人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒的制备与评价

摘要 背景：对抗肿瘤药物靶向治疗和肿瘤细胞多药耐药产生的问题,载阿霉素海藻酸钠纳米粒经改性,偶联人转铁蛋白,生成的人转铁蛋白修饰载药纳米粒,可用于靶向肿瘤药物载体。 目的：制备人转铁蛋白修饰的载阿霉素海藻酸钠纳米粒并进行表征鉴定,检测其表面蛋白活性。 方法：采用优化的微乳化-离子交联方法制备包覆阿霉素的海藻酸钠复合纳米粒,以水溶性碳二亚胺为交联剂,将载阿霉素海藻酸钠纳米粒与人转铁蛋白连接,制备出人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒。透射电镜观察纳米粒的外观大小、形态;高效液相色谱法分析纳米粒的包封率和载药量;流式细胞仪检测其表面人转铁蛋白的活性。 结果与结论：人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒呈球形,平均粒径为170 nm。阿霉素的加入量可影响纳米粒的包封率,当阿霉素的加入量为纳米粒的10%时,包封率和包裹量均最佳。每毫克载药纳米粒可与约65 μg人转铁蛋白连接。人转铁蛋白修饰的载药纳米粒在流式细胞仪上除去非特异性吸附后还有67.3%荧光显示,说明人转铁蛋白修饰的载药纳米粒大部分都偶联上了人转铁蛋白抗体并能保持抗体活性,从而为载药纳米粒特异性靶向肿瘤细胞提供了足够的靶向动力。微乳化-离子交联方法制备方法简便可靠,制得的人转铁蛋白修饰载阿霉素海藻酸钠纳米粒有望成为具有潜在价值的一种特异性靶向药物载体。 关键词：海藻酸钠;阿霉素;人转铁蛋白;纳米粒;靶向;生物材料与纳米技术 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.014     

纳米纤维介导的紫杉醇/阿霉素序贯联合治疗SHg-44胶质瘤

摘要 背景：纳米纤维技术可同时担载多种药物，避开血脑屏障限制实现脑胶质瘤的序贯联合化疗。 目的：用乳液电纺法制备同时担载紫杉醇和阿霉素的聚乙二醇-聚乳酸共聚物纳米纤维并实现两种药物的序贯释放，探讨纳米纤维介导的紫杉醇和阿霉素序贯联合治疗SHg-44胶质瘤的效果及机制。 方法:实验分为4组，1640培养液对照组，1%阿霉素组，1%紫杉醇组，5%(阿霉素+紫杉醇)组。采用高效液相色谱法测定紫杉醇和阿霉素的体外释放情况。四甲基偶氮唑盐法检测纳米纤维介导的紫杉醇和阿霉素序贯治疗对SHg-44胶质瘤细胞的增殖抑制率；流式细胞仪检测法检测紫杉醇和阿霉素序贯治疗对SHg-44胶质瘤细胞的凋亡诱导作用。 结果与结论：纳米纤维介导的紫杉醇和阿霉素序贯治疗对SHg-44胶质瘤细胞具有明显的生长抑制及促凋亡作用,且作用效果好于单独药物应用。提示聚乙二醇-聚乳酸纳米纤维作为一种药物载体能提高紫杉醇和阿霉素对SHg-44胶质瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡作用。 关键词：胶质瘤；紫杉醇；阿霉素；序贯化疗；细胞凋亡 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.12.022     

