＣＲ反应合成的单链反义ＤＮＡ（１１９ｍｅｒ）与ＳＲＳＶＲＮＡ杂交体中的ＲＮＡ，加入ＲＮａｓｅＨ后，３５ｍｅｒ和１８ｍｅｒ对ＳＲＳＶｍＲＮＡ转译的抑制率分别由４２％提高到５９％和２７％提高到３３％，但１４ｍｅｒ抑制率无改变。提示反义寡核苷酸能有效地抑制ＳＲＳＶｍＲＮＡ的表达，这种作用呈序列特异性和剂量依赖性。它们可能是通过ＲＮａｓｅＨ对反义ＤＮＡ·ＳＲＳＶｍＲＮＡ杂交体中的ＲＮＡ降解所致。     

急性白血病c—myc反义核酸基因治疗的实验研究

ｃ－ｍｙｃ基因是调控细胞增殖与分化的癌基因,在急性白血病细胞株及急性白血病、恶性淋巴瘤患者细胞中出现高表达,是影响这些恶性肿瘤发生、发展的重要基因之一。反义核酸治疗恶性肿瘤在技术上具有高效、简便、不需载体等特点,原理是根据碱基互补,将具有特异序列的反义寡核苷酸导入肿瘤细胞与靶基因上的相应部位结合,抑制和阻断相应基因的转录表达。　目的　应用针对ｃ－ｍｙｃ基因的两个反义核酸１５ｍ ｅｒ和１８ｍ ｅｒ作用于急性白血病细胞株和原代细胞,研究反义核酸对白血病细胞的生长、增殖,ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 表达以及Ｐ６５ ｃ－ｍｙｃ蛋白表达率的改变,以及对细胞凋亡、分化方面的影响。　方法　采用锥虫蓝染色法测定细胞的拒染率,绘制细胞的生长曲线,用０．８％ 甲基纤维素半固体培养法进行克隆形成试验;用流式细胞仪检测在反义核酸作用前后的Ｐ６５ ｃ－ｍｙｃ 蛋白及凋亡率;用ＲＴ－ＰＣＲ 法检测ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 的表达相对水平;电镜观察凋亡细胞的超微结构;ＤＮＡ 电泳分析凋亡片段;光镜下瑞特染色、ＮＢＴ染色观察细胞分化水平,流式细胞仪检测分化抗原表达,同时ＲＴ－ＰＣＲ检测分化细胞的ｍ ＲＮＡ 表达;ＭＴＴ 法检测反义核酸与化疗药物对细胞联合作用后对     

反义核酸技术及其在心血管研究中的应用

反义核酸技术及其在心血管研究中的应用北京医科大学生物化学教研室邱京欣，周爱儒北京医科大学生物化学教研室反义（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）核酸是揩按照碱基互补配对原则，能够与互补链（靶基因或其表达的ｍＲＮＡ）特异结合，从而影响靶基因转录或翻译的ＲＮＡ或ＤＮＡ片...     

脂质体介导c—myc反义核酸对HL—60细胞作用的研究

原癌基因ｃ－ｍｙｃ参与调控细胞的增殖、分化和凋亡过程,在白血病细胞株ＨＬ－６０ 中有很高的表达。ｃ－ｍｙｃ通过扩增活化或基因重排而异常激活,在白血病的发生和发展中可能起着重要的作用。　目的　通过脂质体介导ｃ－ｍｙｃ反义核酸转染ＨＬ－６０ 细胞,观察其抑制细胞生长增殖、促进分化、诱导凋亡,降低ｃ－ｍｙｃｍ ＲＮＡ 和蛋白表达水平,探讨反义核酸的抗肿瘤作用机制。　方法　ＨＬ－６０ 细胞在３７℃、５％ＣＯ２ 条件下,培养于１０％ 小牛血清１６４０ 培养液中,细胞接种密度为４×１０７／Ｌ,反义核酸终浓度为１μｍ ｏｌ／Ｌ,反义核酸与脂质体比例为１ μｍ ｏｌ（６．５ μｇ）∶１０ μｇ,无血清转染６ ｈ。实验同时设置空白组、无义组、反义组、脂质体组、脂质体无义组等对照组。连续培养４ 天。通过锥虫蓝拒染实验测定细胞的生长能力;ＮＢＴ还原实验和瑞特－姬姆萨染色测定细胞的分化能力;免疫细胞化学染色检测ｃ－ｍｙｃ蛋白表达;ＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃ－ｍｙｃ ｍ ＲＮＡ 水平;吖啶橙／溴化乙锭染色观察凋亡细胞形态;流式细胞仪检测凋亡率;ＤＮＡ抽提及电泳观察凋亡细胞ＤＮＡ降解片段的形成。　结果　脂质体转染ｃ－ｍｙｃ反义核酸的作用：（１）抑制ＨＬ－６０     

