人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的:构建编码人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,在毕赤酵母(Pichiapastria)中进行表达,获得具有白介素-2(IL-2)活性的融合蛋白。方法:通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA,再通过重叠PCR方法,将编码人IL-2的cDNA和编码人白蛋白的cDNA拼接起来,克隆至T载体获得含有融合基因IH的质粒pMD19/IH。用EcoRI和NotI双酶切pMD19/IH和pPIC9K两种质粒,通过琼脂糖凝胶电泳分离,试剂盒纯化,将IH片段和pPIC9K连接获得表达型pPIH的重组质粒,利用电转化方法转化毕赤酵母KM71获得重组表达质粒pPIH;CTLL-2/MTT法测定融合蛋白中人IL-2活性。结果:成功构建了人白介素-2/人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH,融合蛋白得到了较理想的表达;重组菌经甲醇诱导表达后含有融合蛋白IL-2-HSA发酵上清液表现100U/mL的生物学活性。结论:成功获得具有人IL-2生物活性的重组人白介素-2/血清白蛋白融合蛋白,该研究结果未见文献报道。     

分泌人干扰素α-2a的重组卡介苗的构建、表达与鉴定

目的 构建分泌人干扰素α-2a（IFNα-2a）的重组卡介苗（rBCG）。方法 采用聚合酶链反应（PCR）技术从卡介苗基因组中扩增出Ag85B的信号肽基因序列,从pBIFNα-2a质粒中扩增出IFNα-2acDNA全长序列。利用DNA重组技术将以上两个片段插入质粒pMV261结核杆菌HSP60启动子下游,构建一个分泌型的卡介苗穿梭表达质粒pMSIFNα-2a。利用电穿孔技术将质粒pMSIFNα-2a转入卡介苗得到rBCG,分别用PCR扩增和Western印迹检测rBCG菌体和培养上清中IFNα-2a的DNA和蛋白表达,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测rBCG培养上清中IFNα-2a的含量。结果 酶切鉴定、PCR扩增和DNA测序分析结果均表明,所克隆的信号肽DNA片段和IFNα-2a片段与文献结果完全一致,pMSIFNα-2a的连接方向正确,阅读框与预期完全一致。以rBCG质粒DNA为模板,通过PCR扩增得到IFNα-2a的基因片段,Western印迹证实rBCG分泌的蛋白能与人IFNα-2a的抗体特异性结合,ELISA法检测到rBCG培养上清中高含量的IFNα-2a（324.57pg／ml）。结论 构建的rBCG能够分泌具有功能活性的细胞因子IFNα-2a,有望成为膀胱肿瘤免疫治疗的一种有效方法。     

肝癌标志物高尔基体蛋白73基因在杆菌中的表达

目的 克隆、表达和鉴定肝癌标志物高尔基体蛋白73 (GP73)基因序列(1028～1327 bp).方法 应用Biosun生物学软件分析GP73全序列,预测其抗原表位,将GP73蛋白基因克隆到表达载体PGEX-4T-2上,构建重组表达质粒PGEX-4T-2/GP73,转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃...     

钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂对心血管系统影响的研究进展

钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂是一类新型的抗高血糖药物,该药通过抑制肾小管上皮细胞SGLT2的功能以减少尿中葡萄糖的重吸收,从而达到降低血糖的目的。该药除了降血糖,还具有降低血压、体质量及尿酸水平,改善血脂异常等心血管危险因素的作用,对心血管系统有较好的保护作用,且不良反应小、安全可靠。该类药物在国外上市以来受到广泛关注,随着对药物研究的深入,其作用机制及不良反应也越来越明确,应用也将越来越广泛。     

血清CysC、β_2-微球蛋白与尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1联合检测在糖尿病肾病早期诊断中的应用价值