石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长曲线及周期的影响*

背景：有报道指出石墨碳纳米颗粒具有强大的吸附能力,只要尽可能将其控制在有效浓度范围内,石墨碳纳米颗粒会具有很好的细胞相容性、增敏效应。 目的：观察石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞的生长增殖、细胞周期及凋亡的影响。 设计、时间及地点：细胞-材料学体外实验,于2007-01/2008-12在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：石墨碳纳米颗粒由中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心自制。人肝细胞(L02)、人肝细胞(Hl7702)、小鼠细胞(3T3)、人肝癌细胞(HepG2)购自湘雅医院中心实验室公司。 方法：取石墨碳纳米颗粒母液,稀释10倍后,采用激光粒度分析仪观察石墨碳纳米颗粒的大小及Zeta电位。取含胎牛血清的RPMI-1640培养基,设立11瓶,分别加入适量石墨碳纳米颗粒母液,使其含石墨碳纳米颗粒的浓度分别为100,75,50,25,20,15,12.5,10,7.5,5,0 mg/L。将L02细胞、Hl7702细胞、3T3细胞、HepG2细胞密度均调整为1× 109 L-1,接种后置37 ℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱中,取处于指数生长期的细胞用于各项指标测定。 主要观察指标：MTT比色法测定细胞数量,流式细胞仪检测细胞周期,计算细胞凋亡率。 结果：石墨碳纳米颗粒的粒径约20 nm,带有负电荷,其电位值为-14.8 mV。与未加石墨碳纳米颗粒的空白对照组比较,除人肝癌细胞(HepG2)外,不同浓度的石墨碳纳米颗粒对其余3株细胞增殖均有促进作用,且浓度为7.5 mg/L时促细胞增殖作用最强。在石墨碳纳米颗粒浓度为7.5 mg/L条件下,4株细胞的凋亡率均明显低于空白对照组。石墨碳纳米颗粒作用24 h的L02肝细胞周期发生改变,G0期细胞数减少,更多的细胞进入到S期和G2期。 结论：石墨碳纳米颗粒能进入体外培养细胞内,并对细胞生长、增殖产生促进作用,不诱导细胞凋亡,其作用强度与浓度有关。     

5000/新型多肽—PAMAM靶向药物载体载药性能及细胞吸收和毒性研究*****★

背景：前期研究通过噬菌体展示体内筛选方法获得了一条NCI-H460非小细胞肺癌特异结合的多肽，将该多肽与修饰的聚酰胺-胺（PAMAM）型树枝状高分子材料连接制备了纳米靶向药物载体（PAMAM-Ac-FITC-LCTP），该载体在体内外对非小细胞肺癌NCI-H460具有很好的靶向性[1]。 目的：以阿霉素为模型药物，研究PAMAM-Ac-FITC-LCTP对阿霉素的包埋、释放，肿瘤细胞对材料和药物复合物的吸收以及复合物的细胞毒性，对载体载药后的性能进行研究。 方法：物理包埋法将PAMAM-Ac-FITC-LCTP与阿霉素连接，通过体外透析实验研究载体对药物的缓释功能，共聚焦显微镜观察细胞对药物的吸收。以游离阿霉素作为对照，MTT法研究载体载药后对NCI-H460细胞的作用。 结果与结论：PAMAM-Ac-FITC-LCTP对阿霉素的最大包埋率为摩尔比1:3.5。载体对药物具有明显的缓释作用，离子浓度、pH和温度对药物的释放具有影响，说明PAMAM-Ac-FITC-LCTP主要是通过静电相互作用与阿霉素结合。PAMAM-Ac-FITC-LCTP/DOX短时间内比单独药物更高效的进入NCI-H460细胞，而复合物24 h 的细胞毒性与阿霉素的细胞毒性基本一致。以上结果表明PAMAM-Ac-FITC-LCTP可能是一个肿瘤治疗和诊断中很有用的药物靶向传输载体     

透明质酸偶联壳聚糖微球对非小细胞肺癌的靶向性作用★

背景：部分肿瘤细胞表面的CD44受体表达上调，如大肠癌、非小细胞肺癌，提示透明质酸与CD44受体在肿瘤的生长与扩散有着一定的关系。 目的：观察透明质酸偶联壳聚糖纳米微球对非小细胞肺癌的靶向性。 方法：采用离子交联法制备负载多西紫杉醇的透明质酸偶联壳聚糖微球(DTX-HACTNPs)，电镜观察其形态学特征，激光粒度分析仪测定粒径大小及分布。FITC标记微球，作用于CD44+人非小细胞肺癌细胞株(A549)，荧光显微镜观察。MTT法检测载药微球的体外细胞毒性。 结果与结论：DTX-HACTNPs形态规则，粒径分布较为均匀，平均粒径为(228.0±2.6) nm。DTX-HACTNPs对A549细胞的杀伤力高于非透明质酸偶联载药微球，但仍低于普通注射用DTX，3者的半数抑制浓度(IC50)分别为(15.06±0.94)，(25.73±3.37)，(5.35±0.61) mg/L(F=73.871，P=0.000)。提示HACTNPs通过受体途径主动靶向性结合于非小细胞肺癌细胞，可提高化疗药对肿瘤细胞的选择性杀伤力。     

