线粒体在脓毒症淋巴细胞凋亡中的作用

目的 研究线粒体在脓毒症淋巴细胞凋亡中的作用机制.方法 用雌性、6～8周、C57BL/6小鼠建立盲肠结扎穿孔(CLP)的脓毒症动物模型.将实验动物随机分为两组:对照组、CLP组.分离脾淋巴细胞,采用Annexin V-FITC/PI标记,流式细胞仪检测脾淋巴细胞的凋亡变化;罗丹明123标记,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;分离脾淋巴细胞线粒体和胞质组分,Western blot法检测细胞色素C在线粒体、胞质中的含量变化.结果 CLP组脾淋巴细胞的凋亡率为(17.3±2.2)%,较对照组的(3.5±0.5)%明显增高(P＜0.05);CLP组线粒体膜电位无降低的细胞占(76.2±1.6)%,较对照组的(99.6±0.4)%明显减少(P＜0.05);CLP组脾淋巴细胞线粒体和胞质内的细胞色素C含量与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在脓毒症时,线粒体及其信号传导通路在淋巴细胞凋亡中发挥了重要作用.     

人脐带间充质干细胞获得和纯化及向软骨细胞分化能力的研究

目的 研究脐带间充质干细胞获得纯化的高效方法及向软骨细胞的分化能力.方法 取人的正常分娩或剖腹产胎儿的脐带,用胶原酶和胰酶初步消化后,将流式细胞仪筛选得到的CD45(-)、CD90(+)细胞作为原代细胞进行培养,并用复合胶原酶差速消化法逐级传代、纯化细胞,每次传代后取部分细胞用作流式细胞仪分析细胞的CD45、CD90阳性比率;对P3代细胞向软骨细胞进行诱导.结果 流式细胞仪检测提示,采用流式细胞仪进行初次筛选并用复合胶原酶差速消化法逐级传代获得的P1、P2、P3代细胞中CD90的阳性率为(80.86±7.85)%、(95.86±3.28)%、(97.15±1.43)%,而CD45的阳性率为(2.53±0.28)%、(0.97±0.48)%、(0.05±0.01)%;向软骨细胞诱导结果提示P3代细胞有向终末软骨细胞分化能力,具有干细胞的特性.结论 采用流式细胞仪进行初次筛选并用复合胶原酶差速消化法能快速获得高纯度的具有向终末软骨细胞分化能力的人脐带间充质干细胞.     

双向差速法制备高纯度雪旺细胞的实验研究

[目的]利用乳鼠的雪旺细胞与成纤维细胞贴壁及复合酶消化分离速度不同的特点,建立简单而快速提取和纯化雪旺细胞的方法。[方法]取3 d SD大鼠双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,剪碎后用0.2%复合胶原酶(Collagenase NB4)消化,细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶差速贴壁30 min,然后将细胞悬液移入一新的培养瓶培养48 h;用0.05%复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞,培养48 h后在相差显微镜下观察细胞形态;计数、纯度测定;免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度。[结果]经过2次纯化后,每25 cm2培养瓶可获取约(117.2±3.4)×104个细胞;第一轮纯化后雪旺细胞纯度达86.99%±1.53%,经2次纯化后纯度为98.32%±0.12%,两轮纯化之间有显著性差异,P<0.001;P75NTR免疫细胞化学鉴定细胞为阳性,流式细胞仪检测雪旺细胞纯度达97.9%。[结论]双向差速复合胶原酶消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法。     

间充质干细胞不抑制体内T淋巴细胞的增殖

目的 探讨不同种属来源的间充质干细胞(MSC)在体内是否具有相似的作用.方法 用尼绒毛法分离不含脾脏细胞灌注模型(C57/BL)源脾脏T淋巴细胞,CFSE膜荧光染料标志的胞进行细胞标记,按2×107/只与C57/BL来源的MSC(1×105～1×106/只)共输注给γ射线照射的雌性BALB/c(5Gy).不同时间段取受体的脾脏细胞,以单纯输注T淋巴细胞组为对照,流式细胞仪分析T淋巴细胞增殖状态.结果 与体外结果明显不同,MSC输注对外源淋巴细胞比例没有影响,共输注不能抑制T淋巴细胞的增殖.结论 异体MSC在组织工程构建和移植物抗宿主病治疗中的应用,提出了新的问题.     

