多种细胞因子组合对脐血CD34+细胞的体外扩增

目的 探讨不同细胞因子组合在无血清、无基质条件下对脐血干／祖细胞的调控作用。方法 将SCF、Flk2／Flt3配体(FL)、TPO、IL-6及IL-6受体的可溶性形式(sIL-6R)进行不同组合扩增脐血CD34^ 细胞。结果 ①SCF FL ／-TPO组合能有效快速扩增脐血CD34^ 、CD34^ Thy-1^ 、CD34^ CD33^ 及长期培养启始细胞(LTC—IC)；②该组合同时加入IL-6及sIL-6R后，脐血干／祖细胞显著增殖；单独加入IL-6(不含sIL-6R)时，早期CD34^ 细胞和LTC—IC含量无明显增加，而且CFU-Mix、BFU—E的扩增不如CFU—GM明显；③通过细胞凋亡早期膜变化标记FITC—Annexin—V检测细胞凋亡率，加入Flt3L和／或IL-6 sIL-6R后Annexin-V阳性细胞由15．2％～19．1％降至2．8％～3．5％。结论 在SCF TPO Flt3L IL-6 sIL-6R组合的无基质、无血清悬浮体系中，脐血既能产生大量定向祖细胞，又能保持一定数量的早期造血细胞，这一体外培养体系具有重要的临床意义。     

脐血造血干／祖细胞体外扩增的实验研究

目的 探讨因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应。方法 采用Mini-MACS分离纯化出CD34^ 细胞,在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况。结果 培养4周后,FL＋TPO＋SCF＋IL－6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加（P＜0．05）,并且能维持一定比例的CD34^ 、Thy-1^ 细胞;SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34^ 细胞基本检测不到。结论 与经典因子组合SCF＋IL－3＋IL－6＋GM－CSF＋EPO相比,因子组合FL＋TPO＋SCF＋IL－6能在较长时间内有效扩增脐血造血干／祖细胞,是一个优化组合方案。     

不同细胞因子对脐血CD34+细胞扩增的影响

目的探讨不同细胞因子促进脐血CD34 细胞扩增的效应,为下一步的临床应用奠定基础。方法采用EasySep免疫磁珠阳性选择系统分离脐血中CD34 细胞,在无血清、无基质细胞培养体系中添加不同细胞因子培养2周,分组:A组,SCF FL TPOB组,SCF FL TPO IL-3C组,SCF FL TPO G-CSF。结果CD34 细胞数目于培养后7d达到峰值,3组间差异无显著性;B组扩增至14d时细胞总数达(384.40±17.48)倍,显著高于另外2组。扩增7d后的脐血细胞经体外培养可形成造血集落。结论体外扩增脐血CD34 细胞理想的细胞因子组合为SCF TPO FL,以7d为宜。     

条件培养液对脐血CD34^＋细胞扩增效应的实验研究

目的：探讨并分析不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法：利用4种条件培养液（胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞）对脐血CD34^ 细胞进行2周的体外扩增，并和三细胞因子组合：干细胞因子（stem cell factor,SCF)，血小板生成素（thrombopoietin,TPO),flt-3配基（flt-3 ligand,FL)，对脐血CD34^ 细胞扩增结果进行了比较；利用ELISA方法检测4种条件培养液中细胞因子[白细胞介素－1（interleukin-1,IL-1)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、FL、TPO]的浓度。结果：脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD34^ 细胞均有明显的扩增效应，脐血组优于细胞因子组合；4种条件培养液中，脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论：脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD34^ 细胞有效而廉价的扩增剂；细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD34^ 细胞体外扩增结果差异的主要因素。     

干细胞生长因子协同血小板生成素体外扩增脐血巨核前体细胞的研究

目的探讨在干细胞生长因子(SCF)和血小板生成素(TPO)组合作用下,人脐血CD34~ 细胞体外扩增为巨核前体细胞的效果。方法采用经免疫磁珠纯化系统收集的人脐血CD34~ 细胞与SCF TPO组合体外培养,研究该组合对巨核前体细胞的扩增效果。结果在SCF和TPO组合的作用下,脐血CD34~ 细胞(6例)显著地向巨核前体细胞(CD61 CD41~ 细胞)扩增。CD61~ CD41~ 细胞构成比在培养第7天达到峰值(15．57±4．95)％,第14天为(9．06±2．72)％;存第14天,CD61~-CD41~ 细胞总数和巨核系细胞集落形成单位(CFU- MK)达到高峰,为较理想的培养时间。经过体外扩增,总细胞数、CD34~ 细胞数、CD61~ CD41~ 细胞和CFU-MK均显著增加。结论在SCF和TPO组合的作用下,脐血CD34~ 细胞可有效地扩增为巨核前体细胞。     

