三种不同培养条件下兔关节软骨细胞增殖速率的差别

目的:观察兔关节软骨细胞在3种不同培养条件下增殖速率的差别。方法:实验于2004-10/2006-10在上海长海医院血管外科实验室完成。取4周龄新西兰雄性兔6只,利用机械与酶消化的方法获得均一性兔关节软骨细胞,在单层培养条件下增殖至第2代;将第2代细胞在高密度条件下转入藻酸盐凝胶24孔培养介质,进行三维培养。根据实验目的,将24孔培养板分为单层培养对照组,三维培养组(培养液不含胰岛素样生长因子Ⅰ),含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组(培养液含50μg/L胰岛素样生长因子Ⅰ),每日在倒置相差显微镜下观察软骨细胞的生长状态,进行细胞计数1周,绘制细胞生长曲线,比较3种不同培养条件下兔关节软骨细胞的增殖速率。结果:①单层培养细胞24h后开始贴壁生长,细胞形态呈多角形、星形、圆形,72h后,倒置显微镜下观察细胞增殖数目明显增多,细胞增殖呈片状;三维培养条件下的软骨细胞,刚接种至藻酸钠凝胶时,细胞形态为圆形;三维培养(含胰岛素样生长因子Ⅰ)体系中的软骨细胞从转入三维培养的第3天起,发现细胞出现分裂增殖,局部有细胞团族形成,第7天,凝胶中开始有大量的细胞团族形成。在培养过程中,三维培养软骨细胞形态始终保持圆形。②1周内,单层培养条件下的软骨细胞增殖速率要明显高于三维培养组;含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组的软骨细胞增殖速率明显高于不含胰岛素样生长因子Ⅰ三维培养组。结论:单层培养方法短期内(1周)对软骨细胞的增殖作用要优于三维培养方法;胰岛素样生长因子Ⅰ对三维培养条件下关节软骨细胞具有促进增殖的作用。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：实验于2002-07／2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子Ⅰ／GS质粒。将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后，抽提纯化质粒，并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞，通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后，检测各混合液的吸光度，以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果：①质粒鉴定结果：质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带，符合质粒的电泳图谱；质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达：质粒转染软骨细胞后，反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达；Western-blot可见7．6ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响：转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是（5．23&;#177;0．62）mg／L和（2．47&;#177;0．31）mg／L．两组比较，差异有显著性意义（t=2．88，P〈0．05）；转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为（9．92&;#177;1．04）mg／L和（4．56&;#177;0．51）mg／L，两组比较，差异有显著性意义（t=6．47，P〈0．05）。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达，并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖，具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

胰岛素样生长因子Ⅰ与转化生长因子β2对兔软骨细胞立体三维培养的作用

目的 检测胰岛素样生长因子Ⅰ （IGF-Ⅰ）、转化生长因子β2 （TGF-β2）单独及联合应用对立体培养软骨细胞增殖速度、细胞形态和表型、黏多糖含量及Ⅱ型胶原含量的影响.方法 取兔第二代软骨细胞于藻酸钙凝珠中,分别加入IGF-Ⅰ、TGF-β2及IGF-Ⅰ＋TGF F-β2进行立体培养.HE、甲苯胺蓝染色测软骨细胞形态、胞外基质变化;阿尔新蓝法测黏多糖;免疫组化法测Ⅱ型胶原及表型;Woessner法测Ⅱ型胶原含量.结果 细胞形态及表型的维持、增殖速度、黏多糖及Ⅱ型胶原含量,IGF-Ⅰ＋TGF-β2组明显优于其他组,各组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 IGF-Ⅰ与TGF-β2联合应用起协同作用,能够显著促进黏多糖及Ⅱ型胶原的分泌,促进软骨细胞外基质分泌及软骨细胞形态及表型的维持.     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对软骨细胞凋亡的抑制