表皮干细胞的快速高效分离

目的 寻找一种快递高效分离组织工程化皮肤种子细胞-皮肤干细胞的方法.方法 取成人手术切除之包皮,利用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶消化法,快速分离表皮干细胞,并对其进行鉴定及相关的生物学特性的研究.结果 应用Ⅰ型胶原酶结合胰蛋白酶,可在3小时内快速分离到表皮干细胞及成纤维细胞,经流式细胞仪及细胞免疫荧光鉴定,表皮细胞群体中角蛋白19(K19)阳性表达的细胞即表皮干细胞约占18%,但是其体外短期扩增仍较困难.结论 利用胶原酶消化法可在短期内高效分离到用于构建组织工程化皮肤的种子细胞,这为快速构建组织工程化皮肤提供了可能.     

脾切除对心脏移植大鼠外周血淋巴细胞凋亡及调节性T淋巴细胞的影响

目的 探讨脾切除对同种异体心脏移植大鼠外周血淋巴细胞凋亡及调节性T淋巴细胞的影响.方法 以Wistar大鼠为供者、SD大鼠为受者,进行腹部异位心脏移植,同时切除受者的脾脏(心脏移植切脾组),并以不切脾者为对照(心脏移植对照组),另设不行任何处理的对照组和单纯切脾的单纯切脾组.术后第1、3、5、7天.取各组受者的移植心脏和外周血,观察移植心脏的组织学变化和细胞超微结构改变情况,以流式细胞仪检测外周血淋巴细胞的凋亡率及CD4+ CD25+ T淋巴细胞的变化,逆转录聚合酶链反应检测CD4+ CD25+ T淋巴细胞上Foxp3 mRNA的表达情况,记录移植心脏的存活时间.结果 心脏移植对照组移植心脏存活时间为(7.47±2.24)d,心脏移植切脾组移植心脏存活时间为(17.63±4.54)d,二者间的差异有统计学意义(P<0.05).心脏移植对照组的移植心脏肿胀,质硬,色暗,间质水肿、出血,弥漫性炎症细胞浸润,大量心肌细胞坏死、溶解,横纹不清;心脏移植切脾组的移植心脏质软,色红,局部灰白,外膜下以及细胞间局灶性水肿,炎症细胞浸润,心肌细胞结构完整,横纹清晰;心脏移植切脾组的细胞超微结构改变轻于心脏移植对照组.心脏移植切脾组术后第5天和第7天的淋巴细胞凋亡率分别为(7.62±2.15)%和(9.41±3.82)%,明显高于心脏移植对照组(P<0.05,P<0.05).心脏移植切脾组术后第3、5、7天时的CD4+ CD25+ T淋巴细胞明显多于心脏移植对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01),其Foxp3 mRNA的表达也较心脏移植对照组明显上调.结论 脾切除使心脏移植大鼠外周血淋巴细胞凋亡率增加,调节性T淋巴细胞增多,其Foxp3 mRNA表达上调,这些变化与移植心脏病理改变呈负相关.     

一种同时分离肝细胞和储脂细胞的简易方法

目的　探讨同时分离肝细胞和储脂细胞的有效方法。方法　采用门静脉胶原酶灌注消化法同时分离大鼠肝细胞和储脂细胞 ,先用 3 0 0r/min(2 0℃ )低速离心 5min ,将细胞悬液分成上清和沉淀两部分并分别放入两个离心管中。A管为沉淀部分 (肝细胞悬液 )经 0 .0 2 %胶原酶孵育液孵育 10min(3 7℃ 5 %CO2 ) ,10 0目网过滤 ,离心后即为肝细胞。B管为上清部分主要是储脂细胞 ,经胶原酶恒温震荡消化 (2 0 0r/min ,3 7℃ ) ,2 0 0目网过滤 ,Nycodenz液进行梯度离心 (3 0 0 0r/min)后即得储脂细胞。结果　肝细胞存活率和细胞产率分别为 (93 .5± 3 .5 ) %和 (2 .4± 0 .2 )×10 8/大鼠 ,储脂细胞分别为 (94.5± 3 .5 ) %和 (2 .3± 0 .4)× 10 7/大鼠。肝细胞组织学及组织化学检测肝细胞形态正常 ,细胞培养功能表达正常。储脂细胞在激发波长为 3 2 8nm的荧光显微镜下发出蓝绿色荧光 ,细胞培养贴壁良好。结论　一步法同时分离肝细胞和储脂细胞是一种简单有效的方法。     

慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达

目的分析慢性乙型病毒性肝炎患者外周血T淋巴细胞亚群CD27和CD28的表达,初步探讨其分化表型。方法采集分离健康人和慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC),利用多种荧光标记抗体标记细胞表面分子,再用流式细胞仪检测CD8 和CD4 T淋巴细胞表面CD27和CD28分子的表达。结果31例慢性乙型病毒性肝炎患者CD8 CD27 CD28 T细胞占CD8 T细胞(41.13±24.89)%,低于28例健康对照组的(71.93±14.47)%(P<0.05)。而CD8 CD27-CD28-T细胞占CD8 T细胞(42.16±10.98)%,显著高于健康对照组的(9.16±5.24)%(P<0.01)。慢性乙型病毒性肝炎患者CD4 CD27 CD28 T细胞(80.89±7.93)%和健康对照组(83.17±8.31)%比较,差异无统计学意义。结论健康人外周血T淋巴细胞以CD27 CD28 早期分化表型为主。而慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中不同的亚群分化特征又有所不同,CD4 T淋巴细胞的分化表型仍然以CD27 CD28 早期分化表型为主,而CD8 T淋巴细胞中早期分化表型明显减少,晚期分化表型(CD27-CD28-)显著增加。     

浸润淋巴细胞凋亡诱导大鼠肝移植耐受

目的观察移植术后大鼠肝脏内不同细胞成分的凋亡现象,寻找耐受过程中的关键细胞成分,探讨大鼠肝移植耐受机制。方法分离肝脏间质细胞,流式细胞仪检测移植术后大鼠肝脏内不同细胞成分的凋亡现象。结果BN→LEW组大鼠移植肝脏在术后早期发生急性排斥反应,并且移植物内间质细胞存在大量的凋亡,急性排斥反应评分及细胞凋亡指数逐渐升高,术后7 d达到高峰随后下降,前者术后28 d与术前无明显差异(P>0.05);细胞凋亡指数至术后28 d较术前仍有明显差异,明显高于LEW→LEW组(P<0.05)。移植物内发生凋亡的细胞为来自于受体的浸润T淋巴细胞。结论移植物排斥反应评分下降与移植肝脏内CTL清除有关,来源于受体的浸润T淋巴细胞凋亡导致移植肝脏免疫耐受。     

复合胶原酶消化法制备高纯度小鼠雪旺细胞

目的建立高效、快速获得大量高纯度雪旺细胞的方法，为组织工程神经构建提供优质、足量的种子细胞。方法取新生6～7d的小鼠，在解剖显微镜下分离双侧坐骨神经，0．25％复合胶原酶37℃消化90min，然后将细胞悬液接种于预先用层粘蛋白铺盘的培养瓶，贴壁培养48h后，0．05％复合胶原酶37℃消化30min，振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞。经过两次纯化后，运用免疫细胞化学和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度。结果经过两次纯化后，P75^NTR免疫细胞化学及流式细胞仪检测证实，通过本方法可获得纯度为99％以上的雪旺细胞，每个25cm^2培养瓶可获得（102．8±5．9）×10^4个细胞。结论复合胶原酶差速消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法,仅需5d即可制备高纯度的雪旺细胞。     