脐血造血干/祖细胞体外扩增的实验研究

目的探讨因子组合FL+TPO+SCF+IL-6对脐血CD34 +细胞的体外扩增效应.方法采用Mini-MACS分离纯化出CD34+细胞, 在无基质接触的液体悬浮培养体系培养,通过间接免疫荧光染色、流式细胞仪技术、集落形成试验等动态测定细胞扩增情况.结果培养4周后,FL+TPO+SCF+IL-6组细胞总数、集落形成数均比扩增前显著增加(P＜0.05),并且能维持一定比例的CD34+、Th y-1+细胞;SCF+IL-3+IL-6+GM-CSF+EPO组在第2周时集落形成数已降低,第4周时集落形成数、CD34+细胞基本检测不到.结论与经典因子组合SCF+IL-3+IL-6+G M-CSF+EPO相比,因子组合FL+TPO +SCF+IL-6能在较长时间内有效扩增脐血造血干/祖细胞, 是一个优化组合方案.     

CD34+HPC来源的树突状细胞体外扩增和功能研究

目的研究脐血CD34^ HPC体外扩增诱导产生功能性树突状细胞(DCs)的有效方案。方法Ficoll分离脐血获得单个核细胞。免疫磁珠阳性分选CD34^ HPC,^sH^-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖的能力。MTT法检测特异性CTL的杀伤能力。结果SCF FL GM—CSF IL-4诱导生成的DCs激发T细胞增殖和特异性CTL的杀伤能力均高于其他组。结论SCF FL GM—CSF IL-4可有效扩增CD34^ HPC并诱导产生功能性DCs。     

多种细胞因子组合对脐血干/祖细胞体外扩增的影响

目的　探讨在体外培养液中不同细胞因子组合对脐血 CD34+ 细胞的扩增作用以及扩增后的 CD34+ 细胞的造血功能。方法　用 FL、SCF、TPO、IL - 3、TL - 6组合成不同的实验组 ,对脐血中分离纯化的 CD34+ 细胞经 6d的短期体外扩增 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,L TC- IC、祖细胞集落群计数 ,从而求得较好的细胞因子组合组。结果CD34+ 细胞扩增倍数为 3 .1～ 8.6倍 ,16份脐血 CD34+ 细胞数达到 10× 10 6 以上的细胞总数 ;扩增的 CD34+ 细胞再造血功能与原始 CD34+ 细胞无显著差异。FL是扩增组合中不可缺少的细胞因子 ,同时还证实 TPO与其他细胞因子组合有扩增 CD34+ 细胞的作用 ,但单独使用 TPO稍长时间会使 CD34+ 细胞过多向巨核细胞分化。结论　 FST3 6细胞因子组合能使部份单位体积的脐血 CD34+细胞体外扩增达一定数量 ,为干细胞移植于成人提供了一定的实验依据与方法     

体外扩增脐血与骨髓间充质干细胞共移植对NOD/SCID鼠造血重建的研究

目的 探讨体外扩增脐血与骨髓间充质干细胞（MSC）移植对NOD／SCID鼠早期造血重建的影响。方法 在无血清无基质培养基（SCF、FL、TPO、IL-3）中体外扩增7d,MSC培养传至第3代,移植物注射给亚致死量照射NOD／SCICD鼠,FCM分析移植后2周小鼠骨髓人CD45^＋细胞表达率。结果体外扩增脐血、MSC与未扩增脐血共移植后,小鼠骨髓CD45^＋细胞比率提高3．55倍,差异有显著性（P〈0．05）,部分小鼠血小板恢复照射前水平。结论 此3种移植物共移植可能促进NOD／SCICD小鼠早期造血重建和血小板恢复。     

骨髓间充质干细胞培养及向神经细胞诱导分化的实验研究

目的：体外培养骨髓间充质干细胞(BM—MSC)，诱导BM—MSC向神经细胞分化。方法：采用DMEM培养液加胎牛血清(DMEM／FBS)或无血清培养基体外培养人BM—MSC，测定细胞倍增时间；免疫组织化学法分析BM—MSC的表面标记；纤维母细胞集落形成(CFU—F)试验检测BM—MSC增殖能力；应用二甲基亚砜／羟丁苯甲酯(DMS0／BHA)化学因子诱导BM—MSC向神经细胞分化。结果：BM—MSC为单层贴壁生长，呈现规则的集束辐射状排列。在对数生长期，细胞倍增时间约为46h。CFU—F试验表明，体外培养的MSC的集落形成能力为正常骨髓单个核细胞(MNC)的15000倍以上。免疫组化分析表明，BM—MSC为CDl3和CDl05阳性，CD34阴性。DMS0／BHA化学因子能诱导BM—MSC分化为神经细胞，但是分化后即失去增殖能力，并于48h后逐渐死亡。结论：通过体外培养可以获得大量高度均一的BM—MSC。BM—MSC可向神经细胞诱导分化，但尚缺乏实际应用的可能性。     

