淋病奈瑟菌表面蛋白A真核表达载体的构建及表达

目的构建淋病奈瑟菌外膜蛋白———奈瑟菌表面蛋白A(neisseria surface protein A,NspA)的真核表达载体并使其在真核细胞中表达。方法用PCR方法扩增NspA基因,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1(+)/NspA。以脂质体法转染RAW264.7和COS-7细胞,用RT-PCR检测NspA mRNA的水平,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果扩增的目的基因包括了全段NspA基因,长度约525bp。以脂质体转染RAW264.7和COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫组化染色法检测表明,细胞可转录和表达NspA。结论成功构建了重组真核表达载体pcD-NA3.1(+)/NspA,并在真核细胞中得到表达,为研究此蛋白的免疫原性以及淋病基因疫苗的研制提供了物质基础。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的建立稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)16E7蛋白的HaCaT细胞株.方法利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HPV16E7.将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定.结果经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1(+)-HPV16E7成功.RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达.结论成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株.     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因腺病毒载体,并在真核细胞表达。方法用PCR法,扩增出HPV11E7基因,定向克隆至pENTR-TOPO载体形成重组质粒TOPO-E7。TOPO-E7与腺病毒载体pAD/CMV/V5-DESTTM重组反应,E7基因被重组到腺病毒载体上。该载体经PacI酶切,脂质体法转染人胚肾293A细胞,获得重组腺病毒载体pAD-E7。pAD-E7转染人HaCaT细胞,激光共聚焦显微镜分析E7蛋白表达情况。结果经酶切及序列分析鉴定,重组质粒TOPO-E7成功构建。重组子pAD-E7转染293A细胞后,获得滴度为1.4×107pfu/mL的重组腺病毒载体。该载体转染HaCaT细胞,48h后激光共聚焦显微镜下可见细胞内E7蛋白表达。结论重组腺病毒载体能有效介导HPV11E7基因在真核细胞的表达。     

稳定表达人乳头瘤病毒16E7蛋白HaCaT细胞株的建立

目的 建立稳定表达人乳头瘤病毒（HPV）16E7蛋白的HaCaT细胞株。方法 利用PCR及酶切技术扩增出CaSki细胞中HPV16E7基因并定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（+）-HPV16E7。将重组质粒转染入HaCaT细胞,经G418筛选稳定表达HPV16E7蛋白的细胞株并予以鉴定。结果 经酶切、测序鉴定构建pcDNA3.1（+）-HPV16E7成功。RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后检测到HPV16E7mRNA表达的特异性297 bp条带;Western印迹可检测到E7蛋白稳定表达。结论 成功构建出稳定表达HPV16E7蛋白的HaCaT细胞株。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E原核表达载体的表达及产物纯化

目的：构建水痘-带状疱疹病毒(VZV)糖蛋白E(gE)原核表达系统的纯化方法,并鉴定目的蛋白。方法：将VZVgE基因片段克隆到原核表达载体pGEX-1λT,构建重组原核融合蛋白表达载体pGEX-VZVgE;用IPTG(异丙基-硫代-B-D-半乳糖苷)诱导融合蛋白在大肠杆菌中表达;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。并用免疫印迹法检测纯化产物的抗原性。结果：经双酶切及测序鉴定所得到的重组质粒即为含有目的片段的重组载体pGEX-VZVgE;在IPTG诱导下pGEX-VZVgE表达分子质量为98ku的融合蛋白：纯化后的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到分子质量约为72ku的VZVgE,并用免疫印迹证明其具有良好的抗原性。结论：构建的VZVgE重组原核表达载体能表达重组蛋白,并建立了一套纯化VZVgE的方法;从而为VZVgE的应用研究打下基础。     

