结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

人胸腺肽β4基因在大肠杆菌中的克隆、表达、纯化及促血管生成生物活性研究

目的：在大肠杆菌中克隆和表达人源胸腺肽（thymosinβ4,TB4）基因并进行分离纯化及促血管生成生物活性鉴定。方法：人工设计TB4基因片段,其密码子为大肠杆菌所偏爱,将合成的寡核苷酸片段经分子克隆拼接成TB4基因片段,与pET28a（＋）载体连接成重组表达质粒pET28a-TB4,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达带His6-Tag的融合蛋白His6-TB4,通过镍柱亲和层析纯化,采用SDS-PAGE分析鉴定,由CAM试验进行重组蛋白活性的生物活性鉴定。结果：经DNA序列分析鉴定,重组质粒pET28a-TB4构建成功,IPTG诱导后的融合蛋白His6-TB4在大肠杆菌中得到高效表达,并经一步镍柱亲和层析即获得纯化。CAM试验证明其有促进毛细血管生成的活性。结论：获得高效表达的、高纯度的His6-TB4融合蛋白,为TB4的进一步的功能分析和促血管生成生物活性研究奠定了基础。     

人类CD252基因片段在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫原性分析

目的优化表达含人类CD252胞外段的融合蛋白,纯化目的蛋白,为单克隆抗体的制备打下良好的基础。方法将测序正确的pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒转入表达菌株BL21感受态细菌中,用SDS－PAGE电泳鉴定重组菌的诱导表达情况,通过改变pET32a（＋）－CD252阳性菌株的诱导时间、温度,以优化出最佳表达条件。采用包涵体纯化法纯化目的蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BalB／C小鼠,采用ELISA法测定血清中抗体效价。结果成功获得表达pET32a（＋）－CD252的阳性菌株。转化有pET32a（＋）－CD252胞外段重组质粒的表达菌经IPTG诱导后,在蛋白分子量标准的31．0～42．7kD之间出现了新的蛋白条带,新的蛋白主要存在于包涵体中。优化表达条件分析表明,在诱导4h、温度37℃、IPTG浓度为1．0mmol／L时,融合蛋白的表达量最高。包涵体洗涤纯化后,经SDS-PAGE电泳证明可得到较纯的目的蛋白。免疫小鼠后测得的平均抗体效价为1：3200。结论pET32a（＋）-CD252胞外段原核表达载体能够表达CD252蛋白,并获取了目的蛋白的优化表达条件,表达蛋白具有良好的免疫原性。     

融合蛋白TAT-HIF-1α-PAS-B原核表达载体的构建、表达及纯化

目的 构建蛋白转导结构域TAT和人缺氧诱导因子1α PAS-B结构域融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 分别构建原核表达质粒pTAT-PAS-B、pET-PAS-B和pTAT-EGFP;在大肠杆菌BL21(DE3)pLyss内,以IPTG诱导融合蛋白的表达,表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定,利用镍-亚硝胺乙酸-组氨酸(NiNTA-His)亲和层析法对重组蛋白进行纯化.结果 成功构建了PAS-B结构域的原核表达载体,经过优化表达和纯化条件,融合蛋白在IPTG诱导下获得特异性表达,纯化得到了高纯度的目的蛋白.结论 含人缺氧诱导因子1αPAS-B和TAT结构域融合蛋白的成功表达及纯化,为应用该融合蛋白调控体内HIF-1α的活性奠定了基础.     

幽门螺杆菌hpaA基因工程菌蛋白表达条件优化、纯化及其活性鉴定

目的:优化幽门螺杆菌hpaA基因工程菌(pMAL-c2X-hpaA-TB1)的表达条件,并对其表达产物进行纯化和免疫活性鉴定.方法:通过诱导表达实验了解不同诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间对蛋白表达量的影响, 并应用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析;Amyloss树脂预装柱对可溶性HpaA蛋白进行分离、纯化;对纯化后蛋白做Western blot实验鉴定免疫活性.结果:该工程菌培养2 h时加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为0.3 mmol/L进行诱导4 h,目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的30%以上;经纯化得到了较高纯度(＞90%)的目的蛋白,并具有良好的免疫活性.结论:建立了从TB1(pMAL-c2X-hpaA)可溶性表达产物中纯化高纯度rHpaA融合蛋白的方法,为进一步的动物实验和诊断性抗原的研制以及工程菌发酵、高效表达生产工艺的研究打下了基础.     