改性载顺铂磁性纳米药物治疗鼻咽癌的体外实验*****★

背景：近年来载抗癌药物磁性纳米微粒作为一种新型靶向给药系统，利用其高载药量、靶向定位输送、以及磁粒的热效应、可生物降解等优点，为高效、低毒副作用的化疗带来了新的希望。 目的：观察顺铂耦合海藻酸钠改性磁性纳米球载体后对人鼻咽癌CNE2细胞的体外毒性效应。 设计、时间及地点：体外对比观察实验，于2005-03在中山大学北校区药理实验室完成。 材料：顺氯氨铂(CDDP)由山东齐鲁制药厂提供，海藻酸钠改性载顺铂四氧化三铁磁性纳米球(CDDP-SAMNP)，粒径大小43~52 nm，可逆释放的CDDP量(或利用率)约65%。鼻咽癌CNE2细胞株由中山大学肿瘤医院细胞病理实验室提供。 方法：实验分药物处理组及对照组，药物处理组分为CDDP组和CDDP-SAMNP组，CDDP和CDDP-SAMNP均用RPMI-1640培养液稀释，加药浓度按CDDP的含量计。对照组分别为RPMI-1640培养液组和单纯SAMNP组(加入四氧化三铁，磁核质量浓度为7 g/L，以培养液稀释)。 主要观察指标：采用MTT法分别观察1.89~11.34 mg/L的CDDP及相应剂量的CDDP-SAMNP对鼻咽癌CNE2细胞作用24, 48 h后的杀伤率；并通过透射电镜观察CNE2对CDDP-SAMNP的摄取。 结果：①单纯SAMNP对鼻咽癌CNE2细胞无杀伤作用，与培养液组相似(P > 0.05)。②随着CDDP和CDDP-SAMNP药物浓度的增加，药物对CNE2细胞的杀伤率呈明显的量效关系。同一药物相同浓度下，随着作用时间的延长，杀伤率提高，呈明显的时效关系。作用24 h，CDDP-SAMNP对鼻咽癌CNE2的杀伤率与CDDP相似(P > 0.05)。作用48 h，中低浓度(1.89~5.04 mg/L)时，CDDP-SAMNP的杀伤率低于CDDP(P < 0.05)，当达到6.93 mg/L时，杀伤率接近同浓度的CDDP。③CNE2细胞能够摄取CDDP-SAMNP和SAMNP。 结论：在高浓度下阴离子海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米球对鼻咽癌CNE2细胞的体外毒性与同浓度单纯顺铂相近，杀伤作用来源于载体释放的顺铂。改性后顺铂的稳定性提高，药效没有降低。     