pcDNA.3.1/myc-His(-)A-HINT1真核表达载体的构建及其在人黑素瘤细胞A375中的表达

目的:构建真核表达载体pcDNA.3.1/myc-His(-)A-HINT1并检测其在人黑素瘤细胞A375中的表达.方法:采用巢式RT-PCR的方法扩增带有Xba I和Kpn I酶切位点的人HINT1编码区基因,经TA克隆技术,将基因测序正确的序列克隆到空白真核表达载体pcDNA.3.1/myc-His(-)A,构建真核表达载体pcDNA.3.1/myc-His(-)A-HINT1.经菌落PCR、双酶切及基因测序鉴定后,用脂质体转染法转染A375细胞,通过G418筛选,获得稳定转染的A375单克隆细胞.用免疫细胞化学法及Western blot(WB)法检测HINT1蛋白在细胞中的表达.结果:pcDNA.3.1/myc-His(-)A-HINT1真核表达载体构建成功,通过脂质体转染,G418筛选,获得稳定转染的A375单克隆细胞,免疫细胞化学及WB检测均显示稳定转染真核表达载体pcDNA.3.1/myc-His(-)A-HINT1的A375单克隆细胞有更高的HINT1蛋白的表达.结论:成功构建了pcDNA.3.1/myc-His(-)A-HINT1真核表达载体,并获得稳定转染且能高表达HINT1的单克隆A375细胞.     

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

目的：克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因，构建pEGFP／MOMP真核表达重组质粒，为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据．方法：用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段，克隆人真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中，阳性重组子经BanH I、Kpn I双酶切、PCR扩增及测序鉴定；并经脂质体介导转染HeLa细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果：PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMP基因片段；序列测定证实与GenBank卺录的D型沙眼衣原体一致；筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP／MOMP。结论：成功地构建了pEGFP／MOMP真核表达重组体，并在HeLa细胞中表达了MOMP。     

表达人乳头瘤病毒6b和11型E6/E7基因的小鼠肿瘤细胞株的建立

目的 构建含有人乳头瘤病毒(HPV)6b和11型E6/E7基因的表达质粒和建立这些基因的转染细胞株。方法 分别将HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7克隆于含绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3.1,经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性克隆,荧光显微镜观察,RT-PCR鉴定mRNA转录。结果 通过酶切鉴定和基因测序证实,构建质粒中目的基因片段序列完全正确。转染后荧光显微镜下可观测到B16细胞发出绿色荧光。以G418筛选的抗性细胞克隆提取RNA并经RT-PCR扩增出与目的基因大小一致的基因片段。结论 建立的小鼠肿瘤细胞B16表达HPV6bE6、HPV6bE7、HPV11E6和HPV11E7基因。提示转染的细胞株可移植于小鼠,利于体内研究这些基因的生物学作用和免疫学机制。     

抗白念珠菌人鼠嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的构建抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达。方法从含有单克隆天然抗白念珠菌抗体3B4可变区基因的载体pMDT-V2H和pUC-VL中PCR克隆单抗3B4的可变区VH和VL基因,依次插入含有人免疫球蛋白κ轻链恒定区基因和γ1重链恒定区基因的真核表达载体pMH-CA。经DNA序列测定正确后,电穿孔转染J558L细胞进行嵌合抗体表达,RT-PCR,ELISA方法对抗体表达进行鉴定。结果成功构建了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体,转染真核细胞后RT-PCR显示人鼠嵌合抗体重链和轻链mRNA的转录,ELISA证实了抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的表达以及对白念珠菌的识别。结论成功构建抗白念珠菌人鼠嵌合抗体的真核表达载体,并表达出具有结合活性的基因工程抗体。     

GST-HPV58 E6融合蛋白的表达与纯化

目的体外克隆并表达HPV58 E6,为研究HPV58 E6的致癌机理及制备预防性疫苗奠定基础。方法利用PCR反应及基因重组技术,从HPV58全基因组中扩增出HPV58 E6基因片段,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体,IPTG诱导表达。结果基因测序分析、酶切电泳证实重组质粒pGEX-4T-3/HPV58 E6序列正确,并可在大肠杆菌中高效表达,进一步经G lutath ione Sepharose 4B获得纯化的GST-HPV58E6融合蛋白。结论成功构建了人pGEX-4T-3/HPV58 E6原核表达载体,表达并纯化了GST-HPV58 E6蛋白,为其致癌作用的研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