目的:探讨血清胱抑素C(CysC)、β_2-微球蛋白与尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1联合检测在糖尿病肾病早期诊断中的应用价值。方法:选取2016年6月—2018年6月本院收治的2型糖尿病患者276例,根据24h尿白蛋白排泄率分为糖尿病肾病组、非糖尿病肾病组,每组138例;另收集140例健康体检者为对照组。抽取受试者空腹外周静脉血,并指导留取晨起中段尿液和24h尿液,检测血清CysC、血清β_2-微球蛋白、尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1水平。结果:糖尿病肾病组、非糖尿病肾病组血清CysC、血清β_2-微球蛋白、尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 05);糖尿病肾病组血清CysC、血清β_2-微球蛋白、微量清蛋白、肾脏损伤因子-1水平明显高于非糖尿病肾病组,差异有统计学意义(P <0. 05)。联合检测的诊断敏感度、准确率、阴性预测值均明显高于血清CysC、血清β_2-微球蛋白、尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1单独检测,差异有统计学意义(P <0. 05)。糖尿病肾病组中不同糖尿病病程患者的血清CysC、血清β_2-微球蛋白、尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1之间比较,差异有统计学意义(P <0. 05);随着糖尿病病程的增加,糖尿病肾病患者血清CysC、血清β_2-微球蛋白、尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1水平逐渐增加。结论:血清CysC、β_2-微球蛋白与尿微量清蛋白、肾脏损伤因子-1联合检测具有较高的灵敏度和准确率,可用于早期糖尿病肾病的诊断。     

2-甲氧基雌二醇对骨髓瘤细胞作用机制的实验研究

目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对骨髓瘤细胞作用的机制.方法 对1例复发性和难治性骨髓瘤细胞进行分离、培养,予0、1、2、4、8和16 μmol/L的2-ME对骨髓瘤细胞处理48h（以0 μmol/L的2-ME作为对照组）.后采用酶联免疫法检测培养上清中的血管内皮细胞生长因子（VEGF）和IL-6的表达水平,同时采用免疫组化法检测c-myc和bcl-2蛋白阳性表达的骨髓瘤细胞.结果 随着2-ME浓度的增加,培养上清中VEGF和IL-6的表达水平均较对照组明显降低（均P〈0.01）,且骨髓瘤细胞中c-myc和bcl-2蛋白表达阳性率均较对照组明显降低（均P〈0.01）.结论 2-ME对难治性骨髓瘤患者骨髓瘤细胞具有抑制VEGF、IL-6分泌和C-myc、bcl-2蛋白表达水平的作用.     

细胞周期蛋白依赖性激酶-2两种剪接体在SH-SY5Y细胞中共表达

目的 观察细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK-2)在SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法 采用RT-PCR方法研究CDK-2的表达，用DNA银染技术观察PCR产物，割胶回收后，克隆到载体上、测序。结果 在聚丙烯酰胺胶上可以观察到两条DNA带，相对分子质量小的DNA带染色较弱；将两条DNA带切下，回收后与载体连接，测序证实两条DNA带均为CDK-2基因的产物。结论 CDK-2的两种剪接形式在SH-SY5Y细胞中共表达，其中一种剪接形式是第五外显子缺如，但其表达量比较弱，其作用机制仍有待于进一步研究。     

薄层色谱扫描法同时检测尿中总蛋白和清蛋白的含量

目的建立薄层色谱扫描法同时检测尿中总蛋白和清蛋白含量的方法。方法将被测样品点于醋酸纤维薄膜上,经电泳分离尿蛋白后,用1-羟基-2-(2-苯并噻唑偶氮)-8-氨基-3,6-萘二磺酸(HBAD)染色,用CS-930薄层扫描仪定量测定总蛋白及清蛋白的含量。结果在0·300~3·600g/L范围内呈线形关系,总蛋白Y=59294X 26209,相关系数r=0·9995,清蛋白Y=58617X 25439,相关系数r=0·9992,平均回收率分别为100·26%和99·90%,平均精密度分别为2·18%和2·69%。结论该方法灵敏度高、快捷、简便,线性范围宽,检出限低,可同时测定总蛋白和清蛋白。     

钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂治疗糖尿病肾病的研究新进展

糖尿病肾病(DN)是糖尿病常见的微血管并发症,也是导致终末期肾病(ESRD)的主要病因之一,尽管采用了肾素-血管紧张素系统抑制剂等多种药物治疗,但DN往往持续进展,患者有很大的风险进展至ESRD.钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂是一类新型的治疗2型糖尿病(T2DM)的靶点药物,通过抑制肾小管葡萄糖的重吸收,...     