叶酸-壳聚糖介导survivin shRNA基因纳米载体的制备***★

背景：叶酸-壳聚糖纳米粒是一种新型的高靶向纳米载体，可进一步提高药物的靶向性，并进一步实现缓释和控释给药。 目的：探讨叶酸-壳聚糖纳米粒作为survivin shRNA重组质粒载体传递系统的可行性以及对大肠癌细胞(SW480)的转染效率。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2008-06/2009-01在中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：壳聚糖(脱乙酰度>90%)由上海伯奥生物科技有限公司提供，叶酸由国药集团化学试剂有限公司提供，survivin shRNA重组质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。 方法：首先制备粒径均匀的叶酸偶联壳聚糖纳米粒，然后将20 mg/L survivin shRNA重组质粒和10 mg/L 叶酸-壳聚糖混合制备基因纳米复合物，同时以阳离子脂质体基因复合物作为对照，将上述两者转染大肠癌细胞。 主要观察指标：基因纳米复合物的理化性质及转染效率；Western blotting检测转染后肿瘤细胞中survivin蛋白的表达。 结果：成功制备叶酸-壳聚糖介导的survivin shRNA重组质粒基因纳米复合物。该基因纳米复合物转染大肠癌细胞的效果强于阳离子脂质体基因复合物。且转染后大肠癌细胞中survivin蛋白的表达显著低于阳离子脂质体基因复合物。 结论：叶酸-壳聚糖纳米粒作为载体系统能将survivin shRNA重组质粒高效递送到大肠癌细胞，从而诱导人大肠癌细胞的凋亡。     

包裹pcDNA3.1（-）/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒的制备以及特性研究

摘要 背景：壳聚糖是生物可降解性天然多糖，其生物相容性好，安全无毒，故而在基因成为基因传递方面展现巨大潜力。 目的：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，观察研究其相关特性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2009-02/2009-08在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：pcDNA3.1（-）/MAGE-3-HSP70由国家卫生部纳米生物技术重点实验室构建，壳聚糖 (批号060306，上海伯奥生物科技有限公司,脱乙酰度>90.0%,粘度<100cps) ，B16细胞由中南大学肿瘤研究所惠赠。 方法：采用复凝聚法制备包裹pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70壳聚糖纳米粒，将壳聚糖基因纳米粒转染B16细胞，利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测体外转染效果；应用噻唑蓝(MTT)评价壳聚糖基因纳米粒子的体外细胞毒性。 主要观察指标：激光粒度仪测定壳聚糖基因纳米粒径、Zeta电位；紫外分光光度计检测包封率；凝胶阻滞实验观察壳聚糖和质粒DNA的聚合；DNaseⅠ的保护试验分析壳聚糖基因纳米粒抗核酸酶降解能力。 结果：壳聚糖基因纳米粒的平均粒径约为223 nm,zeta电位为16mV; DNA包封率为92.3%，B16细胞转染实验显示其效率与Lipofectamine 2000相近, 而其毒性远低于Lipofectamine 2000。 结论：壳聚糖纳米粒子可高效装载质粒DNA转染B16细胞,而且对细胞基本无毒。     

高浓度谷氨酸诱导胶质瘤细胞凋亡及其机制

目的：研究高浓度谷氨酸对原代培养人脑胶质瘤细胞的凋亡诱导作用,进一步探讨其凋亡的可能机制。方法：对新鲜的人脑胶质瘤进行体外原代培养,不同浓度的谷氨酸作用不同时间,形态学观察;四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测肿瘤细胞生长抑制率;流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率;激光共聚焦显微镜检测细胞膜内游离钙离子的浓度变化。结果：原代培养胶质瘤细胞的生长抑制率随谷氨酸浓度的增加呈递增趋势。25、50和100mmol/L谷氨酸作用胶质瘤细胞48h的凋亡率分别为9.65%、31.13%和20.35%。脑胶质瘤原代培养细胞内钙离子浓度在谷氨酸作用后明显升高,与对照组相比有显著性差异（P〈0.01）;但不同浓度组、24h和48h组之间钙离子的浓度无显著性差异（P〉0.05）。结论：高浓度的谷氨酸可诱导原代培养人脑胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在一定范围内呈明显的剂量依赖性。钙离子在谷氨酸诱导的细胞凋亡中起重要作用。     