Survivin基因融合蛋白的表达与纯化

目的： Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）中最强的凋亡抑制因子,纯化得到其功能结构域（BIR）的融合蛋白可为进一步研究Survivin基因与相关基因的相互作用提供依据。方法利用PCR技术扩增Survivin基因中的BIR序列后连接到pGEX4T-2载体上,经大肠杆菌（DH5α）验证后,转化BL21大肠杆菌菌株并用IPTG进行诱导,以谷胱甘肽琼脂糖亲和层析技术纯化融合蛋白。结果实验扩增得到的BIR片段约为276 bp,纯化得到的融合蛋白分子质量大小约为37 ku。结论 PCR结果与预期的片段大小一致,构建重组体后经IPTG在22℃下诱导2 h,菌体中融合蛋白的表达量显著增加,为下一步研究Survivin基因的功能和与其相互作用的蛋白奠定了基础。     

乳糖酶在大肠杆菌中的高效表达与纯化

目的克隆并分析乳酸菌LacZ基因,构建其原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导融合蛋白表达,并纯化得到纯度较高的目的蛋白。方法采用PCR方法从乳酸菌中扩增出LacZ基因,测序和序列分析。将其克隆至克隆载体pGM-Tvector中,筛选阳性克隆后回收目的片段,将其克隆入原核表达质粒pGEX-6p-1,构建其重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定,最后通过纯化得到单一的目的蛋白。结果 PCR扩增获得3024bp的LacZ基因,测序得知序列与GeneBank报道的序列一致,序列分析表明,该序列开放读码框有3024bp,推测肽链具有1008个氨基酸,蛋白分子量为114KDa,等电点为4.9。构建了重组表达质粒pGEX-6p-1/LacZ,IPTG诱导其高效表达出融合蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot分析鉴定出所表达蛋白的分子量为140KD,与融合蛋白的分子量一致。最后利用Glutathione Sepharose 4B对表达产物进行纯化,得到单一的目的蛋白。结论成功地构建了乳酸菌LacZ基因的原核表达质粒,通过序列分析并诱导表达,最后纯化得到单一的目的蛋白,为进一步生产低乳糖奶奠定基础。     

亲和层析纯化重组中性粒细胞激活蛋白

目的:直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化重组麦芽糖结合蛋白-中性粒细胞激活蛋白(recombinantmaltose-binding protein-neutrophil-activating protein,rMBP-NAP)。用于支气管哮喘模型小鼠进行免疫调节实验。方法:IPTG诱导基因工程菌E.coli TB1(pMAL-c2X-nap)表达rMBP-NAP,离心收获细胞,过柱缓冲液重悬菌体并超声破碎,再次离心取上清和沉淀,SDS-PAGE分析rMBP-NAP可溶性;直链淀粉树脂亲和层析法分离纯化rMBP-NAP;SDS-PAGE凝胶扫描分析纯化后rMBP-NAP纯度;蛋白定量试剂盒测定rMBP-NAP浓度。结果:IPTG诱导工程菌表达的rMBP-NAP主要以可溶性形式存在于超声上清中,相对分子质量约为57 kD,与预期结果一致;亲和层析法纯化rMBP-NAP纯度可达96.5%,浓度可达0.625 g/L。结论:用直链淀粉树脂亲和层析法,可纯化得到高纯度、高浓度的融合蛋白rMBP-NAP。     

GST-SRY融合蛋白原核表达和纯化

目的 构建GST-SRY融合蛋白原核表达载体, 在E.coli中诱导其表达, 并进行纯化.方法 PCR扩增SRY基因, 将SRY基因插入原核表达载体p GEX-6P-1, 经酶切和测序验证后, p GEX-6p-1-SRY转化到原核表达菌株E.coli Rosetta DE3, IPTG诱导表达GST-SRY融合蛋白, 用GST标签纯化树脂对其进行纯化.结果 经双酶切和测序证实p GEX-6P-1-SRY构建正确.重组质粒转化到Rosetta DE3经IPTG诱导后表达了分子质量单位约为49 KD的重组蛋白.结论 p GEX-6P-1-SRY原核表达载体构建成功, SRY蛋白成功诱导表达并纯化, 为今后深入研究SRY蛋白的功能奠定了实验基础.     

剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达

目的:本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法:用PCR法扩增SRp55基因,将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。在大肠杆菌BL21(DE3)中通过IPTG进行诱导表达,然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠,亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果:SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大肠杆菌BL21(DE3)表达,随诱导时间的增加蛋白表达量增高,4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白,经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55,并获得GST-SRp55融合蛋白,为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

结核分枝杆菌重组融合蛋白 TB10.4-Hsp16.3诊断结核病

目的：重组表达结核分枝杆菌融合蛋白 TB10.4-Hsp16.3,分析其诊断结核病的价值。方法：重组 PCR扩增 TB10.4-Hsp16.3融合基因,克隆至 pMD18-T 载体,测序鉴定后,亚克隆至原核表达载体 pET28a（+）,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,将重组 DNA 转化 E.coli BL21,筛选阳性菌株,经 IPTG 诱导表达融合蛋白 TB10.4-Hsp16.3,超声裂解菌体,对包涵体进行变性溶解和复性,金属螯合层析纯化,Western blot 分析其免疫学活性,ELISA 评价其诊断结核病的价值。结果：成功获得约750bp 的融合基因 TB10.4-Hsp16.3,构建了融合蛋白的重组表达质粒 pET-TB10.4-Hsp16.3,表达、纯化获得分子量约29kDa 的融合蛋白,能被结核病患者血清特异识别;其 ELISA 诊断结核病的灵敏度为89.3％,特异度为90.7％,阳性预测值为90.9％,阴性预测值为89.1％,诊断效率达90.0％。结论：成功表达可用于结核病诊断的结核分枝杆菌融合蛋白 TB10.4-Hsp16.3。     