人ARPC2基因的克隆与表达

目的 构建人His-ARPC2融合蛋白表达载体，并在原核细胞中进行表达与纯化．以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法 采用PCR方法从人肝cDNA文库扩增ARPC2基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pET-14b载体中。对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达，并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果 所构建的人ARPC2的His融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36000的融合蛋白。结论 成功构建了人His-ARPC2融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化，为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。     

α-OGG1与ACO2蛋白的表达纯化及其相互作用鉴定

[目的]原核表达纯化获得可溶性α-OGG1,ACO2蛋白并初步鉴定其相互作用.[方法]将α-OGG1,ACO2基因构建到pGEX-4T-2-TEV和pET-28a-TEV表达载体上,转化至BL21(DE3)大肠杆菌.IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni柱和GST柱亲和层析法纯化目标融合蛋白;采用SDS-PAGE检测表达产物;采用GST-Pulldown方法鉴定蛋白与蛋白的相互作用;采用双质粒共转化,表达纯化α-OGG1,ACO2蛋白复合体.[结果]成功克隆并构建了α-OGG1及其N-半段、C-半段基因和ACO2基因的原核表达载体,并转化至大肠杆菌表达.通过Ni柱和GST柱亲和层析法得到可溶性表达的6×His_α-OGG1(1-326)和GST_ACO2(29-780)蛋白,SDS-PAGE检测结果表明2个蛋白条带均与理论大小相符.GSTPulldown实验结果证实α-OGG1与ACO2直接相互作用.通过共转化、表达纯化得到了α-OGG1与ACO2的复合物.[结论]采用原核表达和亲和层析纯化得到了可溶性6×His_α-OGG1,GST_ACO2融合蛋白及两者的复合体,并初步证实α-OGG1与ACO2存在直接相互作用.     

共价连接β2m的HLA—A2／IgG1二聚体的构建、表达与纯化

目的 HLA-A2/IgG1二聚体经蛋白A(SPA)亲合层析柱浓缩纯化时容易发生β2m解离,为了解决这个问题,研究构建与表达β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白.方法 利用基因重组技术构建β2m-HLA-A2/IgG1融合基因真核表达载体pcDNA3-1(+)-[β2m-HLA-A2/IgG1],将其转染721.221细胞系,筛选高表达β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的细胞株;收集细胞培养上清,SPA亲合层析柱浓缩纯化,检测该蛋白的纯化效率.结果 β2m-HLA-A2/IgG1融合基因转染721.22I细胞后可表达正确构象的β2m-HLA-A2/IgG1二聚体,Western blot显示β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白的分子量与预期大小一致;经SPA亲合层析柱纯化后,β2m-HLA-A2/IgG1融合蛋白较HLA-A2/IgG1融合蛋白的纯化效率约高5倍.结论 共价连接β2m的HLA-A2二聚体有助于HLA-A2二聚体在低pH值的环境下保持构象完整.     

血管生成因子对心脏微血管内皮细胞分泌血管形成蛋白-2的影响

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)和血管形成蛋白-1(Ang-1)对人源性心脏微血管内皮细胞(HCMECs)分泌血管形成蛋白-2(Ang-2)的影响。方法在正常或缺氧缺血清培养条件下,分别将100 ng/ml VEGF或Ang-1加入HCMECs中,孵育24 h,采用酶联免疫吸附法检测Ang-2水平。结果在正常培养条件下,VEGF处理组Ang-2水平高于空白组(P<0.05),而Ang-1处理组Ang-2水平低于空白组(P<0.05);在缺氧缺血清培养条件下,Ang-2分泌量显著性增加,VEGF处理组Ang-2水平高于缺氧缺血组、Ang-1处理组、空白组(P<0.05)。结论缺氧缺血清和VEGF处理均提高HCMECs分泌Ang-2,Ang-1处理可以降低HCMECs分泌Ang-2。     

鼻咽癌细胞培养上清对正常人淋巴细胞钙调蛋白、白细胞介素-2、白细胞介素-2受体活性及T淋巴细胞增殖的影响

观察鼻咽癌低分化细胞株(CNE-2)培养上清(CNE-2S)对正常人外周血淋巴细胞(PBL)的作用,结果表明:CNE-2S可明显抑制正常人T淋巴细胞的增殖,白细胞介素-2(IL-2)的产生及钙调蛋白(CaM)的活性。但对IL-2受体活性无明显影响。提示CNE-2S有可能是通过抑制淋巴细胞内CaM的活性,使细胞代谢改变,而阻碍T淋巴细胞增殖。     

布洛芬高分子前体药物及纳米微球的合成和表征

将非甾体消炎药布洛芬以共价键连接到舍双键的甲基丙烯酸-2-羟基乙酯(HEMA)上，制成含布洛芬药物的单体，进而通过自聚或共聚，合成了含布洛芬的高分子药物；采用乳液聚合方法制备了高分子药物蚋米微球。研究了影响聚合反应的有关因素，并对所合成的产物用^1H-NMR，GPC和TEM等检测手段进行了表征。     