纳米羟基磷灰石颗粒诱导对大鼠巨噬细胞凋亡影响的初步研究

由于其尺寸效应,纳米颗粒（NPs）可以结合细胞内大分子,从而引起细胞坏死或凋亡。而目前针对纳米颗粒的生物安全性,缺乏对颗粒致细胞凋亡的机理研究。目的：从细胞及分子水平上探讨纳米颗粒致细胞凋亡的机理,为纳米颗粒的安全应用提供科学依据。设计、时间及地点：2007年1月至2008年12月,在上海生物材料研究测试中心完成以下相关实验。材料：原代培养大鼠巨噬细胞,并在300W/40KHZ的超声条件下制备纳米羟基磷灰石颗粒（HAP NPs）的悬浮液（30-80nm）。方法：为探讨纳米陶瓷颗粒对细胞的损伤作用及凋亡机制,本研究应用透射电镜（TEM）观察细胞凋亡的超微结构表征;AnnexinV-EGFP/PI双染检测凋亡结果;Western Blot方法检测凋亡调控相关基因P53的表达变化。主要观察指标：凋亡率及P53的蛋白表达水平。结果：TEM 观察单核巨噬细胞经HAP NPs作用后具有典型的凋亡形态学特征;并且细胞的凋亡与NPs的浓度呈正相关;Western Blot结果显示,100 µg/ml HAP NPs引起P53表达显著上调。 结论：本研究结果提示HAP NPs颗粒能够通过蛋白磷酸化上调P53蛋白,从而能够启动下游相关基因,最终导致细胞凋亡。同时也可以认为,P53是用来进行纳米陶瓷颗粒安全性评价较为理想的指标。     

负载紫杉醇壳聚糖纳米粒的制备、表征与释药性能

背景：紫杉醇是一种天然抗肿瘤药物,但其水溶性极低。壳聚糖经接枝改性，生成的共聚物可在液相中生成纳米粒，可用于药物的缓释和控释。 目的：对制备的负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒进行表征，分析其体外药物释放能力。 设计、时间及地点：重复测量设计，于2008-01/07在华北煤炭医学院医学系实验室完成。 材料：壳聚糖，平均相对分子质量为2.0×105，脱乙酰度为92%，为浙江省玉环海洋生物化学有限公司产品。紫杉醇，批号082329802，为中国药品生物制品检定所产品。 方法：采用引发接枝效率高、引发反应条件温和的二羟基二过碘酸合镍钾为引发剂，在壳聚糖上接枝醋酸乙烯酯，该聚合物在水溶液中直接生成具有疏水核心、亲水表面的纳米粒，即壳聚糖纳米粒，再利用超声振荡技术将0.5~5.0 mg紫杉醇与上述纳米粒混合制成负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒。 主要观察指标：激光粒度分析仪测定纳米颗粒的粒径大小、粒径分布及Zeta电位，透射电镜观察纳米颗粒的外观形态，高效液相色谱法分析负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒的包封率、载药量和释药性能。 结果：壳聚糖纳米粒和负载紫杉醇的壳聚糖纳米粒，其粒径分别为196.2 nm和320.8 nm，粒径分布较窄，纳米粒表面均带正电荷，Zeta电位比较差异无显著性意义（F=0.818，F=3.38，P均>0.05）。稳定的纳米粒呈球形，粒径均匀。紫杉醇的加入量可影响纳米粒的包封率，紫杉醇的加入量为纳米粒的量2%时，达到最大包封率93.6%。体外模拟释药结果表明药物释放曲线分为两个阶段，突释阶段微球释药量在24 h内达48.3%，缓释阶段微球释药持续时间长，在175 h时释药量达75.9%，载药纳米粒的药物释放速率持续稳定。 结论：接枝共聚法制备壳聚糖纳米粒简便可靠，负载紫杉醇后纳米粒径明显变大，表面带有正电荷，且纳米粒对紫杉醇有很高的包封率，体外释药具有明显的缓释作用。     

G422胶质瘤冷冻后细胞凋亡及相关基因表达的研究

目的：探讨冷冻杀伤肿瘤细胞的分子机制。方法；建立小鼠脑胶质瘤动物模型；用末端标记法（TUNEL）原位检测细胞凋亡，DNA琼脂糖电泳观察DNA梯形条带；用免疫组织化学ABC法检查bcl-2和bax表达。结果：不同冻融周期作用于G422胶质瘤后，在不同时间点、冷冻灶周边区的肿瘤细胞出现了形态学和DNA水平上的细胞凋亡变化，其峰值出现在冷冻后24-48h。重复冻融出现更多的凋亡细胞。不同冻融周期均引起冷冻灶周边区细胞bax上调，但对抑凋亡基因bcl-2表达无明显影响。结论：冷冻治疗可以诱导G422胶质瘤细胞凋亡，冷冻诱导的细胞凋亡由bax基因参与介导，而与bcl-2表达无关。诱导细胞凋亡可能 是冷冻杀伤肿瘤细胞的重要机制。     