牛磺酸减轻碘海醇诱导的人肾小管上皮细胞损伤

目的 探讨牛磺酸能否减轻碘海醇导致的HK-2细胞（人近端肾小管上皮细胞）损伤及作用机制。 方法 不同碘浓度（25、50、100、125 gI/L）的碘海醇作用HK-2细胞6 h;碘浓度为100 gI/L的碘海醇作用HK-2细胞不同时间（2 h、4 h、6 h）,观察细胞损伤程度。选用碘海醇（100 gI/L、6 h）作为刺激组,用不同浓度牛磺酸（3、12、24 mmol/L）共孵育进行干预。细胞增殖-毒性试剂盒（CCK-8）测定细胞活力。Hoechst33342染色、荧光显微镜下观察细胞凋亡形态。流式AnnexinⅤ-FITC-PI双染和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase-3）活性比色法观察细胞凋亡。Western印迹检测Bcl-2、Bax的表达。流式DCFH-DA细胞内标记法测定细胞内活性氧（ROS）。 结果 碘海醇呈碘浓度和时间依赖性诱导HK-2细胞活力下降、凋亡增加（P ＜ 0.05）。碘海醇（100 gI/L、6 h）导致HK-2细胞ROS升高（P ＜ 0.05）。牛磺酸呈浓度依赖性增加HK-2细胞活力,减轻凋亡。牛磺酸（3、12、24 mmol/L）干预组与碘海醇刺激组比较,细胞活力分别为（88.0±1.00）%、（91.33±0.58）%、（95.67±1.52）%比（76.67±1.53）%（均P ＜ 0.05）;细胞凋亡率分别为（8.84±1.75）%、（7.86±1.82）%、（6.30±1.50）%比（11.98±0.39）%（均P ＜ 0.05）;caspase-3的活性分别为（1.33±0.10）、（1.27±0.0）、（1.10±0.04）比（1.42±0.1）（均P ＜ 0.05）。牛磺酸上调HK-2细胞Bcl-2表达,降低了细胞内ROS的升高（均P ＜ 0.05）。 结论 碘海醇可致HK-2细胞凋亡增加。氧化应激参与了HK-2细胞损伤。牛磺酸通过减轻细胞内氧化应激、促进Bcl-2表达上调,减轻碘海醇诱导的HK-2细胞凋亡和损伤。     

原发性肝癌患者肿瘤浸润T淋巴细胞亚群分析

目的:了解原发性肝癌患者肿瘤浸润T淋巴细胞中CD4+及CD8+的表达特点。方法:收集30例原发性肝癌患者(均有乙型肝炎病毒感染背景)的癌组织(乙肝肝癌组)和癌旁组织(乙肝癌旁组)以及30例因良性病变而行肝切除的患者的新鲜肝组织(对照组),分离组织浸润淋巴细胞,用抗CD3、CD4和CD8单克隆抗体同时荧光染色,用流式细胞仪检测各表面标志的表达情况。结果:1)乙肝肝癌组、乙肝癌旁组及对照组CD3+CD4+T细胞占浸润淋巴细胞的比例分别为(22.31±3.68)%、(10.69±2.47)%及(4.21±4.26)%。乙肝肝癌组显著高于乙肝癌旁组及对照组,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.001),乙肝癌旁组高于对照组,差异亦有统计学意义(P=0.019)。2)乙肝肝癌组、乙肝癌旁组及对照组CD3+CD8+T细胞占浸润淋巴细胞的比例分别为(26.10±5.82)%、(21.82±2.70)%及(41.31±14.01)%,乙肝肝癌组及乙肝癌旁组显著低于对照组,差异有统计学意义(P=0.014,P=0.004),而乙肝肝癌组与乙肝癌旁组之间差异无统计学意义(P=0.651)。3)乙肝肝癌组组织浸润淋巴细胞中CD3+CD4+T细胞与CD3+CD8+T细胞的比值为0.91±0.30,显著高于乙肝癌旁组(0.47±0.11,P=0.003)及对照组(0.11±0.13,P=0.000),CD3+CD4+与CD3+CD8+T细胞的比值出现失衡。结论:原发性肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞中T细胞亚群失调,表现为CD3+CD4+T细胞所占比例升高,CD3+CD8+T细胞所占的比例下降,CD3+CD4+/CD3+CD8+明显升高。     