目的：探讨胰岛紊样生长因子-Ⅰ(IGF-I)对软骨细胞增殖及白细胞介素-Ⅰ(IL-1)诱导软骨细胞凋亡的影响，揭示其抗损伤作用机制，为关节软骨损伤治疗提供理论依据。方法：分离培养人胚胎关节软骨细胞，采用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同含量软骨细胞增殖活性的变化，利用光镜、电镜、DNA电泳及流式细胞仪测定作为凋亡检测指标。结果：IGF-I呈剂量依赖式促软骨细胞增殖，当IGF-I含量达50μg／L时，促软骨细胞增殖作用达最大值。IL-1组光镜、电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变，琼脂糖凝胶电泳示特征性的DNA梯状条带，IGF-I处理组未见明显凋亡征象。流式细胞仪检测发现，IGF-I处理后软骨细胞凋亡率显著降低。结论：IGF-I能促进软骨细胞增殖，对IL-1诱导的软骨细胞凋亡具有保护作用。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达,并初步判断转基因细胞的生物学功能变化.方法实验于2002-07/2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成.①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子I/GS质粒,将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后,抽提纯化质粒,并对质粒进行测序鉴定.②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞,通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达.③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后,检测各混合液的吸光度,以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量.结果①质粒鉴定结果质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带,符合质粒的电泳图谱;质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合.②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达质粒转染软骨细胞后,反转录-聚合酶链反应能见到298 bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达;Western-blot可见7.6 ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带.③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是(5.23±0.62)mg/L和(2.47±0.31)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=2.88,P＜0.05);转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为(9.92±1.04)mg/L和(4.56±0.51)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=6.47,P＜0.05).结论胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达,并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖,具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力.转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据.     

藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞

目的观察胎儿关节软骨细胞在藻酸钙微载体培养中的特征,探讨用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞的优缺点。方法用藻酸钙微载体和体外单层培养法培养胎儿关节软骨细胞,观察细胞形态学变化,测定细胞数量变化及其生长曲线,观察细胞增殖;借助免疫组织化学的方法了解细胞II型胶原的合成情况。结果体外单层培养的胎儿关节软骨细胞传至第5代已出现明显的反分化,多数细胞变为成纤维细胞状,合成II型胶原的能力明显减弱;而用藻酸钙微载体培养的软骨细胞3个月后仍保持有旺盛的合成Ⅱ型胶原的能力。结论用藻酸钙微载体培养胎儿关节软骨细胞可较长时间保持其表型及合成基质能力,防止反分化的发生。     

类胰岛素样生长因子I在人鼻中隔软骨细胞体外培养中的作用

目的:为加速体外培养的人鼻中隔软骨细胞的增殖,观察类胰岛素样生长因子I(IGF-I)对体外培养软骨细胞的影响。方法:体外培养人鼻中隔软骨细胞,MTT法观察IGF-I对软骨细胞增殖的影响;流式细胞仪检测IGF-I对软骨细胞周期的影响;斑点杂交法了解IGF-I对软骨细胞II型胶原mRAN的影响。结果:IGF-I浓度大于5ng/ml即可促进体外培养软骨细胞的增殖,缩短软骨细胞增殖周期,有助于II型胶原mRNA的合成。结论:IGF-I促进人鼻中隔软骨细胞增殖与缩短细胞周期有关,并可能通过促进软骨细胞II型胶原mRNA的合成使软骨细胞保持表型稳定。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对软骨细胞凋亡的抑制

目的:探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对软骨细胞增殖及白细胞介素-1(IL-1)诱导软骨细胞凋亡的影响,揭示其抗损伤作用机制,为关节软骨损伤治疗提供理论依据。方法:分离培养人胚胎关节软骨细胞,采用四氮甲基唑蓝(MTT)法测定不同含量软骨细胞增殖活性的变化,利用光镜、电镜、DNA电泳及流式细胞仪测定作为凋亡检测指标。结果:IGF-Ⅰ呈剂量依赖式促软骨细胞增殖,当IGF-Ⅰ含量达50μg/L时,促软骨细胞增殖作用达最大值。IL-1组光镜、电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳示特征性的DNA梯状条带,IGF-Ⅰ处理组未见明显凋亡征象。流式细胞仪检测发现,IGF-Ⅰ处理后软骨细胞凋亡率显著降低。结论:IGF-Ⅰ能促进软骨细胞增殖,对IL-1诱导的软骨细胞凋亡具有保护作用。     

胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖条件下成骨细胞的影响

目的：观察胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ在高浓度葡萄糖条件下对成骨细胞增殖和矿化的影响，探讨胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对糖尿病性骨质疏松和骨质减少治疗的作用。方法：实验于2004—07／2005-09在第四军医大学唐都医院感染病中心完成。健康新生24h内的SD仔鼠3只。①采用组织块培养法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞，分别给以不同葡萄糖浓度的培养液，即正常浓度葡萄糖（5．5mmol／L）和高浓度葡萄糖（25．5mmol／L）。在高糖条件下分别加人胰岛素（10^-6mmol／L）和胰岛素样生长因子Ⅰ（10^-7mmol／L）。所有实验分为四组：正常浓度葡萄糖组，高浓度葡萄糖组，高浓度葡萄糖＋胰岛素样生长因子Ⅰ组，高浓度葡萄糖＋胰岛素组。②MTT法检测不同培养条件对成骨细胞增殖的影响。③原子能吸收法检测钙离子吸收量和体外诱导骨结节的形成来评价成骨细胞的分化。结果：①MTT比色法显示连续培养5d，不同组吸光度值均成比例增加，与正常浓度葡萄糖相比，高浓度葡萄糖显著促进细胞的增殖，细胞生长率显著高于其他组。胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ下调了高浓度葡萄糖导致的细胞增殖，除第1天以外，该两组细胞的生长率与正常浓度葡萄糖组的结果相似。②从第17天到第32天，各组的钙吸收量显著增加，但高糖组的钙吸收量明显低于其他组。胰岛素样生长因子Ⅰ组的钙吸收量高于胰岛素组，与正常浓度葡萄糖组的钙吸收量相比没有明显差别（P〉0．05）。在第32天，高糖组的骨结节数明显低于其他组，而且多数细胞仍处于增殖阶段，钙化的细胞很少。胰岛素样生长因子Ⅰ组的骨结节数多于胰岛素组（P〈0．05），少于正常葡萄糖组（P〉0．05）。结论：高浓度葡萄糖刺激成骨细胞增殖但抑制细胞矿化可能直接导致了糖尿病性骨病的病理改变；胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对其矿化的促进作用可能是治疗糖尿病性骨质减少和骨质疏松的机制之一。     

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的:软骨细胞在单层培养时,多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养,以保持其特有表型。方法:用酶消化法获取兔关节软骨细胞,分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养,并传代;或制成细胞/藻酸盐悬液,再进一步制成串珠,使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片,爱尔新蓝染色,采用倒置显微镜、透射电镜观察;以RT-PCR方法检测软骨细胞中II型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果:单层培养时有较高的细胞增殖率,5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围,特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得II型胶原和凝集聚糖的表达。结论:软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质,维持细胞特有表型的稳定。     

类胰岛素生长因子Ⅰ在人鼻中隔软骨细胞体外培养中的作用

目的：为加速体外培养的人鼻中隔软骨细胞的增殖，观察类胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）对体外培养软骨细胞的影响。方法：体外培养人鼻中隔软骨细胞，MTT法观察IGF-Ⅰ对软髓细胞增殖的影响；流式细胞仪检测IGF-Ⅰ对软骨细胞周期的影响；斑点杂交法了解IGF-Ⅰ对软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的影响。结果：IGF-Ⅰ浓度大于5ng/ml即可促进体外培养软骨细胞的增殖，缩短软骨细胞增殖周期，有助于Ⅱ型胶原mRNA的合成。结论：IGF-Ⅰ促进人鼻中隔软骨细胞增殖与缩短细胞周期有关，并可能通过促进软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA的合成使软骨细胞保持表型稳定。     

胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对高糖条件下成骨细胞的影响

目的观察胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ在高浓度葡萄糖条件下对成骨细胞增殖和矿化的影响,探讨胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对糖尿病性骨质疏松和骨质减少治疗的作用.方法实验于2004-07/2005-09在第四军医大学唐都医院感染病中心完成.健康新生24 h内的SD仔鼠3只.①采用组织块培养法分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,分别给以不同葡萄糖浓度的培养液,即正常浓度葡萄糖(5.5 mmol/L)和高浓度葡萄糖(25.5 mmol/L).在高糖条件下分别加入胰岛素(10-6 mmol/L)和胰岛素样生长因子Ⅰ(10-7 mmol/L).所有实验分为四组正常浓度葡萄糖组,高浓度葡萄糖组,高浓度葡萄糖+胰岛素样生长因子Ⅰ组,高浓度葡萄糖+胰岛素组.②MTT法检测不同培养条件对成骨细胞增殖的影响.③原子能吸收法检测钙离子吸收量和体外诱导骨结节的形成来评价成骨细胞的分化.结果①MTT比色法显示连续培养5 d,不同组吸光度值均成比例增加,与正常浓度葡萄糖相比,高浓度葡萄糖显著促进细胞的增殖,细胞生长率显著高于其他组.胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ下调了高浓度葡萄糖导致的细胞增殖,除第1天以外,该两组细胞的生长率与正常浓度葡萄糖组的结果相似.②从第17天到第32天,各组的钙吸收量显著增加,但高糖组的钙吸收量明显低于其他组.胰岛素样生长因子Ⅰ组的钙吸收量高于胰岛素组,与正常浓度葡萄糖组的钙吸收量相比没有明显差别(P＞0.05).在第32天,高糖组的骨结节数明显低于其他组,而且多数细胞仍处于增殖阶段,钙化的细胞很少.胰岛素样生长因子Ⅰ组的骨结节数多于胰岛素组(P＜0.05),少于正常葡萄糖组(P＞0.05).结论高浓度葡萄糖刺激成骨细胞增殖但抑制细胞矿化可能直接导致了糖尿病性骨病的病理改变;胰岛素和胰岛素样生长因子Ⅰ对其矿化的促进作用可能是治疗糖尿病性骨质减少和骨质疏松的机制之一.     

携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒体外转导培养关节软骨细胞

目的:胰岛素样生长因子Ⅰ通常被认为是软骨生长和稳定中最关键的生长因子之一,可以促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白多糖.应用携带人胰岛素样生长因子Ⅰ基因的重组腺病毒(Adenovirus-human insulin like growth factor-Ⅰ transgene construct,Ad-hIGF-Ⅰ)体外转导培养关节软骨细胞,探讨其在体外促进软骨细胞外基质成分生成的能力.方法:实验于2005-01/2007-04在大连医科大学附属四院骨科实验室完成.分离培养3周龄兔膝关节及股骨头软骨细胞,将受测细胞随机分为转导组与未转导组,以500感染复数的Ad-hlGF-I转导第1代软骨细胞,转导组中的第1,3,5,7代细胞分别为转导后48 h,3周,7周和9周的软骨细胞.采用样本碱水解法、阿利新蓝法和酶联免疫吸附方法检测转导组和未转导组的第1,3,5,7代细胞羟脯氨酸、糖胺多糖、胰岛素样生长因子I蛋白浓度.结果:①倒置显微镜观察,转导组兔关节软骨细胞生长增殖稳定,至第7代仍旧以三角形、梭形及纺锤形细胞为主,偶见长梭形和树根形细胞,且轮廓清晰,透亮度大,折光性强;而末转导组细胞培养至第4代时即己出现长梭形细胞,自第5代细胞形态几乎全部变成长梭形.②随着培养时间延长和传代次数增加,软骨细胞上清液中胰岛素样生长因子I蛋白、羟脯氨酸和糖胺多糖浓度的逐渐降低,转导组软骨细胞均高于同代未转导组细胞(P<0.05).结论:携带人胰岛素样生长因子I基因的重组腺病毒体外转导的关节软骨细胞,可以稳定产生内源性的胰岛素样生长因子I,并进而促进软骨细胞分泌Ⅱ型胶原和蛋白多糖.     

兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中培养维持其表型稳定的研究

目的：软骨细胞在单层培养时，多次传代后细胞表型发生改变。将兔关节软骨细胞在藻酸盐串珠中作立体培养，以保持其特有表型。方法：用酶消化法获取兔关节软骨细胞，分别在普通培养瓶中作贴壁的单层培养，并传代；或制成细胞/藻酸盐悬液，再进一步制成串珠，使细胞在具有三维立体结构的串珠中生长、繁殖。细胞涂片、石蜡切片，受尔新蓝染色，采用倒置微镜、透射电镜观察；以RT-PCR方法检测软骨细胞中Ⅱ型胶原及凝集聚糖mRNA的表达。结果：单层培养时有较高的细胞增殖率，5代以后渐失去软骨细胞特有的表型。立体培养时细胞分泌的基质大部分位于自身的周围，特有表型可长期保持稳定。3个月后藻酸盐串珠中的软骨细胞仍可测得Ⅱ型胶原和凝集聚糖的表达。结论：软骨细胞在藻酸盐串珠中培养有助于其合成、分泌基质，维持细胞特有表型的稳定。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验——人胰岛素样生长因子I基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的:探讨胰岛素样生长因子I基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达,并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法:实验于2002-07/2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子I/GS质粒,将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后,抽提纯化质粒,并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞,通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子I基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后,检测各混合液的吸光度,以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果:①质粒鉴定结果:质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带,符合质粒的电泳图谱;质粒的测序结果和胰岛素样生长因子I基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子I基因在软骨细胞中的表达:质粒转染软骨细胞后,反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ImRNA片断的表达;Western-blot可见7.6ku的胰岛素样生长因子I蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子I基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响:转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是(5.23±0.62)mg/L和(2.47±0.31)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=2.88,P<0.05);转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为(9.92±1.04)mg/L和(4.56±0.51)mg/L,两组比较,差异有显著性意义(t=6.47,P<0.05)。结论:胰岛素样生长因子I基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达,并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖,具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子I基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠纤维环细胞体外增殖活性影响的量效关系

背景：近年来体外椎间盘髓核和纤维环组织细胞培养技术的建立，特别是软骨组织工程研究的不断深入及自体椎间盘细胞移植修复髓核缺损动物实验的初步成功，为退变椎间盘的形态结构与生理功能的完全再生修复带来了希望。目的：通过对椎间盘纤维环细胞的培养，观察胰岛素样生长因子Ⅰ对大鼠纤维环细胞体外增殖活性的影响及量效和时效关系。设计、时间及地点：单一样本观察，于2006—09／2007-01在山西医科大学寄生虫实验室完成。材料：清洁级1月龄Wistar系大鼠30只，雌雄不限。方法：体外分离培养大鼠纤维环细胞。剂量一效应实验：在培养的细胞中分别加入由含体积分数为0．01或0．1的小牛血清HAMF-12配制成的不同浓度的胰岛素样生长因子Ⅰ（0．1，1．0，10，100μg／L）。以不加生长因子做对照，培养72h。时间效应实验：在培养的细胞中分别加入含有最佳效应浓度胰岛素样生长因子Ⅰ体积分数为0．1的小牛血清＋F12培养液，分组为对照组和100ug／L的胰岛素样生长因子Ⅰ组，分别培养1，3，5，7d。主要观察指标：①苏木精-伊红、甲苯胺蓝、免疫细胞化学染色分析细胞的生物学特性。②噻唑蓝比色法观察胰岛素样生长因子Ⅰ在体积分数为0．01和0．1的血清浓度下对大鼠纤维环细胞体外增殖的调节作用及其剂量、时间与作用效果的关系。结果：苏木精-伊红染色细胞多为梭形，有伪足伸出，细胞核为圆形或椭圆形；甲苯胺蓝染色，胞浆为深蓝色；免疫细胞学方法检测表明纤维环细胞有Ⅰ型胶原表达；在体积分数为0．1的血清条件下，胰岛素样生长因子Ⅰ能提高细胞的增殖活性，并且在有效浓度范围内呈剂量效应关系。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ能促进大鼠纤维环细胞的体外增殖，其效应在一定范围内与剂量和时间呈正相关。     