热诱导凋亡胶质瘤细胞致敏树突状细胞疫苗的制备与鉴定

目的 制备热诱导凋亡胶质瘤细胞致敏树突状细胞疫苗,探讨其增强树突状细胞抗原递呈、诱导细胞毒性T淋巴细胞产生更强肿瘤细胞杀伤作用的机制.方法 采用改良Inaba法,在重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)作用下,体外诱导扩增小鼠骨髓来源的树突状细胞,电子显微镜和流式细胞术检测其生物学特征;分别以不同加热温度处理U251细胞,制备凋亡U251细胞致敏树突状细胞疫苗,3H-TdR掺入法和MTT法检测T淋巴细胞增殖能力和活化细胞毒性T淋巴细胞杀伤率.结果 在rmGM-CSF和rmIL-4作用下,小鼠骨髓来源细胞体外培养6～7 d即可诱导出树突状细胞,经倒置相差显微镜和电子显微镜证实细胞表面呈典型树突状结构;流式细胞术检测证实其表达特异性表面标记物CD11c,同时表达功能相关性抗原CD80、CD86和MHCⅡ.倒置相差显微镜和流式细胞术确定热诱导U251细胞凋亡的最佳条件为:44℃处理3 h再常规培养12 h,凋亡U251细胞可更好地负载树突状细胞,负载的树突状细胞可以激发T淋巴细胞增殖,诱导活化细胞毒性T淋巴细胞具有更强的杀伤肿瘤细胞的能力.结论 在rmGM-CSF和rmIL-4作用下,经体外成功制备的小鼠骨髓来源的树突状细胞,可热诱导凋亡胶质瘤细胞敏敏树突状细胞疫苗于体外有效激发T淋巴细胞增殖,诱导细胞毒性T淋巴细胞产生较强的杀伤肿瘤细胞能力.     

Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞凋亡的影响

目的探讨Survivin拮抗肽对人胶质瘤U251细胞体外增殖的抑制作用及细胞周期的影响。方法将U251细胞与不同浓度的Survivin拮抗肽进行体外培养,采用四甲基偶氮唑蓝法测定不同浓度的Survivin拮抗肽对U251细胞的生长抑制率;采用流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡。结果浓度为5、10、20ug／ml的Survivin拮抗肽均能抑制U251细胞的生长,且抑制率与Survivin拮抗肽浓度及作用时间成正比（P〈0．01）。20ug/ml Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,抑制率达63．33％。流式细胞仪结果显示,终浓度为5、10、20ug／ml Survivin拮抗肽亦能促进U251细胞凋亡,且随作用浓度增大及作用时间延长凋亡率明显上升（P〈0．01）;20ug／ml Survivin拈抗肽作用U251细胞72h,凋亡率为31．29％。不同浓度的Survivin拮抗肽作用U251细胞72h,随作用浓度增大,G2/M期细胞构成比明显上升（P〈0．01）。结论Survivin拮抗肽对U251细胞增殖具有抑制作用和促进凋亡,其抗胶质瘤细胞增殖作用机制可能为诱导肿瘤细胞凋亡,调控肿瘤细胞周期。     