RNAi对大鼠T淋巴细胞CD28和OX40基因表达的联合抑制作用

目的 通过RNAi技术干扰T细胞CD28、CD134基因表达后,诱导获得抑制性T细胞(Ts);探讨Ts免疫学特性.方法 设计针对目标基因的siRNA,转染大鼠T淋巴细胞,FCM检测CD28、CD134水平,混合淋巴细胞反应(MLR)检测转染后的T淋巴细胞对异体淋巴细胞的增殖能力的影响,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞因子水平.结果 siRNA转染大鼠T淋巴细胞后,抑制CD28、CD134分子的表达,siRNA转染24 h后,siRNA组CD28、CD134表达受到抑制[转染后及转染前表达分别为(22.35±4.37)%及(34.76±3.51)%(P<0.05)],T淋巴细胞分泌细胞因子IL-10水平增高,转染组及未转染组表达分别为(77.15±12.60)ng/L及(37.56±5.93)ng/L(P<0.01).而转染组及未转染组的IL-2表达分别为(2.79±0.51)及(4.35±1.11)ng/L(P<0.05);干扰素(IFN)-γ表达分别为(277.15±14.8)、(682.7±53.5)ng/L(P<0.05).结论 siRNA可以特异性抑制大鼠T淋巴细胞共刺激分子CD28、CD134基因表达,抑制了IL-2、IFN-γ的表达,提高了IL-10细胞因子表达水平,从而产生了免疫耐受效应.Ts细胞具有抗原特异性,而且在外源性rrIL-2存在时,不能逆转Ts细胞的功能.     

T lymphocyte subsets and cytokine production by graft-infiltrating cells in FSGS recurrence post-transplantation.

BACKGROUND: Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) aetiology remains undefined although a derangement of lymphocytes and monocytes macrophages, at least, has been strongly suspected. We report the graft-infiltrating phenotypes and their cytokine production in a case of FSGS recurrence post-transplantation. METHODS: The kidney transplant recipient suffered immediate FSGS recurrence. Aspiration biopsies were done at the first and second week post-surgery and were analysed by flow cytometry. The cytokine analysis was done on aspiration sample culture supernatants and serum by enzyme-linked immunosorbent assay. RESULTS: High expression of CD3CD69, CD3CD71 and CD4CD29 was found on infiltrating lymphocytes. Biopsy cultures pointed to a Th0/Th1 pattern of cytokine production as well as significant synthesis of transforming growth factor-beta1. Interestingly, monocyte chemokines were absent. CONCLUSION: We report evidence of intragraft lymphocyte activation in the early days of FSGS recurrence. Aspiration biopsy cultures showed failure of cyclosporin A to inhibit interleukin-2 (IL-2) production by infiltrating lymphocytes. If our findings are confirmed in similar patients, a trial with anti-IL-2-receptor antibody could be warranted.     

Identification of hepatitis B virus-specific lymphocytes in human liver grafts from HBV-immune donors.

Both animal and human studies have demonstrated the adoptive transfer of immunity against hepatitis B virus (HBV) through liver transplantation that may be attributed to the presence of HBV-specific immunocompetent cells of donor origin in liver grafts. In this study, we characterized the resident lymphocytes in 41 human liver grafts by immunohistochemical staining and flow cytometry and directly identified the intragraft HBV-specific lymphocytes in relation to the donor's and subsequent recipient's immunity using enzyme-linked immunospot assay. A significant number of HBV-specific T and B cells were detectable in 59.4% (19/32) and 28.1% (9/32), respectively, of liver grafts from HBV-immune donors. The presence of various HBV-specific lymphocytes was closely associated with each other and with a higher serum titer of antibody against hepatitis B surface antigen (anti-HBs) in donors (P < 0.05). After liver transplantation, 17 of 35 (48.6%) patients with chronic HBV infection showed a spontaneous anti-HBs production, which was significantly associated with a higher number of donor-derived T lymphocytes specific for hepatitis B surface antigen (P = 0.043). In conclusion, the presence of considerable numbers of donor-derived HBV-specific immunocompetent cells in grafts may account for the adoptive transfer of HBV immunity through liver transplantation.     

HOE 077对胰岛细胞微囊外纤维化反应及其活力的影响

目的　研究抗肝纤维化药物HOE 0 77对胰岛微囊外纤维化反应及细胞活力的影响。方法　猪胰岛分离后包裹在海藻酸钡微囊内 ,移植于Balb/c小鼠肝内。术后HOE 0 77通过溶解于饮用水中给药 ,对照组饮水中不含HOE 0 77。 1个月后处死动物 ,病理检查观察包囊外的纤维化反应程度 ,评价囊内细胞的存活情况。结果　对照组显示了明显的纤维化反应 ,纤维包裹层厚度平均为(6 2 .12± 3.84) μm ,细胞活力为 (15 .16± 2 .32 ) % ;而HOE 0 77治疗组纤维包裹厚度为 (4 1.44±2 .45 ) μm ,活力为 (2 3 .0 8± 2 .45 ) %。统计学分析表明 ,两组在囊外纤维包裹层的厚度及细胞活力上差异均有显著性 (P <0 .0 0 0 1和P <0 .0 1)。结论　抗肝纤维化药物HOE 0 77的应用为减轻微包囊的纤维化反应提供了一个新的途径     