胰岛素样生长因子1促进创伤性关节炎软骨细胞的体外增殖

背景：早期受损的软骨细胞在体外培养时容易产生去分化,表型不稳,常需添加一定的生长因子。 目的：观察胰岛素样生长因子1对成年兔创伤性关节炎早期关节软骨细胞体外增殖的促进作用。 方法：采用改良Hulth法制备成兔创伤性关节炎模型,造模成功后无菌条件下片状切取股骨远端及胫骨近端,用消化培养法培养软骨细胞。将软骨细胞随机分为2组,对照组加入含体积分数10%胎牛血清因子的DMEM培养液培养;实验组在对照组的基础上加入100 μg/L的胰岛素样生长因子1。通过细胞形态学、细胞计数、细胞活性检测胰岛素样生长因子1对创伤性关节炎关节软骨细胞增殖的影响。 结果与结论：成功培养出早期创伤性关节炎兔软骨细胞,细胞多数为小细胞,形态有小梭形、小圆形及小多边形。苏木精-伊红染色显示实验组细胞数量多于对照组,MTT实验证实实验组细胞的吸光度值大于对照组 （P 〈 0.01）。结果提示,胰岛素样生长因子1能促进早期创伤性关节炎模型兔软骨细胞的体外增殖。     

胰岛素样生长因子Ⅰ抑制氧化型低密度脂蛋白诱导内皮细胞凋亡的体外试验

目的：胰岛素样生长因子Ⅰ作为重要的促细胞生长因子之一，其对内皮细胞凋亡影响的报道不多。实验拟验证和探讨胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的抑制作用及可能机制。 方法：实验于2006—12／2007—07在华中科技大学同济医学院协和医院心血管疾病研究所完成。①实验材料及分组处理：取人新鲜脐带（产妇或家属签署知情同意书）分离培养人脐静脉内皮细胞，分为：胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）＋胰岛素样生长因子Ⅰ组（1×10^-9mmol／L）、氧化型低密度脂蛋白（200mg／L）组、正常对照组。分别在细胞培养24h后加入。②实验评估：采用四甲基偶氮唑盐法测定细胞活力；DAPI细胞核荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化及细胞凋亡率的测定；并进行内皮细胞caspase-3活性的检测。 结果：①氧化型低密度脂蛋白可明显抑制人脐静脉内皮细胞增殖，胰岛素样生长因子Ⅰ与氧化型低密度脂蛋白共同加入后，细胞增殖率明显上升（P〈0．05）。②氧化型低密度脂蛋白可诱导人脐静脉内皮细胞发生凋亡，而加入胰岛素样生长因子I刺激后细胞凋亡率降低（P〈0．05）。③caspase-3活性检测表明与对照组相比，氧化型低密度脂蛋白能明显上调caspase-3的表达，而胰岛素样生长因子Ⅰ＋氧化型低密度脂蛋白组caspase-3活性则降低（P〈0．05）。 结论：胰岛素样生长因子Ⅰ对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡具有抑制作用，可能与其下调caspase-3蛋白表达有关。     