条件培养液对脐血CD_(34)~+细胞扩增效应的实验研究

目的探讨并分析不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞的体外扩增效应及影响因素。方法利用 4种条件培养液 (胎儿肌肉、胎盘组织、外周血、脐血单个核细胞 )对脐血CD+ 34 细胞进行 2周的体外扩增 ,并和三细胞因子组合 :干细胞因子 (stemcellfactor ,SCF)、血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)、flt 3配基 (flt 3ligand ,FL) ,对脐血CD+ 3 4 细胞扩增结果进行了比较 ;利用ELISA方法检测 4种条件培养液中细胞因子 [白细胞介素 1(interleukin 1,IL 1)、白细胞介素 6 (interleukin 6 ,IL 6 )、FL、TPO]的浓度。结果脐血单个核细胞条件培养液及细胞因子组合对脐血CD+ 3 4 细胞均有明显的扩增效应 ,脐血组优于细胞因子组合 ;4种条件培养液中 ,脐血组细胞因子FL的含量明显高于其余条件培养液组。结论脐血条件培养液可作为体外培养扩增脐血CD+ 34 细胞有效而廉价的扩增剂 ;细胞因子FL可能是造成不同条件培养液对脐血CD+ 34 细胞体外扩增结果差异的主要因素     

细胞因子介导的体外扩增对脐血干/祖细胞粘附分子表达的影响

目的：比较脐血（CB）AC133^ 细胞扩增前后CD34^ 细胞亚群表面归巢相关粘附分子VLA－4（CD49d),VLA-5(CD49e),LFA-1(CD11a),L-selectin(CD62L)和PECAM－1（CD31）等的表达情况,以评价细胞因子介导的体外扩增对干／祖细胞（HSPC）归巢功能的影响。方法：将从新鲜CB标本中纯化的AC133^ 细胞接种于无血清基QBSF－60的无基质悬浮体系培养扩增14d,加入早期作用因子FL,SCF和TPO组合（FST）,并在接种0d时添加一剂IL－3,分别于培养0,7,10和14d检测扩增有和上述几种粘附分子的表达情况。结果：（1）在14d的培养扩增中,各阶段的HSPC均得到有效扩增,至14d时AC133^ 和CD34^ 细胞分别增加33．50和64．56倍;（2）表达上述粘附分子的各CD34^ 细胞亚群均有不同程度（约20－160倍）的扩增;（3）扩增后CD34^ 细胞表达的粘附分子CD11a,CD49e和CD49d的表达与原代CD34^ 细胞持平或上升,而CD62L和CD31的表达则有不同程度的下调。结论：我们建立的短期培养体系不仅可以支持CB HSPC的有效扩增,而且扩增后HSPC总体上保持原有的归巢相关粘附分子的表达。     

体外扩增造血细胞重建小鼠造血功能的实验研究

目的 探讨体外扩增造血祖儿定向诱导功能血红细胞生成的条件及扩增细胞重建长期造血能力的维持。方法 应用免疫磁珠法（ＭＡＣＳ）分离纯化脐带血ＣＤ３４＾＋造血干或祖细胞,在体外液体培养体系中经不同细胞因子的组合进行扩增和定向诱导,并将扩增细胞移植经亚致死剂量照射的ＳＣＩＤ小鼠。结果 ＦＬ、干细胞因子血小板生成素（ＴＰＯ）等细胞因子的不同组合可分别扩增细胞总数、粒系及巨核系造血祖细胞、ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

融合蛋白IL6/IL2在髓系-NK起始细胞(ML-IC)分析体系中对 NK细胞分化、增殖的影响

目的建立完善的造血干细胞体外培养及分析体系,用来研究比长期培养起始细胞(LTC-IC)更为原始的造血干祖细胞.在此基础上,研究更适合于NK细胞的分化、培养介质.方法构建并表达FPIL6/IL2,采用髓系-NK起始细胞体外培养、分析体系,通过观察培养后单细胞是否能同时向髓系及NK细胞分化,来判断此单细胞是否为髓系-NK起始细胞,即髓系-淋系起始细胞(myeloid-lvmphoid initiating cell,ML-IC).髓系检测指标是以祖细胞造血集落形成(CFC)法检测LTC-IC.NK细胞的检测指标是以FACS法检测CD56+NK细胞集落.通过观察培养后NK细胞集落数目的变化,研究FPIL6/IL2对NK-IC分化、增殖的影响.结果经过起始4周的培养后,实验组中(25.75±5.68)%的细胞能够在一个或更多的二级培养体系中产生功能性NK-IC细胞,而对照组为(6.81±1.97)%,经过6～7周的培养后,实验组共检测出102个NK-IC细胞,而对照组为33个,实验组较对照组明显扩增.结论髓系-NK起始细胞体外培养、分析体系能同时定量及定性研究造血干细胞的分化及增殖.FPIL6/IL2能明显促进ML-IC向NK祖细胞分化并在较长时间内维持其祖细胞的自我保留作用并能促进其进一步增殖.     