石墨碳纳米颗粒对体外培养细胞生长特性的影响

背景：有报道指出石墨碳纳米颗粒具有强大的吸附能力,只要尽可能将其控制在有效浓度范围内,石墨碳纳米颗粒会具有很好的细胞相容性及增敏效应。 目的：了解石墨碳纳米颗粒的形态特征,观察石墨碳纳米颗粒其对体外培养细胞增殖与超微结构的影响。 方法：取石墨碳纳米颗粒0.5 g,加100 mL三蒸水,振荡后微孔过滤,即为石墨碳纳米颗粒母液。取处于对数生长期的HepG2细胞、L02细胞、Hl7702细胞、3T3细胞,调整密度为5×107 L-1接种于6孔板,0.5 mL/孔,加入含胎牛血清、青霉素、链霉素的RPMI-1640培养基1.5 mL,培养24 h后弃去旧液,设1~5号孔为实验组,分别加入质量浓度为25,10,7.5,5,0.25 mg/L石墨碳纳米颗粒培养液2.0 mL,设6号孔为空白对照组,不加石墨碳纳米颗粒溶液,继续培养24 h后终止培养。用原子力显微镜测量石墨碳纳米颗粒的粒径,电子显微镜观察石墨碳纳米颗粒的形态特征;用细胞计数板在光学显微镜下计数不同浓度石墨碳纳米颗粒对细胞数量的影响;透射电镜观察7.5 mg/L石墨碳纳米颗粒对细胞超微结构的影响。 结果与结论：石墨碳纳米颗粒呈球形微粒,粒径约20 nm。与空白对照组比较,各浓度石墨碳纳米颗粒培养液组除HepG2细胞外,其余3种细胞数量基本都有所增加,其中7.5 mg/L石墨碳纳米颗粒培养液对L02细胞、Hl7702细胞、3T3细胞、HepG2细胞数量的影响最为显著(P < 0.05)。对7.5 mg/L石墨碳纳米颗粒作用后的细胞进行透射电镜观察,可见石墨碳纳米颗粒分布于细胞内部,如细胞质、细胞核、线粒体中,未见亚细胞结构受损及细胞凋亡坏死现象发生。证实石墨碳纳米颗粒对体外培养的细胞无损伤不良反应,且能够促进细胞生长增殖,其作用强度与质量浓度有关,7.5 mg/L为较佳质量浓度。 关键词：纳米石墨碳;人肝细胞株;人肝癌细胞株;超微结构;细胞生长 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.03.015     

IFN-γ增强细胞毒类药物对神经母细胞瘤的诱导凋亡作用

目的探讨细胞毒类药物对神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y（SY5Y）细胞的作用及γ-干扰素（IFN-γ）对其抗瘤活性的影响。方法应用逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测IFN-γ作用前后半胱-天冬氨酸蛋白酶8（Caspase8）mRNA的表达;应用流式细胞仪检测细胞毒类药物[阿霉素、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）]及IFN-γ联合细胞毒类药物对SY5Y细胞的诱导凋亡作用;应用比色法测定Caspase8相对活性。结果SY5Y细胞不表达Caspase8,经IFN-γ作用后Caspase8mRNA表达明显增加。SY5Y细胞对阿霉素相对敏感,对TNF-α和TRAIL不敏感;经IFN-γ预处理后,表达Caspase8的SY5Y细胞对三种细胞毒类药物的诱导凋亡作用敏感并伴随Caspase8活性增高,此作用可被Caspase8抑制剂所阻断。结论IFN-γ通过上调Caspase8表达而增强细胞毒类药物对神经母细胞瘤细胞的诱导凋亡作用。     

脂膜微囊承载紫杉醇在体外对C6胶质瘤细胞杀伤作用的实验研究

目的在体外实验中研究脂膜微囊承载抗胶质瘤药物紫杉醇抑制C6胶质瘤细胞的作用，并探讨脂膜微囊靶向性抗瘤的机理。方法应用紫杉醇-脂膜微囊（Taxol-LCM）或单用脂膜微囊（LCM）处理C6细胞系，后用免疫荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察脂膜微囊在肿瘤细胞内的分布特点，用药前后肿瘤细胞形态的改变和细胞内超微结构的变化，以及动态的观察脂膜微囊进入细胞的全过程。结果紫杉醇（Taxol）可结合于脂膜微囊（LCM），可以被胶质瘤细胞内吞，起到很强的的杀伤肿瘤细胞的作用；其内吞过程为脂膜微囊先结合于细胞膜表面，后在细胞内重新分布，最终被细胞浆内的酸性成分所降解。结论脂膜微囊可以承载紫杉醇在体外起到杀伤胶质瘤细胞的作用，且脂膜微囊的代谢与细胞内的酸性成分有关。     