hTERT基因反义核酸对8910卵巢癌细胞端粒酶活的影响

研究人类端粒酶催化亚单位基因的反义寡核苷酸对卵巢癌细胞的影响。方法采用ＴＲＡＰ－ＥＬＩＳＡ检测８９１０卵巢癌细胞在反义核酸处理前后端粒酶活性的变化。结果ｈＴＥＲＴ基义反义核酸能有核酸显抑制肿瘤细胞的端粒酶活性,为恶性肿瘤治疗提供了一条新的有效的途径。     

反义核苷酸抑制端粒酶活性与肿瘤的治疗

反义技术是根据碱基互补原则 ,用人工合成或生物体自身表达的特定序列的短片段核苷酸与靶基因或其ｍＲＮＡ配对结合 ,阻断靶基因表达的技术。自 1978年 ,Ｚａｍｅｃｎｉｃｋ等首次用反义技术抑制病毒基因表达获得成功后 ,其应用前景就日益广阔。现主要用于分子生物学基础研究 ,肿瘤、遗传病、病毒感染的基因治疗 ,动、植物品种的改良等。1　反义技术的基本作用机制[1]1 1　阻碍转录过程1 1 1　反义寡核苷酸渗入基因组特异区域 ,形成三股螺旋ＤＮＡ或环状ＤＮＡ。1 1 2　反义寡核苷酸对转录因子的圈套作用。1 2　阻碍翻译过程　反义寡核苷酸…     

原癌基因c－fos和c－jun在血管平滑肌细胞增殖调控中的作用

体外培养大鼠血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ），通过３Ｈ－ＴｄＲ参入实验和ＲＮＡ印迹分析，观察内皮素－１对ＶＳＭＣＤＮＡ合成、原癌基因ｃ－ｆｏｓ与ｃ－ｊｕｎ表达及ｃ－ｊｕｎ反义ＲＮＡ对ＶＳＭＣ增殖的影响。结果表明，内皮素－１作用于ＶＳＭＣ１２小时，３Ｈ－ＴｄＲ参入开始增加，２４小时达到峰值。在内皮素－１作用下，原癌基因ｃ－ｆｏｓ与ｃ－ｊｕｎ的表达活性在３０分钟达到高峰，３／小时后恢复到原来水平。将可合成ｃ－ｊｕｎ反义ＲＮＡ的表达载体导入ＶＳＭＣ，外源性ｃ－ｊｕｎ基因在ＶＳＭＣ中大量表达并显著抑制细胞增殖。本文提示，原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｊｕｎ在ＶＳＭＣ增殖调控中起着重要作用。     

ODC反义寡核苷酸对HL60细胞的生长抑制作用

目的：确定鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义寡核苷酸对ＨＬ６０细胞的抗增殖作用；探索该核苷酸是否有可能作为一种治疗癌症的潜化制剂。方法：采用自行设计人工合成的ＯＤＣ反义寡核苷酸，用ＭＴＴ法观察了其对ＨＬ６０细胞生长的影响，并以３Ｈ参入试验检测其ＲＮＡ及蛋白生物合成。结果：ＯＤＣ反义寡核苷酸可抑制ＨＬ６０细胞的增殖及ＲＮＡ、蛋白质的生物合成，并增强该细胞对抗肿瘤药物阿糖胞苷的敏感性。结论：应用反义技术控制ＯＤＣ表达将是抑制恶性细胞生长及增强肿瘤对化疗敏感性的１种可能途径。     

反义寡核苷酸治疗白血病的研究现状

反义核酸技术是近十年来肿瘤治疗研究的热点,它包括反义寡核苷酸(又称反义DNA,Antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)、反义RNA、核酶及RNA干扰等技术.其中反义寡核苷酸技术的主要作用原理是根据碱基互补配对原则,利用合成的寡核苷酸选择性地与靶基因mRNA互补结合,干扰或阻止其基因产物的形成,从而达到治疗肿瘤的目的.     