胰岛素样生长因子Ⅰ和胰岛素样生长因子结合蛋白-1与胎儿生长受限的关系

【目的】探讨胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )和胰岛素样生长因子结合蛋白 1(IGFBP 1)与胎儿生长受限 (FGR)的关系。【方法】采用免疫放射法测定 30例胎儿生长受限孕妇 (FGR组 )和 10 8例正常孕妇 (对照组 )的血清及新生儿脐血IGF Ⅰ、IGFBP 1水平 ,并对其结果进行相关性分析。【结果】①FGR孕妇血清及新生儿脐血IGF Ⅰ水平低于正常孕妇 (p <0 .0 5 )、IGFBP 1水平高于正常孕妇 (P <0 .0 5 )。②两组孕妇血清IGF Ⅰ、IGFBP 1水平明显高于新生儿脐血IGF Ⅰ、IGFBP 1水平 (P <0 .0 1)。③两组孕妇血清IGF Ⅰ水平与新生儿脐血IGF Ⅰ水平无关 (r =0 .2 6 2 ,P >0 .0 5 )。④两组孕妇血清及新生儿脐血IGF Ⅰ水平与IGFBP 1水平呈负相关 (r =- 0 .386 ,r =- 0 .32 7,P <0 .0 5 )。⑤新生儿脐血IGF Ⅰ水平与新生儿出生体重呈正相关 (r =0 .5 75 ,P <0 .0 1) ,新生儿脐血IGFBP 1水平与新生儿出生体重呈负相关 (r =- 0 .4 18,P <0 .0 5 )。【结论】①胎儿血循环中低水平的IGF Ⅰ及高水平的IGFBP 1可能是导致FGR的重要病因之一。②两组孕妇血清IGF Ⅰ与新生儿脐血IGF Ⅰ的分泌相对独立 ,IGF Ⅰ不能通过胎盘屏障     

生长激素和细胞因子对兔关节软骨细胞增殖和基质分泌的影响

目的：探索生长激素对体外培养的关节软骨细胞的影响及其与细胞因子的关系，为生长激素在软骨组织工程中的应用提供依据。 方法：实验于2003-11／2004-03在南京医科大学分子生物研究所完成。消化获取3个月龄新西兰兔关节软骨细胞，随机分为胰岛素样生长因子Ⅰ、转化生长因子β1、生长激素、生长激素＋胰岛素样生长因子Ⅰ、无因子对照组进行培养，每组16孔细胞。以噻唑蓝法检测各组细胞增殖率、阿新蓝染色法检测各组细胞聚胺多糖分泌量。 结果：①各处理组细胞增殖率均高于对照组（P〈0．05），生长激素和细胞因子均能促进软骨细胞增殖，其中胰岛素样生长因子Ⅰ＋生长激素组细胞增殖最显著，是对照组的2．17倍[噻唑蓝法检测不同组吸光度：无因子对照组为0．199&;#177;20．05，转化生长因子β1组为0．317&;#177;20．067，胰岛素样生长因子I组为0．384&;#177;0．084，生长激素组为0．252&;#177;20．056，生长激素＋胰岛素样生长因子Ⅰ组为0．433&;#177;20．080]。②各处理组培养上清聚胺多糖含量均高于对照组（P〈0．05），生长激素和细胞因子均能促进软骨细胞基质分泌．其中胰岛素样生长因子Ⅰ＋生长激素组聚胺多糖含量最高，是对照组的2．10倍[阿新兰染色法检测不同因子组上清聚胺多糖含量：无因子对照组为（49．69&;#177;1．37）mg／L，转化生长因子131组为（80．10&;#177;1．42）mg／L，胰岛素样生长因子Ⅰ组为（88．44&;#177;1．68）mg/L，生长激素组为（67．73&;#177;1．56）mg／L，生长激素＋胰岛素样生长因子Ⅰ组为（104．47&;#177;1．86）mg／L]。 结论：生长激素也有促进体外培养的关节软骨细胞增殖和基质合成作用，胰岛素样生长因子Ⅰ与生长激素联用有协同作用。