重组结核分枝杆菌CFP10的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌CFP10,并分析其免疫学活性。方法:自结核分枝杆菌标准株H37Rv提取基因组DNA,PCR扩增cfp10基因,克隆至T载体pMD18T,转化入大肠杆菌JM109,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的pMD18-cfp10的cfp10基因亚克隆至表达载体PQE30,构建重组质粒PQE30-cfp10,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,PCR和双酶切鉴定阳性重组体,IPTG诱导CFP10表达,亲和层析纯化,western-blot分析其免疫活性。结果:成功构建PQE30-cfp10重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约10kDa的CFP10,并能被结核病人血清识别。结论:克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌CFP10。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

幽门螺杆菌融合蛋白HspA-UreB在pMAL-C2x中的表达与免疫学活性研究

目的:在pMAL-C2x中表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)融合蛋白HspA-UreB,探索其免疫学活性,为Hp基因工程疫苗的研究奠定基础。方法:从重组质粒pNHA27和pNUB27中纯化回收hspA和ureB基因片段,并以hspA-ureB的顺序连接后插入原核表达载体pMAL-C2x中,表达麦芽糖结合蛋白(MBP)与HspA-UreB的融合蛋白。采用亲和层析法纯化融合蛋白MBP-HspA-UreB,并辅以弗氏佐剂皮下免疫小鼠,蛋白印迹法对免疫小鼠血清进行检测。结果:特异PCR法和酶切鉴定证实融合基因hspA-ureB克隆入表达载体,并以融合蛋白形式MBP-HspA-UreB高效表达,相对分子量为119 000,约占细胞总蛋白的31%。通过大肠杆菌抗原吸收法纯化免疫小鼠血清后,与纯化的融合蛋白进行杂交,结果显示在119 000处出现特异杂交带。结论:融合蛋白HspA-UreB具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

结核分枝杆菌蛋白Rv0315的克隆表达及其抗原性研究

目的评价结核分枝杆菌重组蛋白Rv0315在结核病血清学诊断中的价值。方法采用常规分子克隆方法获得重组Rv0315蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测84份确诊结核病人血清和48份健康人血清中相应的抗结核抗体水平,并与结核分泌蛋白ESAT-6的检测结果进行比较。结果成功构建了重组蛋白Rv0315,其在E.coli BL21plysS（DE3）中主要以可溶性形式表达,分子量（30.3kDa）与预期相符,ELISA血清学活性评估显示其特异性和敏感性分别为94.0%（45/48）和35.7%（30/84）。结论重组蛋白Rv0315有望成为新的结核病血清学诊断候选抗原。     

人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

目的 在大肠杆菌中对人era基因（简称hera)进行表达、纯化。方法 PCR扩增hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C,重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌,用IPTG进行诱导表达。然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化。结果 克隆了hera基因,测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因,表达量占细菌总蛋白的59．6％。融合蛋白在菌体内主要以包涵体形成存在,在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白,其纯度达到了98．0％。结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因。并对融合蛋白进行了初步纯化。     

高可溶性Aβ融合蛋白的表达、纯化和鉴定

目的在大肠杆菌中表达阿尔茨海默病(AD)相关肽段Aβ与具有强助溶作用的麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白,从而经济有效地获得具有天然免疫原性的Aβ肽段,为深入研究AD的发病机理和治疗药物提供重要的物质基础。方法用PCR法扩增Aβ的基因片段,并将其插入到含有麦芽糖结合蛋白的融合表达载体pMAL-c2中,经测序后再将重组质粒转化入大肠杆菌TB1中进行诱导表达。经多聚麦芽糖亲和色谱的纯化获得MBP-Aβ融合蛋白。再用SDS-PAGE及Western blotting鉴定Aβ及其融合蛋白的表达和免疫原性。结果测序结果证实插入的DNA片段与Aβ序列一致。SDS-PAGE电泳显示Aβ融合蛋白被高效表达。Western blotting结果表明Aβ及其融合蛋白可被其特异性抗体识别。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性的Aβ融合蛋白并经纯化和酶解后获得了Aβ纯肽段,为AD病机理的研究及其病理模型的建立提供了物质基础。     

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的:对小鼠ERA蛋白(mERA)进行表达、纯化,为真核生物ERA功能研究奠定基础.方法:构建MBP-mERA融合表达载体.在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白,经直链淀粉亲和层析纯化,Western Blotting鉴定所表达纯化的蛋白.结果:表达的MBP-mERA融合蛋白占菌体总蛋白的18 %;纯化后的融合蛋白纯度为70 %;Western Blotting证实了mERA蛋白的表达.结论:利用基因重组技术,在大肠杆菌中高表达了mera基因,并对融合蛋白进行了初步纯化.