大黄素提高胰腺癌细胞化疗敏感性的机制研究

目的 探讨大黄素能否提高胰腺癌细胞化疗敏感性及其作用机制.方法 设立对照组(正常人皮肤成纤维细胞/胰腺癌BXPC-3细胞),顺铂组(5 mg/L),吉西他滨组(0.5 μmol/L),大黄素与顺铂联合组(50 μmol/L、5 mg/L),大黄素与吉西他滨联合组(50 μmol/L、0.5 μmol/L).应用MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,RT-PCR法检测不同细胞株中多药耐药相关蛋白1(MRP1)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和P-糖蛋白(P-gp)mRNA的表达.采用t检验比较两组差异.结果 顺铂组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为62.44%±3.42%和27.10%±4.24%,大黄素与顺铂联合组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为30.53%±0.05%和66.33%±9.37%,两组比较,差异有统计学意义(t=13.20,5.35,P<0.05).吉西他滨组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为79.82%±2.83%和13.48%±1.65%,大黄素与吉西他滨联合组胰腺癌BXPC-3细胞的存活率和凋亡率分别为45.65%±2.46%和62.74%±10.18%,两组比较,差异有统计学意义(t=12.89,8.28,P<0.05).顺铂组和大黄素与顺铂联合组正常人皮肤成纤维细胞存活率比较,差异无统计学意义(t=2.08,P>0.05).吉西他滨组和大黄素与吉西他滨联合组正常人皮肤成纤维细胞存活率比较,差异无统计学意义(t=0.64,P>0.05).在胰腺癌BXPC-3细胞中,只能检测到MRP1 mRNA的表达,未能检测到MRP2、BCRP、P-gp mRNA的表达.顺铂组胰腺癌BXPC-3细胞的MRP1 mRNA表达水平显著降低,而大黄素与顺铂联合组胰腺癌BXPC-3细胞的MRP1 mRNA表达水平则进一步下调.结论 大黄素能够提高胰腺癌细胞对顺铂的敏感性,其机制与下调的MRP1 mRNA表达有关.     

改良法分离睾丸支持细胞体外诱导异种淋巴细胞凋亡

目的改进睾丸支持细胞（Sertoli细胞）的分离方法及培养条件,探讨Sertoli细胞体外诱导异种淋巴细胞凋亡的作用机制。方法取2～4周龄的SD大鼠睾丸,采用Ⅴ型胶原酶、胰蛋白酶及脱氧核糖核酸酶二步消化法制备Sertoli细胞。用免疫组织化学法（SABC法）检测Sertoli细胞中Fas配体（FasL）、转化生长因子p,（TGF-β1）、clusterin的表达;流式细胞仪检测Sertoli细胞诱导异种淋巴细胞凋亡情况。结果在分离培养纯化过程中,Sertoli细胞占培养细胞总数的90％以上,生长状况良好,能稳定表达FasL、TGF-β1和clusterin,并且能够诱导异种淋巴细胞发生凋亡。结论应用本实验方法能够稳定获得大量高纯度的Sertoli细胞,并且能够发挥其免疫豁免的功能,从而用于细胞联合移植。     

骨髓间充质干细胞体外对1型糖尿病大鼠淋巴细胞的免疫调节作用

目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)体外对1型糖尿病(T1DM)大鼠淋巴细胞表型及增殖能力的影响,探讨其抑制淋巴细胞增殖的机制.方法 分离、培养和鉴定大鼠MSCs,噻唑蓝(MIT)比色法观察该细胞对淋巴细胞增殖能力的影响,应用流式细胞术分析MSCs对植物血凝素(PHA)作用下淋巴细胞凋亡,周期水平和CD4+CD25+调节性T细胞亚群(CD4+CD25+Tregs)比例的影响.结果 大鼠MSCs表型为CD29+、CD90+、CD106+、CD34-、CD45-,对PHA刺激的淋巴细胞增殖有抑制作用,以淋巴细胞:MSCs为1∶1时(C组)抑制作用最强;共培养体系中,大部分淋巴细胞处于G0/G1期;C组淋巴细胞凋亡水平(58.05±0.89)%显著高于对照组(43.35±0.86)%(P＜0.05);CD4+CD25+Tregs的比例C组(22.76±1.15)%显著高于对照组(5.80±0.68)%(P＜0.05).结论 MSCs体外可显著抑制PHA刺激的T1DM大鼠淋巴细胞的增殖,其机制与CD4+CD25+Tregs比例增高密切相关.