反义核酸技术与抗HBV基因治疗

抗病毒治疗为乙型肝炎治疗的难题。目前世界公认的有效且被证实的药物α干扰素,对于乙型肝炎病毒复制指标的阴转率为２０％～６０％［１,２］,疗效不满意,因而国内外学者近年来都将目光投注于基因治疗。基因治疗是将治疗性基因导入到发生病变的细胞内,以替代突变基因的功能或封闭异常基因表达的治疗方法。其策略包括：基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活。基因失活是利用反义核酸抗病毒的主要治疗方法。反义核酸是能与基因组有意义链（ｓｅｎｓｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）或有意义链的转录体互补结合的核苷酸序列。包括反义ＲＮＡ（ａ…     

Wilms肿瘤基因反义寡苷酸对白血病细胞凋亡的影响

目的 了解Ｗｉｌｍｓ肿瘤基因（ＷＴ１）反义寡核苷酸（ＡＳＯ）对白血病细胞凋亡的作用。方法 应用ＷＴ１ＡＳＯ以及足叶乙甙（ＶＰ－１６）作用Ｋ５６２、ＨＬ－６０细胞系,然后应用流式细胞仪测定ＤＮＡ含量以确定白血病细胞的凋亡数。结果 Ｋ５６２细胞系经ＷＴ１ ＡＳＯ作用２４ｈ和６０ｈ后细胞凋亡数分别为１４．６％和２６．８％;而ＷＴ１有义寡核苷酸（ＳＯ）组分别为３．１％（２４ｈ）和３．９％（６０ｈ）;加入少     

反义C—myc寡核苷酸对人肝癌细胞SMMC—7721的生长抑制

针对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ第二外显子起始妈ＡＵＧ及下游４个密码子设计合成了反义、正义及锚配寡核苷酸（ＯＤＮｓ）、并对合成的ＯＤＮｓ进行 硫代磷酸化修饰。在人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１培养体系中，对反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）抑制细胞增殖的作用进行了研究。发现（１）与正义和错配ＯＤＮｓ相比较，反义Ｃ－ｍｙｃＯＤＮ有明显抑制人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１生长的作用；（２）该生长抑制作用随ＡＳＯＤＮ剂量增加而增     

C-myc反义核酸对内皮素诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖抑制作用的研究

应用不同浓度的Ｃ－ｍｙｃ反义寡核苷酸处理体外培养的经１０－８ｍｏｌ／Ｌ内皮素－１（ＥＴ－１）诱导的人肺动脉平滑肌细胞,通过细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入值观察该反义核酸对细胞增殖及ＤＮＡ合成的抑制作用,应用斑点杂交法检测平滑肌细胞Ｃ－ｆｏｓ和Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ的表达水平。结果表明,１０、２０、５０μｇ／ｍｌ反义寡核苷酸对细胞计数和３Ｈ－ＴｄＲ掺入值与对照组相比抑制率分别为１１．９％和１２．３％（Ｐ＜０．０５）,２１．６％和１４．７％（Ｐ＜０．０１）,３６．３％和２７．２％（Ｐ＜０．０１）;对Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达抑制率分别为７１．３％（Ｐ＜０．０５）,８０．７％（Ｐ＜０．０５）,９２．５％（Ｐ＜０．０１）;５０μｇ／ｍｌ反义核酸对Ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ表达抑制率是７９．７％,１０、２０μｇ／ｍｌ组无抑制作用。Ｃ－ｍｙｃ反义核酸能显著抑制内皮素诱导的人肺动脉平滑肌细胞增殖,其作用系依赖反义核酸的序列特异性和剂量依赖。     

反义策略研究造血基因调控及白血病基因治疗

绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成,生物信息以不同核苷酸排列顺序的形式编码在DNA链上。DNA双链中被转录为RNA的链称为正义链,与正义链互补的链为反义链。精心设计一段与正义链互补的寡核苷酸,会象“封条”一样阻断基因转录;将含有反义序列的载体导入细胞内,可以干扰特定基因的表达。反义核酸技术就是利用这一原理,在基因位点、前体mRNA、mRNA及蛋白水平上,直接研究特定基因在细胞增殖、分化和凋亡中的调控作用。 反义核酸策略中,反义寡核苷酸、反义RNA和核酶技术已经被广泛应用于抗病毒和抗恶性肿瘤研究。在利用反义技术研究造血细胞的基因调控方面,特别是某些癌基因在白血病细胞内的过度表达、突变方面,已经取得了一些进展。目前,人工合成的寡核苷酸已能特异、高效地抑制白血病细胞的增殖和裸鼠体内肿瘤结节的形成,在对白血病患者的系统治疗方面也进行了尝试。利用基因工程技术构建含反义RNA或核酶特征序列的载体,能够抑制白血病异常基因的表达,并特异性地干扰易位融合基因。 利用反义核酸技术治疗白血病和肿瘤,目前仍有许多不同的见解,争论的焦点集中在三个方面:互补寡核苷酸的作用机制、可靠性及实际效果。一般认为,人工合成的寡核苷酸要应用于临床,尚需进一步提高稳定性和生物利用度。尽管如此