端粒酶反转录酶在长骨造釉细胞瘤中的表达

目的：端粒酶反转录酶作为端粒酶蛋白的主要组分，被称为端粒酶活性作用的限速因子，在细胞增生过程中起重要作用。观察长骨造釉细胞瘤中端粒酶反转录酶的表达及其反义寡核苷酸对其表达和细胞增生的抑制作用。 方法：实验于2006-02/2007-04在沈阳市第四人民医院完成。体外培养长骨造釉细胞瘤细胞，在24，48，72 h 后采用链酶亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法作端粒酶反转录酶免疫组织化学检测；将2.5，5.0 μmol/L 和10.0 μmol/L 不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸分别作用于体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞，无寡核苷酸混合液的DMEM液作空白对照，采用免疫组织化学方法检测端粒酶反转录酶的表达；四甲基偶氮唑盐比色法检测在不同浓度的端粒酶反转录酶反义寡核苷酸和正义寡核苷酸作用下,长骨造釉细胞瘤细胞生长活性及其生长抑制率。 结果：①体外培养的长骨造釉细胞瘤细胞可表达端粒酶反转录酶，在5.0，10.0 μmol/L 反义寡核苷酸作用下，端粒酶反转录酶的表达明显受抑制，与空白对照组比较，差异有显著性意义（P < 0.01）。②端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能明显抑制长骨造釉细胞瘤细胞增生活性，并呈剂量依赖性。　 结论：一定浓度端粒酶反转录酶反义寡核苷酸能序列特异性地抑制长骨造釉细胞瘤细胞端粒酶反转录酶表达和增生活性。     

三氧化二砷诱导9L胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究三氧化二砷（As2O3）对鼠胶质瘤生长的影响及其机制。方法应用不同浓度As2O3,分别处理9L胶质瘤细胞株不同时间,采用四甲基噻唑蓝比色（MTT）法观察As2O3对9L胶质瘤细胞生长的影响,以透射电镜、Hoechst 33342/PI双染荧光及流式细胞仪检测9L胶质瘤细胞凋亡。结果不同浓度的As2O3均可显著抑制9L胶质瘤细胞株的生长。As2O3作用可引起9L胶质瘤细胞的凋亡,且随As2O3浓度的增大和作用时间的延长,9L胶质瘤细胞的凋亡率明显上升。结论As2O3在体外可显著抑制9L胶质瘤细胞生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关,且其凋亡率随As2O3作用的时间延长和剂量的增加而增加。     

面包海星皂苷-1对恶性胶质瘤细胞系U87MG增殖抑制的体外研究

目的:初步探讨面包海星皂苷-1(asterosaponins 1)对体外恶性胶质细胞瘤细胞生长的影响及其作用机理。方法:我们使用MTT、细胞周期分析、Hoechst 33342细胞核染色荧光显微镜观察、透射电子显微镜观察等方法了解面包海星皂苷-1对U87MG细胞的作用。结果:实验结果显示,面包海星皂苷-1在很低的浓度(IC50=4.3μg/mL)就够引起人胶质母细胞瘤细胞系U87MG细胞的增殖抑制。当面包海星皂苷-1作用浓度为3.4μg/mL和4.3μg/mL时,U87MG细胞出现S期阻滞,而其浓度为10.0μg/mL时,U87MG细胞出现G0/G1期阻滞。同时,出现的亚二倍体峰(sub-G1)随浓度和时间而增加。Hoechst 33342细胞核染色荧光显微镜观察以及透射电子显微镜下细胞形态观察显示出典型的凋亡细胞形态学特征。结论:体外实验初步显示,面包海星皂苷-1可明显抑制U87MG细胞的增殖,并促其凋亡,具有显著的抗恶性胶质细胞瘤的药理作用。