小鼠单链白细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的:构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗(Bacille calmette-guerin.BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法:以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果:电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带.结论:成功构建含pBM12的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

小鼠单链自细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的：构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗（Bacille calmette—guerin,BCG）,并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。方法：以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT—PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果：电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带。以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96h后用RT—PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带。结论：成功构建含pBM12的重组BCG。该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

减毒鼠伤寒沙门菌作基因递呈载体的体外试验

目的　体外情况下验证鼠伤寒沙门菌作为基因递呈载体 ,将基因转染入真核细胞的能力 .方法　构建增强绿色荧光蛋白 (EGFP)真核表达载体 pc DNA3.1(+) / EGFP,将重组 pc DNA3.1(+) / EGFP质粒和 pc DNA3.1(+)空载体用电穿孔法分别转入减毒鼠伤寒沙门菌 .分别用 2种重组细菌体外情况下感染小鼠腹腔灌洗巨噬细胞 ,培养 4 8h后 ,流式细胞仪检测两组小鼠巨噬细胞荧光强度 ,验证鼠伤寒沙门菌作为基因递呈载体的能力 .结果　成功构建了 pc DNA3.1(+) /EGFP重组鼠伤寒沙门菌 ;感染细胞培养 4 8h后 ,流式细胞仪检测表明 pc DNA3.1(+) / EGFP重组减毒鼠伤寒沙门菌感染的小鼠巨噬细胞荧光细胞百分比为 4 0 .6 % ,荧光强度为0 .92 7,均明显高于对照组 (分别为 3.8% ,0 .345 ,P<0 .0 1) .结论　减毒鼠伤寒沙门菌是一种有效的基因递呈工具 ,可将外源基因转入真核细胞并在其中表达 ,为进一步应用其研制口服 DNA疫苗奠定了基础 .     

赖型钩端螺旋体OmpA外膜基因Loa22重组卡介苗的构建及其免疫蛋白表达

目的 以赖型钩端螺旋体外膜蛋白A(OmpA)膜蛋白基因Loa22去信号肽基因片段构建重组卡介苗并对其免疫蛋白进行表达分析.方法 以赖型钩端螺旋体56601株全基因组DNA为模板,PCR扩增出Loa22成熟肽基因片段,与大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭整合质粒pMV361一起分别经过双酶切,连接,转化.筛选鉴定出阳性重组质粒rpMV361-loa22,电转化入BCG,经筛选鉴定后,热诱导表达,通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定其表达产物.分别用BCG、rBCG-pMV361、rBCG-loa22、Loa22蛋白、灭活全钩体免疫小鼠两次后,脱臼处死小鼠分离脾淋巴细胞,XTT比色法检测体外脾淋巴细胞增殖活性.结果 PCR扩增获得516 bp的片段,成功构建重组穿梭质粒rpMV361-loa22,经电转化构建重组卡介苗成功,热诱导表达出相对分子质量约19×10~3特异条带.体外脾淋巴细胞增殖实验证实rBCG-loa22可引起细胞反应,其增殖活性与BCG组和rBCG-pMV361组相比差异具有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了赖型钩端螺旋体重组卡介苗rBCG-loa22并高效表达具有免疫学活性的外膜蛋白Loa22,为新一代钩端螺旋体疫苗研究打下了基础.     

小鼠B7-H4重组腺病毒的构建及鉴定

目的:利用AdEasyTM XL system构建携带小鼠B 7-H4基因的重组腺病毒,并鉴定其生物学活性.方法:以RT-PCR方法从C5 7小鼠肺组织中扩增B7-H4全长基因并克隆到T载体,然后测序鉴定.经Xhol Ⅰ和EcoR Ⅴ双 酶切后接入pshuttle-CMV穿梭载体(简称PSC),构建重组腺病毒的穿梭质粒PSC-mB7-H4 ,并电转化至BJ5183-AD-1感受态细菌,经筛选获得携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒pmB7 -H4/Ad.将此质粒转化人胚肾细胞(AD-293)产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4/Ad .以RT-PCR及Western blot方法检测被mB7-H4/Ad感染的AD-293细胞中B7-H4 mRNA和蛋 白的表达,并观察重组腺病毒感染的小鼠成纤维细胞(L929)对T细胞增殖和细胞因子表达的影响. 结果:获得序列准确的mB7-H4基因并成功构建重组腺病毒表达质 粒,转化AD-293细胞获得重组腺病毒;细胞生物学实验证实,该重组腺病毒具有抑制CD3单抗诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌. 结论:成功构建具有免疫抑制功能的mB7-H4重组腺病毒.     

sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定.方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和Western blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定.结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性.结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础.     

IL-35重组卡介苗的构建及鉴定

目的构建分泌性表达白细胞介素（IL）-35真核载体pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）-重组卡介苗（BCG）。方法在化学合成的IL-35基因片段中插入pBudCE4.1/GLS/OriM,将合成后序列插入到IL-12真核共表达载体pBudCE4.1/GLS/IL12/OriM的质粒酶切回收产物pBudCE4.1/GLS/OriM中,构建表达IL-35的穿梭/共表达质粒重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）,再以重组质粒电转化到BCG,构建表达IL-35和BCG的重组pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG。结果重组质粒pZM03（pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM）经PCR扩增、测序鉴定,以及在CHO 293T细胞中表达产物的Western blotting检测,从转录和翻译水平对目标基因产物进行检测验证,pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG在细胞水平经抗酸染色验证,证实基因IL-35正确插入载体pBudCE4.1/GLS/OriM中,且pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG构建成功。结论重组质粒pBudCE4.1/GLS/IL35/OriM-BCG可正确表达IL-35,为进一步研究IL-35功能及其应用价值奠定了良好的基础。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.