FL,TPO对人脐带血CD34+细胞体外增殖的影响

[目的]研究Flt-3配体（FL）及血小板生成素（TPO）在无血清培养体系中对人脐带血CD34＋细胞体外增殖的影响．[方法]采用无血清液体培养法，分别用FL，TPO，FL加TPO作用于体外短期培养脐带血CD34＋细胞，利用其计数及集落分析方法评价增殖效果．[结果]分别用FL，TPO，FL加TPO刺激增殖后，人脐带血细胞总数分别增加2．50，5．00，10．10倍，FL加TPO组细胞总数明显高于FL，TPO组；CD34＋细胞分别增殖0．90，1．26，1．61倍；集落总数分别增加2．07，2．27，7．37倍，造血祖细胞CFU-GM产率分别提高3．53，2．40，9．95倍，FL加TPO组产率高于其他组，BFU-E产率分别提高1．45，2．25．6．90倍．[结论]在短期无血清液体培养体系中，FL，TPO对人脐带血CD34＋细胞均具有增殖作用，且两者具有协同作用．     

Effect of Angiotensin Ⅱ on Cord Blood CD34+ Cells Expansion in vitro

In order to investigate the influence of angiotensin Ⅱ on hematopoietic system, CD34+cells in cord blood were purified, and the effects of angiotensin Ⅱ in combination with various cytokines on their growth and differentiation were studied by cell culture in vitro. It was found that angiotensin Ⅱ in suspending medium could stimulate both BFU-E and CFU-GM expansion. The number of BFU-E and CFU-GM was increased with the increases of angiotensin Ⅱ concentrations during a certain range. In addition, the expansion fold of CFU-GM was increased from 2.3±0.8 times to 7.8±2.3 times when angiotensin Ⅱ was added in the presence of SCF+G-CSF+GM-CSF+IL-3 cytokines mixture. Similarly, the expansion fold of BFU-E was increased from 3.1 ±1.8 times to 9.2±2.3 times with angiotensin Ⅱ in the presence of SCF+EPO+TPO+IL-3. In the semi-solid medium, angiotensin Ⅱ could stimulate CFU-GM expansion but had no effect on the growth of BFU-E. In conclusion, angiotensin Ⅱ had some stimulating effects on cord blood hematopoietic progenitors expansion in vitro in the presence of other cytokines.     

脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。     

In vitro proliferation, expansion, and differentiation of a CD34+ cell-enriched hematopoietic cell population from human umbilical cord blood in response to recombinant cytokines

BACKGROUND: The conditions and mechanisms that control the in vitro growth of hematopoietic stem/progenitor cells (contained within the population of CD34+ cells) are still not completely understood. METHODS: By using an immunomagnetic system, we have enriched for umbilical cord blood (UCB)-derived CD34+ cells (55% of total cells recovered vs. 0.8% of total cells prior to the enrichment procedure) and analyzed their in vitro growth (proliferation, expansion, and differentiation) in a liquid culture system in the absence or presence of different recombinant cytokine combinations. RESULTS: When the selected cells were cultured in the absence of recombinant cytokines, no proliferation or expansion was observed. In the presence of steel factor (SF) and interleukin-6 (IL-6), total cell number was increased nearly fourfold; however, no progenitor cell expansion took place. When cultures were supplemented with SF and IL-6 together with IL-3 and erythropoietin (EPO), a rapid proliferation of the CD34+ -enriched cell population was observed with a selective stimulation of erythropoiesis. However, this stimulation was only transient, suggesting that there was a rapid exhaustion of erythroid progenitor cells within the first 10 days. Significantly higher levels of proliferation and expansion of progenitor cells were observed in the presence of SF, IL-6, GM-CSF, and G-CSF with preferential stimulation of myelopoiesis. Interestingly, such stimulation of myelopoiesis was sustained for the entire culture period (>30 days). The highest levels of proliferation and expansion were observed in the presence of all six cytokines. Under these conditions, erythropoiesis was also sustained only transiently (10 days), whereas myelopoiesis was sustained for >30 days. CONCLUSIONS: This study indicates that significant proliferation and expansion of hematopoietic progenitors can be achieved in vitro when culturing a cell population in which CD34+ cells comprise only >50% of the total cells. Our results also suggest that myeloid progenitors (those responding to GM-CSF and G-CSF) possess higher expansion potentials in vitro than their erythroid counterparts. The methods described here for the enrichment and culture of CD34+ cells may be relevant in the development of protocols for the ex vivo proliferation and expansion of hematopoietic progenitors for transplantation.