TRP-1编码基因反义核酸对黑素细胞增殖及功能的影响

目的 构建酪氨酸相关蛋白-1(TRP-1)反义真核表达载体并转染TRP-1高表达的黑素细胞及恶性黑素瘤细胞,进一步研究其对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞增殖及功能的影响。方法 将TRP-1基因反向亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转染黑素细胞及恶性黑素瘤细胞。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TRP-1mRNA水平的变化,免疫印迹法检测TRP-1蛋白水平的改变。通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用L-多巴测定酪氨酸酶活性的改变。结果 成功构建重组反义表达载体pcDNA3.1/TRP-1(-),转染细胞稳定表达TRP-1反义核酸。RT-PCR提示TRP-1mRNA水平显著下降,免疫印迹提示其TRP-1蛋白表达水平降低。流式细胞检测表明反义TRP-1转染细胞发生细胞周期G1期阻滞。转染组黑素细胞及黑素瘤细胞酪氨酸酶活性抑制率分别达46%和54%。结论 TRP-1在黑素细胞及黑素瘤细胞的增殖及功能方面发挥重要作用,TRP-1反义核酸转染细胞细胞周期受到阻滞,酪氨酸酶活性明显降低。     

含人类乳头瘤病毒16E7-L1的嵌合型病毒样颗粒的构建、表达和纯化鉴定

目的 研究人类乳头瘤病毒(HPV)16型的早期基因E7,构建、表达并纯化鉴定了HPV16E7与BPVL1重组的嵌合型病毒样颗粒VLPs.方法HPV16E7基因分3段经PCR扩增后分别克隆入连有BPVL1的质粒PUC形成BPVL1HPV16E7;以质粒PVL1393为载体将BPVL1HPV16E7基因转染杆状病毒并在昆虫细胞中进行表达;用超声粉碎和蔗糖超离、氯化铯梯度离心等方法纯化以及免疫印迹、ECL、透射电镜等方法鉴定表达产物.结果 和结论成功地获得表达BPVL1HPV16E7重组体,形态和结构与野生型HPV几乎一致的嵌合型病毒样颗粒VLPs.将为进一步的HPV16E7的疫苗研究等奠定基础.     

TOPO定向克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段

目的 通过基因工程技术,克隆和表达Ⅱ型单纯疱疹病毒gG基因的免疫优势表位片段。方法 以PCR法扩增HSV-2的gG基因的免疫优势表位片段;将PCR产物与TOPO定向表达载体连接;然后鉴定含有目的基因的重组表达载体;并转化BL21Star^TM菌株诱导表达目的蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的蛋白。结果 PCR法扩增出616bp的DNA片段;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有616bp的DNA片段,其中99.5%序列与目的基因序列一致。SDS-PAGE结果显示重组蛋白在3h时的表达产量最高。免疫印迹法通过抗gG的单克隆抗体,证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达。结论 Ⅱ型单纯疱疹病毒的gG免疫优势表位基因片段的成功表达,为制备国产的HSV-2血清诊断试剂提供资料。     

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段．测序后插入HSP70基因的5’端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX—E7-HSP70：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果：成功地构建了pGEX—E7-HSP70原核表达质粒：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论：成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达

目的　克隆人乳头瘤病毒 6b型E7(humanpapillomavirus 6bE7)基因 ,构建原核表达载体 ,并进行蛋白表达和纯化。方法　将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆 ,与GST原核表达载体pGEX 4T 2重组 ,转化E .coliP2 3 92 菌表达蛋白 ,经GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化GST HPV 6bE7融合蛋白。结果　限制性酶切和DNA测序表明 ,HPV 6bE7DNA正确克隆于 pGEX 4T 2多克隆位点。经IPTG诱导表达的GST HPV 6bE7融合蛋白主要存在于可溶性上清。经亲和层析 ,每升诱导菌回收 8.4mg融合蛋白 ,10 %SDS PAGE分析融合蛋白表观分子量约 3 7kDa。结论　成功构建了HPV 6bE7基因原核表达载体 ,并大量表达和纯化了GST HPV 6bE7融合蛋白