人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2的表达与纯化

 目的  构建人源吲哚胺2,3-双加氧酶-2 (human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表达载体,表达、纯化获得hIDO2蛋白。方法  采用基因工程手段获得hIDO2原核表达载体并转化表达菌株,筛选合适的重组质粒及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)浓度进行蛋白表达;通过亲和层析纯化重组hIDO2,BCA法测定蛋白浓度并计算蛋白收率;SDS-PAGE电泳检测hIDO2表达情况,通过软件分析得到蛋白纯度;Western blot检测目的蛋白特异性。结果  重组质粒经电泳分析、双酶切、DNA测序鉴定表明构建成功;经筛选发现重组质粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表达效果好;SDS-PAGE电泳及Western blot均验证了在相对分子质量45 000处的特异性目的条带的存在;经测定及计算得出蛋白纯度为97.1%,蛋白浓度为20 mg/mL,蛋白收率为15 mg/L。结论  成功构建重组质粒用于表达及纯化hIDO2,蛋白浓度、纯度、收率及特异性均较高。     

细胞周期蛋白依赖性激酶-2两种剪接体在SH-SY5Y细胞中共表达

目的观察细胞周期蛋白依赖性激酶-2(CDK-2)在SH-SY5Y细胞中的表达情况。方法采用RT-PCR方法研究CDK-2的表达,用DNA银染技术观察PCR产物,割胶回收后,克隆到载体上、测序。结果在聚丙烯酰胺胶上可以观察到两条DNA带,相对分子质量小的DNA带染色较弱;将两条DNA带切下,回收后与载体连接,测序证实两条DNA带均为CDK-2基因的产物。结论CDK-2的两种剪接形式在SH-SY5Y细胞中共表达,其中一种剪接形式是第五外显子缺如,但其表达量比较弱,其作用机制仍有待于进一步研究。     

wCTLA-4胞外段与HBc融合DNA疫苗的构建和真核表达

目的构建土拨鼠细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（wCTLA-4）细胞外部分和人乙型肝炎病毒核衣壳（HBe）融合蛋白表达质粒pwCTLA-4-HBe并在真核细胞中表达。方法通过限制性酶切和T14连接,以HBc基因片段置换pwCTLA-4-WHc质粒中的WHc片段,得到质粒pwCTLA-4-HBc,分别转染幼仓鼠肾细胞系（BHK）和人宫颈癌细胞系（Hela）,间接免疫荧光和化学发光免疫法检测融合蛋白的表达。结果融合蛋白编码质粒转染BHK细胞后可检测到HBc抗原免疫荧光,转染Hela细胞后细胞裂解液和培养上清中均可检测到融合蛋白。结论成功构建wCTLA-4胞外段和HBc融合蛋白表达质粒pwCTLA-4-HBe,融合蛋白可以在真核细胞表达并分泌到细胞外。     

丹参多酚酸对老年脑卒中患者血清半乳糖凝集素-3、超敏C反应蛋白水平的影响*

目的 观察注射用丹参多酚酸对大动脉粥样硬化型脑卒中患者半乳糖凝集素-3、超敏C反应蛋白 （hs-CRP）水平的影响及近期临床疗效。方法 根据TOAST病因分型选取2017年1～12月于保定市第一中心医院就诊的大动脉粥样硬化型脑卒中患者202例。随机分为两组,对照组以注射用血栓通及常规治疗方式治疗;实验组以注射用丹参多酚酸及常规治疗方式治疗;同期健康对照者200例（健康组）。检测大动脉粥样硬化型脑卒中患者入院时及健康对照者清半乳糖凝集素-3、hs-CRP水平;检测大动脉粥样硬化型脑卒中患者入院时与治疗14?d时血清半乳糖凝集素-3、hs-CRP水平和统计90?d的采用改良RANKIN量表（mRS）评分。结果 治疗后,实验组血清半乳糖凝集素-3、hs-CRP水平、mRS评分均较对照组降低（P?<0.05）。结论 注射用丹参多酚酸可降低LAA型脑卒中患者血清中半乳糖凝集素-3、hs-CRP水平,促进神经功能恢复。     

可溶性生长刺激表达基因2蛋白和半乳糖凝集素-3与急性肺血栓栓塞症预后的相关性

目的:探讨治疗前血清可溶性生长刺激表达基因2蛋白(soluble growth stimulating gene 2 protein,sST2)和半乳糖凝集素-3(Galectin-3)水平与急性肺血栓栓塞症(pulmonary thromboembolism,PTE)患者预后的相关性.方法:急性PTE患者90例,分为...