Abstract：

Objective To observe the effects of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) on the lymphocytes of rats with type 1 diabetes mellitus (T1DM) in vitro, and investigate the inhibitory effect of MSCs on lymphocytes proliferation and the underlying mechanism. Methods MSCs were isolated from SD rats, cultured in vitro, purified and then identified by testing the phenotypes with flow cytometry (FCM). The third-generation MSCs were planted in 24-well plates. After treated with mitomycin C, MSCs were co-cultured for 72 h with the T1 DM rat's lymphocytes activated by phytohemagglutinin (PHA). The proliferation of lymphocyte was measured by methyl thiazol tetrazolium (MTT) method. FCM analysis was done to investigate the apoptosis, cell cycle and the proportion of CD4+ CD25+ regulatory T cells of the T1 DM rat's lymphocytes after co-cultivation. Results The phenotypes of MSCs from normal SD rats were CD29 + , CD90 +, CD106 + , CD34-, CD45 -. MSCs obviously inhibited the lymphocyte proliferation stimco-culture system, most of the lymphocytes were arrested at G0/G1 phase. The apoptosis rate of lymphocytes (58.05 ± 0. 89)% in group C was increased significantly as compared with the control group (43.35± 0.86 ) % ( P ＜ 0. 05 ) as well as the proportion of CD4 + CD25 + regulatory T cells (22.76 ± 1.15 ) % vs (5.80 ± 0. 68) %. Conclusion In vitro, MSCs can obviously inhibit the T1 DM rat' s lymphocytes proliferation stimulated with PHA via increasing the proportion of CD4 + CD25 + regulatory T cells.     

Persistence of stable intragraft cell chimerism in rat liver allografts after drug-induced tolerance.

BACKGROUND: Drug-induced tolerance of rat liver allografts is well documented. We analyzed cellular events during immunosuppressive therapy on day (d) 10 and in the late phase (d 100) after transplantation to assess for characteristics in the intrahepatic leukocyte (IHL) population in the phase of tolerance. METHODS: Lewis rats served as recipients of Dark Agouti rat livers. Temporary immunosuppression with either cyclosporine (CsA) monotherapy (3 mg/kg/d) or triple therapy that consisted of a subtherapeutic CsA dosage (0.25 mg/kg/d) and monoclonal antibodies directed against the interleukin-2 receptor (IL-2R, CD25) and the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, CD54) was administered from postoperative d 0 to d 13. Cell migration and cell activation within liver grafts was assessed by standard histology and flow cytometry. IHL apoptosis was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling (TUNEL). RESULTS: Both CsA monotherapy and triple therapy prolonged liver allograft survival to more than 100 d and led to the induction of donor-specific tolerance. Untreated recipients rejected their allografts within 14 d. In both groups, donor-specific IHLs initially dropped to 18% to 25% on d 10, but they rebounded to as much as 40% on d 100 as a common characteristic of both groups. Within this population, donor-specific T cells were dominant. In both groups, increased numbers of activated (IL-2R+) CD8+ T lymphocytes were present on d 100. No accumulation of apoptotic IHL was observed on d 100. Their proportion was unchanged in the triple therapy group and slightly decreased in the CsA group compared to the syngeneic controls. CONCLUSIONS: The present study reveals that tolerant liver allografts are repopulated by donor-specific T lymphocytes. This phenomenon is independent of the type of applied immunosuppression. The persistence of activated CD8+ T cells in the phase of proven donor-specific tolerance on d 100 indicates that liver tolerance is associated with the state of a permanent intragraft immune activation. It seems that the coexistence of donor cells with infiltrating recipient cells within liver grafts, termed intrahepatic cell chimerism, is characteristic for tolerated liver allografts.